楊 楠，陳天翔，劉潤坤，牛永申，劉志奎

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一種常見的消化道惡性腫瘤之一，其死亡率高居惡性腫瘤第3位[1]。但因其起病隱匿，早期多無明顯臨床癥狀，大部分病人在初次診斷時已為晚期，失去了手術機會。近年來，盡管在手術治療、放化療以及靶向治療等方面取得很大進展，但由于其高侵襲性、轉(zhuǎn)移、復發(fā)等因素，HCC病人預后仍相對較差[2-3]。因此，探究肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制，確定有效的作用靶點或預后標志物成為目前HCC研究的重要方向。長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA,LncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的不編碼蛋白質(zhì)的RNA[4]。LncRNA可以通過調(diào)控腫瘤細胞的增殖、遷移、凋亡、血管生成等方面參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[5-6]。LINC00319是腫瘤相關lncRNA的一種[7-8]。LINC00319通過分子海綿吸附miR-335-5p上調(diào)ADCY3從而促進胃癌細胞的腫瘤生長和遠處轉(zhuǎn)移[9]，通過調(diào)控miR-32的表達促進肺癌的增殖和侵襲[10]，通過調(diào)控miR-3127-5p/RPP25軸促進宮頸癌細胞遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)[11]。但是，LINC00319在肝癌中的表達水平及其臨床意義仍不清楚。因此，本研究旨在探討LINC00319在肝細胞癌組織中的表達及臨床意義，及其對肝癌細胞侵襲遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床標本 收集并篩選2013年在我院肝膽外科手術治療后經(jīng)病理證實的HCC病人。所有入組病人均簽署知情同意書。病人術前均未接受放療、化療等其他輔助治療。癌旁組織為距腫瘤邊緣<2 cm的肝組織，所有組織為術后獲得的新鮮標本組織，組織獲得后立即轉(zhuǎn)移至液氮。

1.2 主要耗材及試劑 人肝癌細胞株和正常永生化肝細胞株(L02)細胞購自中國科學院上海生命研究所。DMEM細胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自Hyclone公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；E-cahderin、N-cadherin、Vimentin和GAPDH購自Cell signaling technology公司；脂質(zhì)體(Lipofectamine 2000)購自Invitrogen 公司；LINC00319 siRNA 及對照siRNA購自上海吉凱公司；Transwell小室購自Millipore公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術研究所，ECL化學發(fā)光試劑盒購自Milipore公司。

1.3 qRT-PCR檢測LINC00319的表達水平 參照按TRIZOL說明書提取總RNA。紫外分光光度計檢測提取RNA的濃度及純度。采用Takara公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。qRT-PCR以GAPDH為內(nèi)參對照，采用2-ΔΔCt法分析定量 PCR的結果。

1.4 Western blotting檢測EMT相關蛋白的表達 按照RIPA(強)試劑盒說明書提取相應細胞內(nèi)的蛋白，經(jīng)BCA蛋白定量后。用SDS-PAGE制10%分離膠后，每組樣品加20 μg，經(jīng)濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀將蛋白移至PVDF膜上。50 g/L脫脂牛奶封閉2 h，加PBS稀釋的一抗(1∶1 000)，把抗體孵育盒放入4 ℃冰箱孵育最少12 h；TBST洗膜3次，分別加HRP標記的抗兔或抗小鼠二抗(1∶10 000)，室溫孵育2 h；TBST洗膜3次，在用超敏發(fā)光試劑盒顯影并進行半定量分析。

1.5 Transwell侵襲和遷移實驗 取轉(zhuǎn)染48 h后的HCC細胞，重懸細胞調(diào)整細胞數(shù)為1×106個/毫升。50 mg/L Matrigel膠1∶8稀釋液包被Transwell小室(孔徑8 μm)底部(侵襲實驗鋪膠、遷移實驗未鋪膠)。取各組細胞懸液200 μL加入Transwell小室，向24孔板下室加650 μL 10% FBS的完全培養(yǎng)基。每組重復3個樣本。常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出小室，用PBS沖洗小室，4%多聚甲醛固定，PBS沖洗，1 g/L結晶紫染色，用棉棒擦去小室內(nèi)層細胞，在倒置顯微鏡下觀察移至微孔膜下層的細胞數(shù)，每個樣本隨機選取8個200倍視野求細胞計數(shù)平均數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用t檢驗、單因素方差分析和q檢驗、χ2檢驗和Kaplan-Meier曲線。

2 結果

2.1 LINC00319在肝癌組織中的表達 肝癌組織中的LINC00319在肝癌組織中的表達(0.57±0.02)明顯高于癌旁組織(0.27±0.01)(t=15.02，P<0.01)。

2.2 LINC00319的表達與HCC病人臨床病理特征的關系 將LINC00319按中位數(shù)分為LINC高表達組(n=49)和低表達組(n=48)。結果顯示LINC00319高表達與TNM分期(Ⅲ+Ⅳ)和血管侵犯均相關(P<0.01和P<0.05)(見表1)。

表1 LINC00319的表達與肝癌臨床病理特征關系[n；構成比(%)]

2.3 LINC00319的表達與病人總體生存率的關系 隨訪發(fā)現(xiàn)，LINC00319高表達病人的5年生存率(20.41%)明顯低于LINC00319低表達組病人(52.08%)(χ2=11.59，P<0.01)(見圖1)。

2.4 LINC00319在肝癌細胞系中的表達 LINC00319在肝癌細胞系中的表達均高于L02正常肝細胞系(P<0.05～P<0.01)，且在MHCC-97H和HCCLM3細胞系中表達最高(P<0.01)(見表2)?；谝陨辖Y果，選擇MHCC-97H和HCCLM3細胞系為后續(xù)敲低實驗研究對象，研究LINC00319對肝癌細胞系生物學功能的影響。

表2 LINC00319在不同肝癌細胞系中的表達水平

2.5 利用小干擾RNA(siRNA)沉默LINC00319在肝癌細胞中的表達 將si-Control、siRNA#1、siRNA#2分別轉(zhuǎn)染MHCC-97H和HCCLM3細胞系干擾LINC00319的表達48 h后，用qRT-PCR檢測干擾效率。結果顯示，與si-Control對照組相比，siRNA#1、siRNA#2均能抑制MHCC-97H和HCCLM3細胞中LINC00319的相對表達量(P<0.01)(見表3)。提示該兩條siRNA可用于后續(xù)實驗對LINC00319的敲低。

表3 各組細胞中LINC00319表達水平

2.6 敲低LINC00319表達對肝癌細胞遷移能力和侵襲能力的影響 利用未鋪膠的Transwell實驗證實，敲低LINC00319能抑制MHCC-97H 和HCCLM3 細胞的遷移能力和侵襲能力(P<0.01)(見表4)。

表4 siRNA干擾LINC00319表達水平后細胞遷移及侵襲能力

2.7 LINC00319調(diào)控肝癌細胞EMT改變 敲低LINC00319能夠促進上皮表型標志物E-cadherin的表達(P<0.01)，而抑制間質(zhì)表型標志物N-cadherin和Vimentin的表達(P<0.01)(見表5)。說明LINC00319能夠調(diào)控肝癌細胞EMT的發(fā)生。

表5 siRNA干擾LINC00319表達水平后EMT相關蛋白的表達量

3 討論

肝癌細胞侵襲和遠處轉(zhuǎn)移能力強是HCC病人預后差的重要因素。因此研究HCC細胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子網(wǎng)絡機制對尋找新的治療靶點降低HCC轉(zhuǎn)移有重要意義。LncRNA因本身缺乏開放閱讀框架無明顯蛋白質(zhì)編碼功能[12]。近年來，越來越多研究證實lncRNA能夠在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要角色[13]。LINC00319作為新的lncRNA，在鼻咽癌、膀胱癌、膠質(zhì)瘤等中均異常高表達[14-19]。本研究證實LINC00319在肝癌組織中異常高表達，且高表達LINC00319與腫瘤TNM分期、血管侵犯的不良臨床病理特征相關。通過隨訪，發(fā)現(xiàn)LINC00319高表達病人的5年生存率明顯低于低表達者，提示LINC00319的高表達與HCC病人不良預后相關。說明LINC00319在HCC發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

在細胞學水平上，本研究發(fā)現(xiàn)LINC003319在肝癌細胞系中的表達明顯高于正常肝細胞系。在體外實驗中我們選擇LINC00319相對高表達細胞系MHCC-97H和HCCLM3細胞作為研究模型，利用siRNA特異性下調(diào)LINC00319的表達。發(fā)現(xiàn)LINC00319的下調(diào)能夠顯著抑制MHCC-97H和HCCLM3細胞的侵襲和遷移能力。另外，EMT是細胞形態(tài)學上從上皮表型轉(zhuǎn)化為間質(zhì)表型的過程，伴隨著細胞極性消失，運動能力增強、黏附能力減弱等現(xiàn)象，是腫瘤轉(zhuǎn)移的關鍵步驟[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，LINC00319下調(diào)后HCC細胞上皮分子標志物E-cadherin表達上調(diào)，而間質(zhì)表型標志物N-cadherin和Vimentin表達下調(diào)。這說明LINC00319能夠調(diào)控HCC細胞EMT的發(fā)生，這與YANG等[11]在宮頸癌中研究一致。以上結果表明，在HCC中LINC00319可能通過調(diào)控EMT發(fā)生促進肝癌侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上，本研究證實LINC00319在HCC中異常高表達，并且與HCC的不良臨床病理特征及預后密切相關?？赡芡ㄟ^調(diào)控EMT發(fā)生促進肝癌侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)揮致癌基因的作用。這表明，LINC00319可能成為肝癌診斷的生物標志物和防治靶點。