趙晰，張笑恬，李蔓，王耀光

（1．天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300193；2．天津市北辰區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，天津 300400）

腎間質(zhì)纖維化（RIF）是各種慢性腎臟疾病進展為終末期腎功能衰竭共同的病變過程。RIF是一個緩慢的動態(tài)變化過程，涉及到各種細胞因子的釋放、炎癥細胞的浸潤、腎小管上皮細胞-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化（EMT）、腎小管上皮細胞的凋亡、細胞外基質(zhì)（ECM）的過度沉積及降解失衡等因素[1-2]。EMT是RIF的關鍵致病機制，雖然目前大量研究已證實EMT是一個復雜有序且有機統(tǒng)一的細胞生物學過程，但目前關于EMT形成的關鍵機制仍未完全闡明[3]。研究證實結締組織生長因子（CTGF）能在腎臟纖維化中起著非常重要的作用，纖連蛋白（FN）對腎臟的作用包括參與RIF的進程，維持ECM的形態(tài)穩(wěn)定，介導細胞增殖、分化與黏附、移動，因而CTGF、FN可作為治療RIF的靶點[4-6]。EMT是有序漸進的過程，首先上皮細胞緊密連接被破壞、細胞結構微絲蛋白重構，繼而上皮表型標志緊密連接蛋白（ZO-1）表達減少，間充質(zhì)表型標志波形蛋白（Vimentin）表達增加，Vimentin表達增高、上皮完整性破壞，是EMT過程的早期事件，因此檢測Vimentin可以了解EMT 的進程[7-8]。

扶腎方是在探究經(jīng)典著作與總結臨床經(jīng)驗的基礎上，歷經(jīng)十余年發(fā)展衍化而成的具有確切療效的中藥復方，本課題前期研究顯示，扶腎方可降低腹膜透析患者證候積分、改善腹膜透析效能，保護殘腎功能[9-10]?；诖耍狙芯恐荚谔接懛瞿I方對單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）大鼠腎組織CTGF、FN、Vimentin表達的影響，闡明扶腎方延緩腎間質(zhì)纖維化的機制，為中醫(yī)藥臨床防治腎纖維化提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物與分組 50只SPF級雄性健康SD大鼠，體質(zhì)量200～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2014-0004。飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所，實驗期間自由飲水、攝食，室內(nèi)溫度控制在20～24℃，通風，濕度良好，每周換2次墊料。大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，按照隨機原則將大鼠分為假手術組（12只）與造模組（38只），造模組在手術后7 d隨機選取大鼠2只以驗證造模是否成功，余造模組大鼠隨機分為模型組（12只）、中藥低、高劑量組（各12只）。

1.1.2 主要試劑 CTGF抗體購于Proteintech公司，兔多克隆抗體FN（FN Rabbit Polyclonal antibody）和Vimentin抗體購自Abcam公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒（BCA Protein Assay Kit）購自博士德公司。

1.1.3 實驗藥物 扶腎方（組成為：黃芪15 g，當歸10 g，仙靈脾 15 g，陳皮 15 g，半夏 15 g，丹參 30 g，熟大黃10 g，鬼箭羽30 g）中藥材購自天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，并委托其藥物研究院進行煎煮、濃縮至5．04 g生藥/mL藥液，無菌裝瓶密封，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 UUO模型的建立及給藥方法 用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，在腹部正中偏左依次切開剝離左腎和輸尿管，用4-0縫合線結扎輸尿管2道（近腎盂段及遠端），假手術組僅游離輸尿管，后用3-0縫合線按順序縫合腹壁組織關閉腹腔。造模1周后所有大鼠均按照每只每日2 mL進行灌胃，中藥高劑量組、低劑量組分別灌服高濃度（5．04 g/mL，相當于70 kg體質(zhì)量成人單位劑量的4倍）藥物、低濃度（2．52 g/mL）藥物，假手術組與模型組灌服生理鹽水。

1.2.2 標本采集 術后7 d隨機抽取2只造模大鼠；術后14、28 d每組隨機抽取6只大鼠。頸椎脫臼處死大鼠，取出左腎，其中一部分置于4%多聚甲醛中以供光鏡標本制作，一部分置于戊二醛電鏡固定液中以供電鏡標本制作。另一部分剪碎后放入凍存管中，置于-80℃冰箱中速凍，用于蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測。

1.2.3 腎組織病理學變化的觀察 取出固定的腎組織，按常規(guī)方法制作石蠟包埋，組織切片，分別進行蘇木精-伊紅（HE）染色和馬松（Masson）染色。取另一固定的腎組織脫水30 min，環(huán)氧樹脂包埋，切片后予雙重染色，進行電鏡觀察。

1.2.4 Western Blot實驗 制備勻漿離心后，取上清按照蛋白濃度檢測試劑盒的說明操作。用已獲的各組蛋白質(zhì)按照常規(guī)操作方法進行電泳、轉(zhuǎn)膜、分別加入用一抗稀釋液稀釋后的一抗[甘油醛-3-磷酸脫氫酶 （GAPDH）1∶2 000、CTGF 1∶125、FN 1∶10 000、Vimentin 1∶1 000]，搖床搖動 30 min，4 ℃孵育過夜，洗滌緩沖液，再加入用二抗稀釋液稀釋后的二抗（1∶20 000）孵育 1 h，并洗滌緩沖液，后用增強型化學發(fā)光試劑（ECL）顯色。應用Image J軟件測定每一個目的條帶及相應內(nèi)參（用GAPDH作為內(nèi)參照）的灰度值（目的蛋白的相對表達量=目的條帶灰度值/內(nèi)參灰度值）。

1.3 統(tǒng)計學方法 得出的數(shù)據(jù)資料均利用SPSS 24．0統(tǒng)計分析軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，各組數(shù)據(jù)比較前先進行正態(tài)性及方差齊性檢驗。多組間差異比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較時若方差齊時采用LSD檢驗，方差不齊時采用Dunnett’s T3檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 光鏡（HE染色） HE染色細胞核呈藍色；細胞漿、基底膜、膠原纖維及肌纖維呈紅色。假手術組：腎小球大小形態(tài)完整，染色均勻；腎小管結構正常、清晰，未見腎小管擴張、萎縮，腎小管間呈“背靠背”狀，小管間隙無增寬；腎間質(zhì)正常，未見明顯炎癥細胞浸潤，無纖維化改變。模型組：術后7 d，部分腎小管擴張，管腔內(nèi)散在蛋白管型、炎癥細胞、變性和脫落的上皮細胞；腎間質(zhì)水腫，有炎癥細胞呈灶性浸潤。術后14 d，腎小球結構基本正常；腎皮質(zhì)變薄，皮髓質(zhì)不清；腎小管明顯擴張，部分腎小管出現(xiàn)萎縮、壞死、消失，蛋白管型較前增多；腎間質(zhì)水腫加重，以遠端腎小管病變較為明顯，間質(zhì)增寬，可見大量炎癥細胞浸潤，細胞增殖明顯，纖維細胞和膠原纖維明顯增多，腎間質(zhì)纖維化。術后28 d，腎小球大小、形態(tài)未見明顯異常，數(shù)量減少；腎皮質(zhì)較前顯著變??；腎小管萎縮、壞死、消失明顯；間質(zhì)內(nèi)炎細胞浸潤，腎間質(zhì)纖維化程度進一步加重。中藥低、高劑量組，腎組織病變較模型組減輕。見圖1。

圖1 光鏡下HE染色各組腎組織病理學變化（×400）Fig.1 Histopathological changes of each group with HE staining under light microscope(×400)

2.2 光鏡（Masson染色） 基底膜、細胞外基質(zhì)、膠原呈綠色或藍色；腎內(nèi)的一些特殊蛋白物質(zhì)包括抗原抗體復合物呈紅色。模型組：模型組可見到大量的藍色膠原纖維，沿腎間質(zhì)區(qū)域相互交織呈網(wǎng)狀分布，并且隨著梗阻時間的延長，藍色膠原纖維呈現(xiàn)明顯增多的趨勢。中藥低、高劑量組：術后14、28 d腎組織間質(zhì)內(nèi)藍染膠原面積較模型組減少，膠原沉積均有不同程度的減輕。見圖2。

圖2 光鏡下Masson染色各組腎組織病理學變化（×400）Fig.2 Histopathological changes of each group with Masson staining under light microscope(×400)

2.3 電鏡 模型組：術后14 d相鄰腎小管間隙明顯增寬，基底膜厚薄不均，局部斷裂；管腔直徑擴大，腎小管上皮細胞絨毛稀疏、大部分脫落；上皮細胞胞漿內(nèi)線粒體數(shù)量減少，大部分線粒體腫脹，線粒體嵴消失；細胞間隙增寬，間質(zhì)水腫，巨噬細胞數(shù)量增多。與術后14 d相比，術后28 d腎小管上皮細胞絨毛基本脫落，殘存少量絨毛；上皮細胞溶解壞死、胞漿內(nèi)細胞器基本消失、殘存少量腫脹的線粒體。

中藥低劑量組：術后14 d相鄰腎小管間隙明顯增寬，基底膜厚薄不均；腎小管上皮細胞絨毛基本脫落，殘存少量絨毛；腎小管上皮細胞溶解壞死、胞漿內(nèi)細胞器基本消失、殘存少量腫脹的線粒體；細胞間隙增寬，間質(zhì)水腫，巨噬細胞數(shù)量與正常組相比稍增多。術后28 d相鄰腎小管間隙增寬，基底膜未見明顯病變；有的腎小管上皮細胞絨毛脫落，殘存少量絨毛，有的腎小管上皮細胞絨毛排列整齊、完整，但密度減少，稀疏；腎小管上皮細胞萎縮，間隙增寬，胞漿內(nèi)線粒體比正常組減少，部分線粒體腫脹，胞漿內(nèi)可見空泡。

中藥高劑量組：術后14 d相鄰腎小管間隙增寬明顯，基底膜部分消失；有的腎小管萎縮明顯，絨毛完全脫落，有的腎小管上皮變的極不規(guī)則；腎小管上皮細胞胞漿內(nèi)線粒體數(shù)量減少，線粒體腫脹，線粒體嵴腫脹、稀疏；間質(zhì)水腫明顯，巨噬細胞數(shù)量明顯增多。術后28 d相鄰腎小管間隙增增寬明顯，基底膜不規(guī)則，部分消失；有的腎小管萎縮明顯，絨毛完全脫落，有的腎小管上皮變的極不規(guī)則；腎小管上皮細胞胞漿內(nèi)線粒體數(shù)量減少，線粒體腫脹，線粒體嵴腫脹、稀疏，可見大量空泡。見圖3。

圖3 電鏡各組腎組織病理學變化（EM×6 000）Fig.3 Histopathological changes of kidney in each group under electron microscope(EM×6 000)

2.4 CTGF蛋白的表達 術后14 d，與假手術組相比，模型組、中藥低劑量組、高劑量組值升高（P＜0．05）；與模型組相比，中藥低劑量組值降低（P＜0．05），差異均具有統(tǒng)計學意義。術后28 d，與假手術組相比，模型組、中藥低劑量組、高劑量組值升高（P＜0．05），差異具有統(tǒng)計學意義。與模型組相比，中藥低劑量組、高劑量組值降低（P＜0．05）；與中藥低劑量組相比，高劑量組值降低（P＜0．05），差異均具有統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 各組CTGF蛋白的表達（±s）Tab.1 Expression of CTGF proteins in each group（±s）

表1 各組CTGF蛋白的表達（±s）Tab.1 Expression of CTGF proteins in each group（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05；與中藥低劑量組比較，△P＜0．05。

組別 動物數(shù) 14 d CTGF 28 d CTGF假手術組 6 0．130±0．060 0．110±0．020模型組 6 0．760±0．290* 1．190±0．080*中藥低劑量組 6 0．460±0．120*# 0．930±0．090*#中藥高劑量組 6 0．570±0．060* 0．310±0．070*#△

2.5 FN的表達 術后14 d，與假手術組相比，模型組、中藥低劑量組、高劑量組值升高（P＜0．05），差異具有統(tǒng)計學意義。術后28 d，與假手術組相比，模型組、中藥低劑量組、高劑量組值升高（P＜0．05）；與模型組相比，中藥高劑量組值降低（P＜0．05），差異均具有統(tǒng)計學意義。與中藥低劑量組相比，中藥高劑量組值降低（P＜0．05），差異具有統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 各組FN蛋白的表達（±s）Tab.2 Expression of FN proteins in each group（±s）

表2 各組FN蛋白的表達（±s）Tab.2 Expression of FN proteins in each group（±s）

注：與假手術組比較，*P<0．05；與模型組比較，#P＜0．05；與中藥低劑量組比較，△P＜0．05。

組別 動物數(shù) 14 d FN 28 d FN假手術組 6 - -模型組 6 0．850±0．160* 1．460±0．120*中藥低劑量組 6 0．740±0．130* 1．360±0．140*中藥高劑量組 6 0．660±0．080* 0．670±0．100*#△

2.6 Vimentin的表達 術后14 d，與假手術組相比，模型組、中藥低劑量組、高劑量組值升高（P＜0．05）；與模型組相比，中藥低劑量組、高劑量組值降低（P＜0．05），差異均具有統(tǒng)計學意義。術后 28 d，與假手術組相比，模型組、中藥低劑量組、高劑量組值升高（P＜0．05）；與中藥低劑量組相比，高劑量組值降低（P＜0．05），差異均具有統(tǒng)計學意義。見表3、圖4、圖5。

表3 各組Vimentin蛋白的表達（±s）Tab.3 Expression of Vimentin proteins in each group（±s）

表3 各組Vimentin蛋白的表達（±s）Tab.3 Expression of Vimentin proteins in each group（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05；與中藥低劑量組比較，△P＜0．05。

組別 動物數(shù) 14 d Vimentin 28 d Vimentin假手術組 6 0．150±0．120 0．090±0．130模型組 6 1．070±0．120* 0．920±0．170*中藥低劑量組 6 0．400±0．130*# 0．950±0．180*中藥高劑量組 6 0．530±0．110*# 0．630±0．130*△

圖4 14 d時各組目的蛋白表達水平Fig.4 Target protein expression levels of each group on day 14

圖5 28 d時各組目的蛋白表達水平Fig.5 The protein expression levels of each group on day 28

3 討論

RIF是腎臟疾病最重要的病理特點之一，研究證實RIF的程度與腎功能的相關性比腎小球硬化與腎功能的相關性更為密切，是反映腎功能下降嚴重程度和判斷預后的最重要的可靠指標，所以對腎間質(zhì)纖維化發(fā)病機制及治療的研究是目前多數(shù)學者共同關注的問題[11-13]。UUO模型是研究RIF、EMT和評價治療效果最常用的動物模型[14]。

EMT是腎間質(zhì)纖維化進展的核心過程，研究證據(jù)表明，轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）被認為EMT的重要調(diào)節(jié)劑，它通過激活下游Smad信號通路而增加各種促纖維因子的表達，誘導EMT發(fā)生[15]。EMT發(fā)生時表達上調(diào)的蛋白質(zhì)包括α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、Vimentin、纖維粘連蛋白（Fibronectin）、膠原蛋白Ⅰ型（Collagen Ⅰ）、膠原蛋白Ⅳ型（Collagen Ⅳ）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9等，表達下降蛋白包括E-鈣黏蛋白（E-cadherin）等[16]。

研究證實CTGF能刺激EMT發(fā)生，刺激FN、膠原、層粘連蛋白、整合素等ECM成分合成，在腎臟纖維化中起著非常重要的作用[17-18]。本實驗結果顯示，14 d時，扶腎方低劑量組可以下調(diào)CTGF蛋白的表達量；28 d時扶腎方低、高劑量組均可以下調(diào)CTGF蛋白的表達量，且高劑量組效果更好。

FN是一種具有較強細胞黏附活性的高分子糖蛋白，是ECM的主要成分，當細胞、組織受損發(fā)生應激反應或炎癥時，腎臟組織、細胞FN的表達量明顯增加而形成積聚，它也隨著IV膠原蛋白及其他ECM繼續(xù)分泌、增殖而積聚，始終參與RIF的進程[19-20]。實驗結果顯示，28 d時，扶腎方高劑量組可以下調(diào)FN的表達量。

Vimentin是一種重要的細胞骨架蛋白，在28 d高劑量組下調(diào)更為顯著，提示扶腎方可以通過影響Vimentin的表達而治療腎間質(zhì)纖維化，且效果與劑量呈正相關。

腎間質(zhì)纖維化是西醫(yī)病理名詞，其總的病機為本虛標實，本虛為腎及相關臟腑的氣血陰陽虧虛，標實為外邪、濕濁、濕熱、水飲、瘀血、濁毒等。扶腎方中黃芪、當歸、仙靈脾補益脾腎、益氣養(yǎng)血，為君藥，體現(xiàn)為“補”；陳皮、半夏和中降濁，為臣藥，體現(xiàn)為“和”；熟大黃、丹參、鬼箭羽活血化瘀、瀉濁解毒，為佐使藥，體現(xiàn)為“消”，諸藥合用，既能補脾腎等臟之不足，又能清除體內(nèi)的濕濁、瘀血等病邪，標本兼治。本研究發(fā)現(xiàn)，扶腎方干預后，大鼠腎臟腎纖維化病理損傷明顯減輕，且中藥低劑量組和中藥高劑量組CTGF、FN、Vimentin明顯下調(diào)。

綜上所述，扶腎方治療腎間質(zhì)纖維化可能與CTGF、Vimentin、FN的表達有關。其機制可能為抑制上皮細胞轉(zhuǎn)分化及細胞外基質(zhì)沉積。本研究為臨床上扶腎方延緩腎間質(zhì)纖維化的進程提供新的可靠的實驗依據(jù)。