曹 燁，李 蕾，張曉峰★

（1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，江蘇 無(wú)錫 214023；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，江蘇 無(wú)錫 214023）

雙鏈DNA（dsDNA）是有核細(xì)胞內(nèi)重要的遺傳物質(zhì)，抗dsDNA 抗體與細(xì)胞核的反應(yīng)位點(diǎn)位于DNA分子外圍區(qū)脫氧核糖核酸框架上，是系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）標(biāo)志性自身抗體，參與SLE 的發(fā)病機(jī)制[1]，并在疾病進(jìn)展中發(fā)揮極其重要的作用[2]。目前比較成熟的檢測(cè)抗dsDNA 抗體的方法有間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和近年來(lái)逐漸推廣的更為高效精確的化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)（CLIA）[3]。依據(jù)ISO 15189 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室國(guó)際通行標(biāo)準(zhǔn)要求，必須有嚴(yán)格的室內(nèi)質(zhì)量控制措施，但目前市場(chǎng)上尚未有高品質(zhì)的商品化抗dsDNA 抗體定量室內(nèi)質(zhì)控品供用。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)檢測(cè)自身抗體的患者血清標(biāo)本的選擇性收集，自制了抗dsDNA 抗體定量室內(nèi)質(zhì)控品，并對(duì)該質(zhì)控品的精密度及穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)抗dsDNA 抗體的儀器為深圳亞輝龍生物科技有限公司提供的YHLO iFlash 3000 型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，并使用該公司配套的試劑。檢測(cè)前先對(duì)儀器例行狀態(tài)檢查和開(kāi)機(jī)維護(hù)，對(duì)新裝抗dsDNA 抗體試劑重新定標(biāo)，確保儀器、試劑均處于性能良好狀態(tài)。

1.2 質(zhì)控品的制備

1.2.1 質(zhì)控源血清的收集 收集若干份實(shí)驗(yàn)室廢棄的抗dsDNA 抗體高值、低值患者血清標(biāo)本，收集時(shí)剔除溶血、黃疸、脂血等外觀異常及傳染性疾病標(biāo)志物（甲型肝炎病毒抗體、乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗體、人類(lèi)免疫缺陷病毒抗體和梅毒抗體等）陽(yáng)性的標(biāo)本。將這些血清吸到Eppendorf 離心管中，并編號(hào)記錄抗dsDNA 抗體濃度和血樣大致體積，置于-20℃冰箱中冷凍保存。

1.2.2 質(zhì)控品制備 收集標(biāo)本數(shù)量足夠后，從冰箱中取出所有血樣，室溫解凍融化。取一個(gè)潔凈的250 mL三角燒瓶，先將低值血清用吸管移入燒瓶中，充分混勻，用吸管去除可能出現(xiàn)的大團(tuán)纖維蛋白沉淀。用少量含防腐劑的亞輝龍化學(xué)發(fā)光免疫分析儀配套的稀釋液和高值血清調(diào)節(jié)至約0.5 倍cut-off 值，配制低值質(zhì)控血清，56℃滅活30 min 后室溫振搖60 min，分裝在10 mL 的一次性塑料尿沉渣管中，擰上蓋子在3500 rpm 的轉(zhuǎn)速下離心10 min。將上清液再次小心吸入潔凈的三角燒瓶中，振搖2 min 確保充分混勻，按200 μL/ 管分裝在1.5 mL 的Eppendorf 離心管中，蓋緊密封，貼上標(biāo)簽，做好標(biāo)記，置于-20℃冰箱中冷凍保存待用。高值質(zhì)控血清制備時(shí)，按照約5 倍cut-off 值的預(yù)期靶值估算需要加的血樣量，融化混合，各處理步驟同上述低值質(zhì)控血清。用低濃度血清和含防腐劑的亞輝龍化學(xué)發(fā)光免疫分析儀配套的稀釋液配制高值質(zhì)控品，重復(fù)上述滅活、離心、分裝、標(biāo)記步驟，置于-20℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 自制質(zhì)控品性能評(píng)價(jià)

1.3.1 自制質(zhì)控品初始靶值和批內(nèi)精密度（瓶間差）的測(cè)定 從-20℃冰箱中各取20 管自制高值、低值質(zhì)控品，室溫放置30 min 充分解凍融化，編號(hào)、去蓋后上機(jī)檢測(cè)抗dsDNA 抗體濃度，分別記錄20 管自制高值、低值質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果，并計(jì)算平均值（x） 、標(biāo)準(zhǔn)差（s） 、變異系數(shù)（CV%）。

1.3.2 自制質(zhì)控品穩(wěn)定性測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)室日常每周二、周五做2 次標(biāo)本檢測(cè)，每個(gè)測(cè)定日隨機(jī)取出自制高值、低值質(zhì)控品各1 管，復(fù)融后，隨同測(cè)定標(biāo)本一起上機(jī)檢測(cè)，連續(xù)記錄4 個(gè)季度抗dsDNA 抗體濃度的檢測(cè)結(jié)果，分別計(jì)算每季度組的x、s、CV%，比較初始靶值與各季度組均值和全年累積均值的差異性，評(píng)價(jià)自制質(zhì)控品在-20℃保存狀態(tài)下的穩(wěn)定性。首季度以初始靶值的均值為中心線(xiàn)，第二至第四季度以累積均值為中心線(xiàn)，以相應(yīng)的x ±2s 為“警告”線(xiàn)，x±3s 為“失控”線(xiàn)，動(dòng)態(tài)繪制各個(gè)季度Levey-Jennings質(zhì)控圖，以13s、22s、R4s、41s、10X作為“失控”規(guī)則，對(duì)出現(xiàn)“警告”或“失控”的結(jié)果進(jìn)行原因分析，并采取相應(yīng)措施及時(shí)糾正。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算各組x、s、CV%，多組間比較使用單因素方差分析，兩兩均數(shù)比較采用最小顯著性差異法（LSD），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 自制質(zhì)控品初始靶值及批內(nèi)精密度（瓶間差）評(píng)價(jià)

自制高值、低值質(zhì)控品批內(nèi)CV% 分別為5.148%和5.510%，見(jiàn)表1。CV% 值在試劑廠家提供的可接受范圍內(nèi)（≤10%），符合美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)修正案（CLIA 88）中能力驗(yàn)證對(duì)檢測(cè)項(xiàng)目分析質(zhì)量的要求[4]。結(jié)果顯示，自制質(zhì)控品批內(nèi)精密度較高，瓶間差較小，重復(fù)性較好。

表1 自制高值、低值抗dsDNA 抗體質(zhì)控品批內(nèi)精密度檢測(cè)結(jié)果（n=20，U/mL）

2.2 自制質(zhì)控品穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

2.2.1 批間精密度評(píng)價(jià) 高值質(zhì)控品第一季度到第四季度的CV% 分別為6.155%、6.341%、4.536%、4.807%，低值質(zhì)控品第一季度到第四季度的CV% 值略高，分別 為7.550%、9.545%、5.478%、8.511%。 高 值、低值質(zhì)控品全年的季度批間CV% 分別為5.388%、7.612%（見(jiàn)表2）均在試劑廠家提供的試劑說(shuō)明書(shū)中的可接受范圍內(nèi)（≤15%），符合CLIA 88 中能力驗(yàn)證對(duì)檢測(cè)項(xiàng)目分析質(zhì)量的要求[4]。

2.2.2 初始靶值及各季度均值與全年累積均值比較 自制高值、低值質(zhì)控品初始靶值、各季度及全年累積x、s、CV% 見(jiàn)表2。經(jīng)單因素方差分析，自制高值、低值質(zhì)控品各組間均值統(tǒng)計(jì)結(jié)果分別為F=0.093，P=0.993 ；F=0.629，P=0.678，二者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。自制高值、低值質(zhì)控品初始靶值及各季度均值分別與全年累積均值比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。結(jié)果表明，在-20℃保存條件下，高值、低值質(zhì)控品的穩(wěn)定期至少12 個(gè)月。

表2 自制高值、低值抗dsDNA 抗體質(zhì)控品各季度均值與累積均值的比較（U/mL）

2.2.3 自制抗dsDNA 抗體質(zhì)控品的Levey-Jennings 質(zhì)控圖 通過(guò)20 管自制高值、低值質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)出x、s、CV%，設(shè)定靶值，制定室內(nèi)質(zhì)控的控制線(xiàn)，繪制第一季度Levey-Jennings 質(zhì)控圖。自第二季度起，以后每個(gè)季度的Levey-Jennings 質(zhì)控圖均依據(jù)之前所有質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)的累積均數(shù)和累積標(biāo)準(zhǔn)差繪制，圖1、圖2 分別為兩種自制質(zhì)控品第一、第四季度的質(zhì)控圖。高值質(zhì)控品全年共出現(xiàn)違反12s“警告”規(guī)則7 次，頻率為6.7%（7/105）；低值質(zhì)控品全年共出現(xiàn)違反12s“警告”規(guī)則9 次，頻率為8.6%（9/105）。二者平均“警告”頻率為7.62%（16/210）。兩種質(zhì)控品第一、第二、第三季度均未出現(xiàn)違反13s、22s、R4s、41s、10X“失控”規(guī)則現(xiàn)象，僅第四季度高值質(zhì)控品錄得違反22s“失控”規(guī)則一次（第16 至第17 次序號(hào)），見(jiàn)圖2。

圖1 第一季度Levey-Jennings 質(zhì)控圖

圖2 第四季度Levey-Jennings 質(zhì)控圖

3 討論

抗dsDNA 抗體可通過(guò)直接結(jié)合自身抗原或其他間接方式形成免疫復(fù)合物，沉積在腎小球基底膜，觸發(fā)補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷；還可穿入活細(xì)胞中，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，甚至可誘導(dǎo)腎細(xì)胞表型的促纖維化改變[5]?？筪sDNA 抗體滴度與SLE 等疾病的活動(dòng)度密切相關(guān)，動(dòng)態(tài)測(cè)定其濃度對(duì)SLE 的診斷、療效觀察和預(yù)后判斷均有重要意義[6-7]。近年來(lái)，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了抗dsDNA 抗體定量檢測(cè)項(xiàng)目。保證抗dsDNA 抗體檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性至關(guān)重要，其中做好室內(nèi)質(zhì)量控制是一個(gè)重要手段，但目前市場(chǎng)上少有高質(zhì)量的抗dsDNA 抗體定值質(zhì)控品提供，且價(jià)格高昂。理想的質(zhì)控品應(yīng)具備人血清基質(zhì)、無(wú)傳染性、添加劑和抑菌劑的數(shù)量盡可能少、瓶間變異小、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[4]。國(guó)內(nèi)有學(xué)者使用自制抗環(huán)瓜氨酸肽抗體、抗角蛋白抗體、抗核周因子質(zhì)控品來(lái)代替商用質(zhì)控品，性能良好[8]。本實(shí)驗(yàn)室自制的高值、低值抗dsDNA 抗體質(zhì)控品，批內(nèi)變異CV% 分別為5.148%和5.510%，瓶間差較小，全年批間總變異CV% 分別為5.388% 和7.612%，符合試劑廠家說(shuō)明書(shū)提供的批內(nèi)≤10%、批間≤15% 的變異要求，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)室的自制質(zhì)控品有較好的精密度。自制高值、低值質(zhì)控品隨同測(cè)定標(biāo)本一起上機(jī)連續(xù)檢測(cè)4 個(gè)季度，初始靶值及各季度均值與全年累積均值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。自制抗dsDNA 抗體質(zhì)控品的Levey-Jennings 質(zhì)控圖顯示，高值、低值質(zhì)控品均出現(xiàn)違反12s 規(guī)則的現(xiàn)象，“警告”總頻率為7.62（16/210），一年內(nèi)僅第四季度出現(xiàn)違反22s“失控”規(guī)則1 次?！熬妗焙汀笆Э亍钡某霈F(xiàn)可能是由于實(shí)驗(yàn)室溫度、濕度等環(huán)境條件的不穩(wěn)定，以及不同實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員操作的微小差異或儀器的不穩(wěn)定等因素導(dǎo)致。出現(xiàn)“警告”或“失控”后，經(jīng)復(fù)測(cè)質(zhì)控品或重新校準(zhǔn)后再?gòu)?fù)測(cè)質(zhì)控品，其結(jié)果均又回到2s 范圍以?xún)?nèi)的在控狀態(tài)，表明自制質(zhì)控品的檢測(cè)可以較好監(jiān)視檢測(cè)系統(tǒng)的性能狀態(tài)。精密度分析和質(zhì)控圖顯示，低值質(zhì)控品變異系數(shù)較高值質(zhì)控品略大，應(yīng)該與0.5 倍的cut-off 低水平質(zhì)控靶值設(shè)定有直接關(guān)系，水平越低越趨近于分析方法的線(xiàn)性邊界，變異度趨大，但結(jié)果仍處于臨床陰性值區(qū)域，因此并不影響質(zhì)控價(jià)值。這些數(shù)據(jù)分析表明，自制的抗dsDNA 抗體室內(nèi)質(zhì)控品精密度較高，在-20℃保存條件下，自制質(zhì)控品一年內(nèi)保持穩(wěn)定，滿(mǎn)足臨床實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控品的技術(shù)要求。

值得注意的是，為確保順利制備質(zhì)控品，提高質(zhì)控品的穩(wěn)定性，混合質(zhì)控血清在混勻后必須在室溫下振搖60 min，這樣可以讓混合血清中相應(yīng)的抗原抗體充分進(jìn)行中和反應(yīng)，然后離心去除沉淀物能減少潛在的干擾。另外，為了避免質(zhì)控品蒸發(fā)和外溢對(duì)結(jié)果造成影響，分裝進(jìn)Eppendorf 離心管后應(yīng)注意必須保證離心管密封良好，分裝體積應(yīng)至少在200 μL 以上，并放在管架上保持直立狀態(tài)，置于-20℃冰箱中冷凍保存。本實(shí)驗(yàn)室在長(zhǎng)期的工作總結(jié)中，利用實(shí)驗(yàn)室廢棄的血清標(biāo)本先后成功制備了幾乎“零成本”的抗dsDNA 抗體、抗ANA 抗體、抗CCP 抗體、抗MP抗體、抗EBV 抗體等多種室內(nèi)質(zhì)控品，性能均良好。這些自制質(zhì)控品的應(yīng)用既保證了實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的準(zhǔn)確和質(zhì)量的穩(wěn)定，同時(shí)又大大降低了科室的支出，對(duì)檢驗(yàn)科以及醫(yī)院的降本增效工作作出了應(yīng)有的貢獻(xiàn)。