李夢雪，王升厚，柳葉飛，王澤，趙洪新，趙曉云，徐方旭*

（1.沈陽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽 110034；2.沈陽師范大學(xué)實驗教學(xué)中心，遼寧 沈陽 110034；3.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 杭州 310018；4.沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）隸屬于子囊菌亞門的肉座菌目、麥角菌科、蟲草屬，又名北蟲草、北冬蟲夏草，與冬蟲夏草（Cordyceps sineisis）為同屬異種[1-3]，是蟲草屬的模式種之一[4]，研究表明其營養(yǎng)成分豐富，不僅具有食用價值，同時具有保健價值和藥用價值[5-7]。功能性蛹蟲草是以成分指標(biāo)作為蛹蟲草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的評價體系，因此在人工栽培功能性蛹蟲草的過程中與普通蛹蟲草的區(qū)別主要在于有目的地改變培養(yǎng)基的配方，添加一些獨特的營養(yǎng)元素和營養(yǎng)物質(zhì)等，以提高所得到的蛹蟲草的蟲草素、腺苷、噴司他丁、蟲草酸、蟲草多糖等多種活性成分[8-9]。使其不僅具有普通蛹蟲草的延緩衰老、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、降血糖血脂、保護神經(jīng)、肝臟等多種生物功效[10-12]，還有很高的抗菌、抗病毒以及抗輻射等多種作用。目前的技術(shù)水平完全可以工廠化人工培養(yǎng)功能性蛹蟲草[13-16]。

然而，功能性蛹蟲草在培養(yǎng)基中所添加的獨特的營養(yǎng)元素和營養(yǎng)物質(zhì)等是否能引起其子實體的成分發(fā)生改變，從而使其品質(zhì)優(yōu)于普通小麥蛹蟲草，尚無理論依據(jù)。由于代謝組學(xué)能研究生物體內(nèi)源性代謝物質(zhì)的種類、數(shù)量及其在內(nèi)外因素影響下的變化規(guī)律，進而從整體上探討生命活動在代謝物層面發(fā)生的特征和規(guī)律，是目前發(fā)現(xiàn)潛在活性成分的最佳方法之一[17-21]。因此，本試驗采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）對功能性蛹蟲草[22-24]和普通小麥蛹蟲草的代謝組學(xué)進行分析，對二者的化學(xué)成分特征進行全面比較，以期從整體代謝物層面分析二者的相似性和差異性。為功能性蛹蟲草相比于普通小麥蛹蟲草的成分優(yōu)勢提供理論依據(jù)，為功能性蛹蟲草的深入開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

功能性蛹蟲草（檢測號：PA）（試驗組：小麥500g+清水650 g+鮮蛹漿30 g+黃豆粉10 g+硒元素46 mg/kg）、普通小麥蛹蟲草（檢測號：PB）（對照組：小麥500 g+清水650 g）：沈陽師范大學(xué)特種菌業(yè)研究所栽培，蛹蟲草菌種均為YT-7。

甲醇、乙腈、甲酸（色譜級）：德國CNW科技公司；L-2-氯苯丙氨酸（≥98%）：上海恒柏生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Nexera UHPLC LC-30A超高效液相色譜儀：日本島津公司；Triple TOF 5600高分辨質(zhì)譜儀：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；Heraeus Fresco17離心機：賽默飛世爾科技有限公司；JXFSTPRP-24研磨儀：上海凈信科技有限公司；PS-60AL超聲儀：深圳市雷德邦電子有限公司；AcQ2uity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）：美國沃特世科技有限公司；5424R冷凍離心機：德國艾本德股份公司。

1.3 方法

1.3.1 代謝物質(zhì)提取

稱取100 mg功能性蛹蟲草粉末（55℃烘干2 h，磨粉，過 100目銅篩），加入 1 000 μL提取液（甲醇∶水=4∶1，體積比），渦旋 30 s冰水浴 50 Hz超聲處理 1 h，-20℃靜置1 h后將樣本置于冷凍離心機中4℃條件下12 000 r/min離心15 min，取出上清液過0.22 μm濾膜，置于進樣瓶中待上機檢測。對照組處理同上。

1.3.2 上機檢測

超高效液相色譜流動相條件見表1。

表1 超高效液相色譜流動相條件Table 1 Mobile phase condition of UPLC

根據(jù)表1中的超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）流動相參數(shù)進行分析，流動相A∶水（0.1%甲酸）、流動相B∶乙腈（0.1%甲酸），進樣體積為5 μL。質(zhì)譜儀在Analyst TF 1.7，AB Sciex軟件控制下基于交互式反匯編器專業(yè)版（interactive dis assembler professional，IDA）功能進行一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。在每個數(shù)據(jù)采集循環(huán)中，篩選出強度最強且大于100的分子離子進行采集對應(yīng)的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)。測試條件為轟擊能量40 eV，碰撞能差20 V，每50 ms 15張二級譜圖。ESI離子源參數(shù)設(shè)置為霧化氣壓55 psi（1 psi=6 895 Pa），輔助氣壓55 psi，氣簾氣壓35 psi，溫度550℃，噴霧電壓5 500 V（正離子模式）或-4 000 V（負離子模式）[25-26]。

1.3.3 檢測分析

對總離子流色譜、主成分、正交偏最小二乘法-判別及其置換檢驗進行分析，篩選顯著差異代謝物，做顯著差異代謝物的聚類分析，尋找其代謝通路。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Progenesis Q2I軟件將質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入，進行保留時間矯正、峰識別、峰提取、峰積分、峰對齊等工作，同時查詢復(fù)方中相應(yīng)中藥代謝庫（委托方：上海阿趣生物科技有限公司），利用委托方自建的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫及相應(yīng)裂解規(guī)律匹配法對含有串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的峰進行物質(zhì)鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 總離子流色譜分析

總離子流色譜見圖1。

圖1 總離子流色譜圖Fig.1 Total ions chromatogram

由圖1可知，樣品色譜峰保留時間和信號強度重疊較好，說明儀器穩(wěn)定性很好，在整個試驗過程中儀器誤差引起的變異較小，可以排除一部分系統(tǒng)誤差。

2.2 主成分分析結(jié)果

主成分分析（principal component analysis，PCA）得分圖結(jié)果見圖2。

圖2 PCA得分圖Fig.2 PCA score plots

由圖2可知，樣本全部處于95%置信區(qū)間內(nèi)，功能性蛹蟲草和普通小麥蛹蟲草的數(shù)據(jù)點在PCA得分散點圖中被顯著區(qū)分。理論上講，樣品都是相同的，但是在物質(zhì)提取、檢測分析過程中會有誤差，導(dǎo)致重復(fù)樣品間會有差異。這個差異越小說明整個方法穩(wěn)定性越好數(shù)據(jù)質(zhì)量越高。由圖2可知，功能性蛹蟲草和普通小麥蛹蟲草的6次生物學(xué)重復(fù)數(shù)據(jù)集中性很強，證明數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性和可信度較強。

2.3 正交偏最小二乘法-判別分析結(jié)果

正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis，OPLS-DA）結(jié)果見圖3。

圖3 OPLS-DA得分圖Fig.3 OPLS-DA score plots

通過OPLS-DA分析，可以排除代謝物中與分類變量不相關(guān)的正交變量，并對非正交變量和正交變量分別分析，從而獲取更加可靠的代謝物的組間差異與試驗組的相關(guān)程度信息。如圖3所示，普通蛹蟲草樣本代謝物主要分布在右側(cè)，功能小麥蛹蟲草樣本代謝物主要分布在置信區(qū)的左側(cè)，兩種樣本區(qū)分明顯，OPLS-DA模型能夠進一步佐證PCA模型的結(jié)果，增強結(jié)果的真實性。

2.4 OPLS-DA置換檢驗結(jié)果

OPLS-DA置換檢驗結(jié)果見圖4。

圖4 OPLS-DA置換檢驗結(jié)果圖Fig.4 OPLS-DA replacement test results

由圖4可知，原模型R2Y非常接近1，說明建立的模型符合樣本數(shù)據(jù)的真實情況；原模型Q非常接近1，說明如果有新樣本加入模型，會得到近似的分布情況，總體來看原模型可以很好地解釋兩組樣本之間的差異。置換檢驗隨機模型的Q值均小于原模型的Q值；Q的回歸線與縱軸的截距小于零；同時隨著置換保留度逐漸降低，置換的Y變量比例增大，隨機模型的Q逐漸下降。說明原模型具有良好的穩(wěn)定性，不存在過擬合現(xiàn)象。

2.5 顯著差異代謝物的篩選

顯著差異代謝物的篩選結(jié)果見表2。

表2 差異代謝物篩選Table 2 Differential metabolites screening

采用多維分析和單維分析相結(jié)合的方法對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析。根據(jù)OPLS-DA生成的變量投影重要度（variable importance in the projection，VIP）值來篩選組間差異代謝物。篩選條件為P＜0.05、VIP≥1。VIP值越大，說明差異代謝物對樣品間的分類判別的影響強度和解釋能力越強。如表2所示，功能性蛹蟲草顯著差異代謝物共有8個。分別是腺苷、α-亞麻烯基乙醇酰胺、L-組氨酸、（-） 核黃素、9-氧代-10E，12Z十八碳二烯酸、9，10-二羥基-12Z-十八烯酸和 1，2-苯二甲酸二（2-甲基丙基）酯、1-十六烷基-2-錫-甘油-3-磷酸。除1-十六烷基-2-錫-甘油-3-磷酸分類未知以外，其它7種顯著差異代謝物分別屬于嘌呤核苷類、有機含氮化合物、羧酸和衍生物、蝶啶和衍生物、脂肪酰、苯和取代衍生物。

2.6 顯著差異代謝物的聚類分析

選用R（v3.3.2）對數(shù)據(jù)進行縮放，得到聚類熱圖對33種差異代謝物在兩種蛹蟲草樣本中的分布狀況進行分析，結(jié)果見圖5。

圖5 顯著差異代謝物的熱圖分析Fig.5 Heat map analysis of differential metabolites

通過以上分析得到的差異代謝物，在生物學(xué)上往往具有結(jié)果和功能相似性/互補性，或者受同一代謝通路的正調(diào)控/負調(diào)控，表現(xiàn)為在不同試驗組間具有相似或相反的表達特征。對這類特征進行層次聚類分析，有助于將具有相同特征的代謝物歸為一類，并發(fā)現(xiàn)代謝物在試驗組間的變化特征。由圖5可知，功能性蛹蟲草和普通小麥蛹蟲草對比的差異代謝物，其代謝物的相對表達量不同。

2.7 顯著差異代謝物的代謝通路

蛹蟲草的部分差異代謝途徑分析見表3。

表3 部分差異代謝產(chǎn)物途徑Table 3 Partial differential metabolite pathways

差異代謝物途徑分析以KEGG數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，有助于了解代謝物所涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝途徑，進而探索相關(guān)代謝物和基因[27-28]。然而部分差異代謝物代謝途徑在KEGG數(shù)據(jù)庫中無法找到，因此，表3為部分差異代謝產(chǎn)物途徑。在功能性蛹蟲草和普通小麥蛹蟲草中獲得的16種差異代謝物參與了多種途徑，如組氨酸代謝、精氨酸生物合成、酪氨酸代謝、乙醛酸與二羧酸代謝、苯丙酸生物合成、丙酮酸代謝、己內(nèi)酰胺降解、異喹啉生物堿生物合成、二甲苯降解、甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝等。

3 討論

本論文選用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）和多元統(tǒng)計分析法，分析對比同一菌種在同一環(huán)境條件下，僅在培養(yǎng)基中添加了特殊的元素和營養(yǎng)物質(zhì)的功能性蛹蟲草和普通小麥蛹蟲草的差異代謝產(chǎn)物，希望為功能性蛹蟲草的開發(fā)和利用提供有力的參考[29]。為了提高普通蛹蟲草作為保健食品的品質(zhì)而研發(fā)的功能性蛹蟲草，影響其品質(zhì)的化學(xué)成分和含量是人們關(guān)注的重點，也是開發(fā)功能性蛹蟲草的意義所在[30-31]。本試驗采用的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可以普遍應(yīng)用于藥物的成分分析、代謝產(chǎn)物分析研究等，從代謝差異物的種類、數(shù)量等方面對試驗對象進行對比，發(fā)現(xiàn)二者存在明顯的代謝差異。這些差異代謝物產(chǎn)生的原因很可能是由于功能性蛹蟲草在栽培過程中所添加的特殊的元素和營養(yǎng)物質(zhì)，這也是本試驗探究的目的所在。對于保健食品而言，成分決定功能，蛹蟲草要想發(fā)揮保健價值，依賴于其子實體內(nèi)含有的發(fā)揮作用的物質(zhì)。本研究是在代謝產(chǎn)物的層面初步對功能性蛹蟲草和普通小麥蛹蟲草的成分進行比對，發(fā)現(xiàn)其含有豐富的特殊性代謝產(chǎn)物。然而，這些成分和代謝物的差異是否會直接導(dǎo)致蟲草間保健價值的不同，目前還沒有直接證據(jù)。但其中一些功效成分的如腺苷、核黃素、組氨酸等，其含量的增加應(yīng)當(dāng)對蛹蟲草的品質(zhì)有所提升。由于試驗材料的差異僅在于培養(yǎng)基中添加的鮮蛹漿、黃豆粉和硒元素，那么兩者的差異代謝物來源就很可能是這些特殊添加物導(dǎo)致的。其中鮮蛹漿可以為功能性蛹蟲草提供普通小麥草所不具備的動物蛋白，富含脂肪酸、α-亞麻酸、氨基酸等；黃豆粉作為優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，富含蛋白質(zhì)、脂肪及核黃素等；硒元素是動物體內(nèi)必需而人體內(nèi)無法合成的營養(yǎng)元素，它的添加對于增加蛹蟲草的保健功能具有重要意義。可見，功能性蛹蟲草所具有的差異代謝物有一部分確實是添加物所富含的，而這些也是普通小麥蛹蟲草培養(yǎng)基中所不具備的。

4 結(jié)論

在經(jīng)過檢測分析后發(fā)現(xiàn)功能性蛹蟲草較普通小麥蛹蟲草而言有69種差異代謝物，其中顯著差異代謝物有8種，部分代謝產(chǎn)物參與的途徑對于維持人體健康有著重要意義，充分體現(xiàn)出功能性蛹蟲草對于普通小麥蛹蟲草而言的成分優(yōu)越性。此外，兩種蛹蟲草的差異是否源于在栽培過程中添加的特殊物質(zhì)，還需進一步研究。本試驗的結(jié)果為功能性蛹蟲草的進一步研究與開發(fā)提供了方向和有力的支持。