鄭祖萍,夏先如,周發(fā)友,唐曉磊

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，居我國泌尿生殖系腫瘤發(fā)病率的第一位。其發(fā)病率隨年齡增長而增加，且男性膀胱癌發(fā)病率為女性的3～4倍[1]。而研究膀胱癌腫瘤浸潤和轉移的機制可能有助于確定膀胱癌治療的潛在分子靶點。

腫瘤微環(huán)境是影響腫瘤進展和轉移的主要因素。巨噬細胞是免疫相關基質細胞中重要的細胞之一，且系溝通天然免疫和適應性免疫的樞紐，在臨床和實驗研究中已經證實巨噬細胞能夠促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[2-3]。因此，腫瘤微環(huán)境中的巨噬細胞可以作為治療干預的潛在靶標。

外泌體是腫瘤細胞與巨噬細胞之間相互作用的重要介導者[4]。外泌體是由多種類型細胞產生的微泡，其源自吞多泡體與質膜的融合。當它們釋放到細胞外環(huán)境中時，外泌體可以與受體細胞結合并轉移細胞細胞表面的分子。研究已經報道了多種生物分子，如脂質、蛋白質和核酸(包括mRNA、microRNA和DNA等)都存在于外泌體中，并且能夠調節(jié)受體細胞的生物活性[5]。

腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導因子(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis,TWEAK)是TNF超家族成員之一[6]。它是一種多功能細胞因子，能夠與其同源受體成纖維細胞生長因子誘導早期反應蛋白14(fibroblast growth factor induces early reactive protein 14,Fn-14)結合，并影響許多類型癌細胞的生物學性質[6]。這表明TWEAK在調節(jié)免疫應答中起著重要作用，并且可能調控腫瘤浸潤巨噬細胞的抗腫瘤效應[6-7]。

為探討TWEAK在膀胱癌中的生物學功能，在本研究中，我們利用ATCC 5637膀胱癌細胞系檢測源自腫瘤相關組織巨噬細胞(TMs)的外泌體對其發(fā)揮調節(jié)作用?，F(xiàn)作報道。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 人膀胱癌細胞系ATCC 5637和單核細胞系THP-1購自于武漢大學細胞典藏中心(武漢，中國)。細胞在含有10% 胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)(Gibco公司，澳大利亞)和青霉素/鏈霉素(1∶100，Sigma公司，美國)的RPMI-1640培養(yǎng)基(Cyclone，GE Healthcare，美國)中進行培養(yǎng)，細胞置于5%CO2、37 ℃潮濕溫箱中。為了誘導分化成巨噬細胞，用100 ng/mL佛波酯(Phobo ester,PMA)(Sigma公司)處理THP-1細胞(4×105)，并孵育24 h。分化后，用PBS洗滌細胞3次。

1.2 外泌體純化、表征和分析 使用總外泌體分離試劑(Invitrogen公司，美國)從細胞培養(yǎng)基中提取外泌體。THP-1細胞在不含胎牛血清的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。24 h后收集細胞培養(yǎng)基，10 000 g離心30 min除去細胞碎片。將總外泌體分離試劑加入到無細胞培養(yǎng)基中，然后在4 ℃條件下孵育16 h。4 ℃條件下10 000 g離心1 h收集外泌體，然后用500 μL PBS重懸，并用Bicinchoninic Acid Assay蛋白測定法(賽默飛公司,美國)進行定量。同時使用透射電子顯微鏡(Tecnai G2 Spirit,賽默飛公司，美國)捕獲外泌體圖像；使用馬爾文激光粒度儀(M-ZNano ZS,馬爾文公司，英國)來測定外泌體的粒徑和分布。

1.3 外泌體標記和追蹤 使用PKH67綠色熒光細胞標記試劑盒(Sigma公司)標記來自TWEAK刺激的巨噬細胞的上清液中分離的外泌體。標記的外泌體與ATCC 5637細胞共培養(yǎng)24 h，隨后洗脫。使用Leica TCS SP5 Ⅱ激光掃描共焦顯微鏡來觀察受體ATCC 5637細胞對標記的外泌體的攝取。

1.4 miRNA微陣列測定 使用miRNA標記試劑和雜交試劑盒(Agilent Technologies公司，美國)及人miRNA微陣列試劑盒(Agilent公司，美國)對未刺激或TWEAK刺激的TMs源性的外泌體進行微陣列檢測。每個樣本100 ng總RNA先進行磷酸化處理，然后用Cyanine 3-pCp標記。使用Micro Bio-spin柱(Bio-Rad)純化標記的RNA，隨后在58 ℃下與人miRNA微陣列載玻片雜交20 h。后使用洗滌緩沖液洗滌，并使用Agilent微陣列掃描儀掃描。使用安捷倫的特征提取軟件獲得原始雜交強度，并檢測總共1 852個miRNAs。其中TWEAK刺激的巨噬細胞源性的外泌體miRNA顯著升高的列出。

1.5 RNA提取及RT-PCR檢測miRNA 使用miRNeasy Mini試劑盒(Qiagen公司，美國)來分離和富集外泌體中的RNA，并使用TRIzol法提取外泌體(100 mg/mL)處理24 h后的卵巢癌細胞中的總RNA。用特異性RT引物逆轉錄成熟的miRNA-17-3p，設計miRNA-17-3p引物,F:5′-TGC GTT GAC GTC ACT CCC G-3′;R:5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′[8]。人snRNA RNU6B(U6)用于miRNA表達的數據標準化(U6引物,F:5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′,R:5′-ACG CTT CAC GAA TTT GCG T-3′)[8]。使用2-△△CT方法分析數據。

1.6 miRNA轉染 人micrOFF antagomiR-17-3p序列(3′-CUA CAA GUG CCU UCA CUG CAG U-5′)antagomiR和micrOFF antagomiR-NC序列(5′-UUU GUA CUA CAC AAA AGU ACU G-3′)陰性對照購自上海生工(上海，中國)。根據廠家說明書，直接將人hsa-miR-7-5p antagomiR或陰性對照以200 nmol/L的濃度轉染到THP-1巨噬細胞。

1.7 免疫印跡分析 從巨噬細胞源性外泌體(100 μg/mL)處理的ATCC 5637細胞中分離總蛋白。用于免疫印跡分析的抗體包括：EGFR兔單抗(碧云天公司,中國)，磷酸化(Ser473/Thr308)AKT兔單抗mAb(碧云天公司,中國)，Akt 1/2兔單抗(碧云天公司,中國)，磷酸化p44/42 MAPK(Thr202/Tyr204)兔單抗，p44/42 MAPK兔單抗(Santa Cruz公司,美國)，GAPDH兔單抗(碧云天公司,中國),羊抗兔IgG單抗(Abcam公司,美國)。兔單抗為一抗(1∶5 000稀釋)，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌3次；羊抗兔IgG單抗為二抗(1∶8 000稀釋)，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌5次；加入ECL置于儀器中曝光顯影。

1.8 Transwell實驗 細胞遷移檢測：傳代培養(yǎng)的 ATCC 5637細胞2×106/mL重懸于無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，鋪于Trans-well聚碳酸酯膜嵌套(康寧公司，美國)上層，將TWEAK刺激后的TMs及對照組置于Trans-well下層。37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)24 h后，除去殘留在膜上表面的細胞，用顯微鏡放大200倍計數，平均每個視野的細胞數，每組3個重復試驗。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用t(或t′)檢驗、方差分析和q檢驗。

2 結果

2.1 TWEAK刺激的TMs源性的外泌體被ATCC 5637細胞內化 PMA誘導THP-1單核細胞24 h后，圓形浮動的THP-1細胞變成了貼壁的扁平細胞(見圖1A)。巨噬細胞的兩個公認的標志物，CD36和CD71的表達顯著性增加(見圖1B)；行馬爾文納米顆粒分析儀觀察，其外泌體直徑主要分布在92 nm左右(見圖2A和圖2B)。且激光共聚焦顯微鏡觀察，其能夠被ATCC 5637細胞內化(見圖3)。

2.2 TWEAK誘導TMs產生的外泌體中miRNAs的檢測 經miRNAs芯片檢測，TWEAK處理TMs產生的外泌體中差異表達1 852種miRNAs，其中9種顯著高表達miRNAs被羅列(見表1)；在獲得TWEAK處理TMs產生的外泌體、GW4869預處理的TMs以及接受外泌體的受體細胞ATCC5637中，發(fā)現(xiàn)TWEAK處理后TMs及外泌體中miRNA-17-3P水平均高于未處理組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05～P<0.01)；而受體細胞同樣在接受TWEAK處理組的外泌體后，miRNA-17-3P水平均高于未處理組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(見表2)。

表1 TWEAK誘導TMs產生的外泌體中高表達的部分miRNAs(n=3)

表2 TWEAK誘導前后不同胞體內miRNA-17-3p水平的比較(n=3)

2.3 外泌體促進膀胱癌ATCC 5637細胞的轉移 通過Transwells實驗驗證，細胞數，未處理組高于PBS處理組，PBS處理組高于TWEAK處理組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明TWEAK誘導的TMs能夠通過外泌體抑制ATCC5637細胞的轉移(見表3)；而GW4869預處理能夠抑制TWEAK激發(fā)巨噬細胞外泌體的釋放；TWEAK預處理后的DMSO組和PBS組比較，2組ATCC5637細胞轉移數目差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表4)。

表3 不同處理組巨噬細胞產生的外泌體對ATCC 5637細胞轉移的影響

表4 TWEAK誘導的巨噬細胞產生的外泌體對ATCC 5637細胞轉移的影響

2.4 通過 MiRNA-17-3p抑制AKT和ERK1/2的磷酸化促進膀胱癌ATCC 5637細胞的轉移 本研究分別使用不同處理的巨噬細胞(未處理組、TWEAK處理TMs組、TWEAK處理轉染antagomiR-17-3p的TMs組及TWEAK處理轉染antagomiR-NC的TMs組)分泌的外泌體與ATCC 5637細胞一起孵育，并且通過qRT-PCR和Transwell實驗驗證了通過干擾TMs中miRNA-17-3p的表達水平，從而影響受體細胞ATCC 5637中miRNA-17-3p的攝入水平(見表 5)，進而影響ATCC 5637細胞轉移(見表 6)；通過Western blotting檢測ATCC 5637細胞中EGFR、磷酸化AKT和ERK1/2的表達。結果表明，TWEAK刺激的巨噬細胞源性的外泌體在ATCC 5637細胞中均能抑制EGFR的表達，并抑制AKT和ERK1/2的磷酸化，但不影響總AKT和ERK1/2的表達(見圖4)。

表5 不同處理組巨噬細胞外泌體作用于ATCC 5637細胞對其miRNA-17-3p的表達的影響

表6 不同處理組巨噬細胞外泌體作用于ATCC 5637細胞對其轉移的影響

3 討論

TWEAK在免疫反應調節(jié)中起重要作用，并調控腫瘤浸潤性巨噬細胞的抗腫瘤作用[7,9]，但其機制仍未清楚。本研究表明TMs衍生的外泌體可以通過將外泌體miR-17-3p轉移到ATCC 5637細胞中而在體內外抑制膀胱癌的轉移。

近年來研究表明，外泌體是腫瘤細胞與周圍環(huán)境之間相互作用的重要介質之一。腫瘤細胞來源的外泌體能有效地破壞緊密連接和血管內皮屏障的完整性以促進腫瘤轉移[10]。腫瘤細胞來源的外泌體可以被遞送至巨噬細胞，激活巨噬細胞成為具有SCOS3/STAT3途徑參與的腫瘤相關巨噬細胞樣表型[11]。然而，關于巨噬細胞源性的外泌體轉移到腫瘤細胞對其影響的報道較少。本研究首先通過PMA誘導THP-1細胞轉化為巨噬細胞，其表面標記物CD36和CD71的表達顯著性增加。且證實了TMs源性外泌體的一種新功能，它能減弱ATCC 5637細胞的遷移。以GW4869消除條件培養(yǎng)基中巨噬細胞源性外泌體會導致TWEAK對ATCC 5637細胞的轉移幾乎沒有影響，表明TWEAK主要通過巨噬細胞源性外泌體轉移來減弱ATCC 5637細胞的轉移。

miRNAs被證實包含在外泌體中，并可以在細胞之間轉移[12]。外泌體miRNA調節(jié)基因表達和相對穩(wěn)定的特性。很多研究已經確定miR-17-3p(腫瘤抑制性miRNA)在許多癌癥的遷移、侵襲和生長中起著重要作用，如乳腺癌[13]、前列腺癌[14]和多發(fā)性骨髓瘤[15]。膀胱癌細胞表達高水平的EGFR，活化的EGFR在細胞遷移和轉移中起重要作用[16-17]。因此，抑制EGFR是治療癌癥的一種潛在方法[18]。在本研究中，我們確定TWEAK增加了巨噬細胞源性外泌體和受體ATCC 5637細胞中miR-17-3p的水平，從而降低EGFR/AKT/ERK1/2途徑的活性，并最終抑制膀胱癌細胞的轉移。我們還發(fā)現(xiàn)，在TMs中轉染antagomiR-17-3p降低了分泌的外泌體和受體ATCC 5637細胞中miR-17-3p的水平，并使遷移和侵襲增強，這說明從TMs轉移的外泌體可以調節(jié)ATCC 5637細胞的轉移。我們研究揭示了miR-17-3p通過外泌體介導而抑制ATCC 5637細胞轉移的新方法。

綜上所述，本研究首次證實了TMs能夠通過外泌體將miR-17-3p轉移到ATCC 5637細胞，并抑制EGFR/AKT/ERK1/2通路，最終導致體內外腫瘤的轉移和侵襲受到抑制。此外，我們初步探索了外泌體miR-17-3p作為體內治療的靶點。