羅嘉欣，張傲琪，高瑞江，李自如，朱潤秀，姚遠，*，袁軍*

腦卒中是全球第二大死亡原因，也是造成身體殘疾的主要原因，以急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）最為常見［1］。盡管近年來AIS新發(fā)率和復(fù)發(fā)率正在下降，導(dǎo)致的死亡人數(shù)也有所減少［2］，但全世界每年仍有1 500萬人發(fā)生AIS，其中中國每年就有超過200萬例新發(fā)病例，且患病人群趨于年輕化［3-5］。目前國內(nèi)外已有的預(yù)測AIS的方法包括十年卒中風(fēng)險方程、新的《弗雷明漢卒中風(fēng)險概況》和“中風(fēng)”危險評分卡，但均不足以有效預(yù)測AIS的發(fā)生風(fēng)險、指導(dǎo)早期干預(yù)策略的制訂。由于傳統(tǒng)危險因素不能完全預(yù)測AIS的發(fā)生風(fēng)險［6］，越來越多的預(yù)測方法趨向于結(jié)合臨床生物標(biāo)志物評估疾病發(fā)生風(fēng)險［7-8］。因此，探索新的AIS發(fā)生風(fēng)險可能會進一步減輕AIS疾病負擔(dān)［9］。

近期大量研究顯示，腸道微生物群與動脈粥樣硬化、心血管疾病及AIS不良功能預(yù)后之間存在密切相關(guān)性［10-12］。氧化三甲胺（TMAO）轉(zhuǎn)化為三甲氨（TMA），后者在腸道微生物作用下或再經(jīng)門靜脈循環(huán)進入肝臟被黃素單加氧酶3（FMO3）氧化后生成 TMAO，發(fā)揮促進動脈粥樣硬化形成、增加血小板高反應(yīng)性及促進血栓形成的作用，同時減少膽固醇逆向轉(zhuǎn)運［13］。本課題組發(fā)現(xiàn)，TMAO與AIS發(fā)生風(fēng)險之間可能存在相關(guān)性，但尚有爭議［14］。為明確TMAO水平與AIS發(fā)生風(fēng)險之間的關(guān)系，本研究采用回顧性研究方法，利用《國家衛(wèi)生健康委腦卒中篩查與干預(yù)項目》篩查的人群資料，分析血清TMAO水平對AIS發(fā)生風(fēng)險的影響，為AIS的預(yù)防及早期啟動干預(yù)措施提供有價值的理論依據(jù)及新型靶點預(yù)防思路［15］。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2020年10—12月，基于腦卒中高危人群篩查和干預(yù)項目（https://chinasdc.cn），于內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市新城區(qū)社區(qū)腦卒中篩查人群中隨機抽取500例為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＞40歲，男女不限；（2）身體無嚴重缺陷；（3）患者和/或其家屬知情同意，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有長期服用他汀類藥物或抗凝藥物史；（2）妊娠或哺乳期婦女。本研究遵循赫爾辛基宣言原則，研究方案通過內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批號：202100206L）。排除年齡＜40歲12例，既往有腦卒中疾病史56例，拒絕入組30例，長期服用抗血栓藥物1例，妊娠1例，最終納入研究對象399例。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料及實驗室檢查指標(biāo) 收集研究對象一般資料，包括性別、年齡、腦卒中病史（既往患腦卒中或有短暫性腦缺血發(fā)作）、高血壓病史、糖尿病病史、高脂血癥病史、心臟病病史、缺乏運動（運動＜30 min/次、次數(shù)＜3次/周）、目前吸煙（平均每天吸煙≥1支且持續(xù)時間≥1年）、目前飲酒（平均每天飲酒≥50 g且持續(xù)時間≥1年）、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、篩查時收縮壓，收縮壓＜140 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）為正常，≥140 mm Hg為血壓升高；實驗室檢查指標(biāo)包括：空腹血糖、糖化血紅蛋白、三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白、TMAO。采集研究對象全血樣本5 ml置入惰性分離促凝真空管，4 ℃保存，1 500 r/min離心10 min（離心半徑為13.5 cm），分離血清，應(yīng)用三諾安穩(wěn)+AIR血糖儀檢測空腹血糖，應(yīng)用卡迪克干式生化分析儀檢測糖化血紅蛋白、三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（中國酶免公司生產(chǎn)）檢測TMAO水平。

1.2.2 研究分組 依據(jù)國家衛(wèi)生健康委腦卒中防治工程委員會開展的腦卒中高危人群篩查和干預(yù)項目，采用“中風(fēng)”危險評分卡對40歲以上人群進行AIS發(fā)生風(fēng)險評估，該評估中危險因素共8項：高血壓、血脂情況、糖尿病、吸煙、心房顫動或瓣膜性心臟病、體質(zhì)量、運動、卒中家族史。高危定義：存在3項及以上上述危險因素或既往有腦卒中病史或既往有短暫性腦缺血發(fā)作病史；中危定義：有高血壓、糖尿病、心房顫動任意一種。本研究依據(jù)“中風(fēng)”危險評分卡將研究對象分為正常對照組（n=121）、中危組（n=141）、高危組（n=137）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析；計數(shù)資料以相對數(shù)表示，多組間比較采用χ2檢驗。TMAO與AIS發(fā)生風(fēng)險相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析和Spearman秩相關(guān)分析。采用有序多分類Logistic回歸分析探究AIS發(fā)生風(fēng)險的影響因素。鑒于TMAO存在于外周循環(huán)中，且其在AIS患者血清中水平較高［12，16］，為進一步明確TMAO作為AIS發(fā)生風(fēng)險生物標(biāo)志物的潛在價值，繪制TMAO預(yù)測AIS發(fā)生風(fēng)險的受試者工作特征曲線（ROC曲線），并計算靈敏度、特異度、ROC曲線下面積（AUC）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同AIS發(fā)生風(fēng)險人群TMAO水平 正常對照組、中危組、高危組TMAO水平分別為（2.86±0.31）、（2.84±0.37）、（3.21±0.33）μmol/L， 三 組 TMAO水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=50.877，P＜0.01）；其中高危組TMAO水平高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；中危組TMAO水平與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.760）；中危組和高危組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。

2.2 AIS發(fā)生風(fēng)險的單因素分析 三組年齡、性別、高血壓病史、糖尿病病史、高脂血癥病史、缺乏運動情況、目前吸煙情況、目前飲酒情況、BMI、篩查時收縮壓水平、空腹血糖水平、糖化血紅蛋白水平、三酰甘油水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；三組總膽固醇、低密度脂蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。三組均無腦卒中、心臟病病史者。

表1 三組研究對象一般資料及實驗室檢查指標(biāo)比較Table 1 Comparison of general data and laboratory examination indexes of three groups of research objects

2.3 TMAO與AIS發(fā)生風(fēng)險相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析TMAO與AIS發(fā)生風(fēng)險單因素分析中差異有統(tǒng)計學(xué)意義指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果顯示，TMAO與年齡、性別、高血壓病史、糖尿病病史、目前吸煙、目前飲酒呈負相關(guān)關(guān)系，與缺乏運動、BMI呈正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），見表2。

表2 TMAO與AIS發(fā)生風(fēng)險相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of serum TMAO with risk factors of acute ischemic stroke

2.4 AIS發(fā)生風(fēng)險影響因素的有序多分類Logistic回歸分析 以AIS發(fā)生風(fēng)險評估分級為因變量（賦值：正常對照組=1，中危組=2，高危組=3），以單因素分析中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)為自變量，進行有序多分類Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，高血壓病史、糖尿病病史、缺乏運動、目前吸煙、BMI、篩查時收縮壓、空腹血糖、TMAO是AIS發(fā)生風(fēng)險評估分級的獨立影響因素（P＜0.05），見表3，且危險因素間未發(fā)現(xiàn)明顯共線性方差膨脹因子，VIF均＜10。

表3 AIS發(fā)生風(fēng)險影響因素的有序多分類Logistic回歸分析Tabl 3 Analysis of the factors possibly associated with acute ischemic stroke using multinomial and ordinal Logistic regression

2.5 TMAO預(yù)測AIS發(fā)生風(fēng)險的價值 繪制TMAO預(yù)測AIS發(fā)生風(fēng)險的ROC曲線，結(jié)果顯示，當(dāng)TMAO預(yù)測AIS發(fā)生風(fēng)險的最佳截斷值為3.28 μmol/L時，靈敏度為62.0%，特異度為91.6%，AUC為0.790〔95%CI（0.737，0.837）〕，見圖1。

圖1 TMAO預(yù)測AIS發(fā)生風(fēng)險的ROC曲線Figure 1 ROC curve of serum TMAO in predicting the risk of acute ischemic stroke

3 討論

全球疾病負擔(dān)（global burden of disease，GBD）研究數(shù)據(jù)顯示，中國是世界腦卒中發(fā)病率最高的國家之一，與蒙古國、俄羅斯共同構(gòu)成重要發(fā)病帶［17］，有效預(yù)判AIS的發(fā)生并予以積極、有效的干預(yù)措施對降低AIS發(fā)病率至關(guān)重要。隨著人們生活水平的提高及飲食結(jié)構(gòu)的改變，探究腸道微生物代謝產(chǎn)物與糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化、慢性腎臟疾病及心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后情況的相關(guān)性已成為全球熱點研究方向［18-21］。雖然大量研究早已證明炎性因子在AIS及心血管疾病發(fā)生中的潛在預(yù)測價值［22-23］，但腸道微生物組及其代謝產(chǎn)物在AIS中的關(guān)鍵作用直到最近才被認識到。有研究發(fā)現(xiàn)，TMAO是心房顫動患者發(fā)生AIS的獨立預(yù)測因子，有可能改善心房顫動患者的卒中分層［24］。亦有報道指出較高的TMAO水平可能與高血壓患者首次AIS風(fēng)險增加相關(guān)［25］。但國內(nèi)外尚無直接探索TMAO水平是否為AIS發(fā)生獨立危險因素的相關(guān)報道。

本研究結(jié)果顯示，高危組TMAO水平高于正常對照組、中危組，進一步行有序多分類Logistic回歸分析結(jié)果顯示，TMAO是AIS發(fā)生風(fēng)險評估分級的獨立影響因素；同時，TMAO預(yù)測AIS發(fā)生風(fēng)險的ROC曲線結(jié)果顯示，當(dāng)TMAO預(yù)測AIS發(fā)生風(fēng)險的最佳截斷值為3.28 μmol/L時，靈敏度為62.0%，特異度為91.6%，AUC為0.790〔95%CI（0.737，0.837）〕。為進一步證實本研究結(jié)果的可靠性，本研究團隊目前已完成此項目隊列研究的臨床注冊及啟動工作，正在進行定期隨訪。

較高TMAO水平與AIS發(fā)生風(fēng)險之間呈正相關(guān)的潛在機制在于：（1）TMAO可促進動脈粥樣硬化形成及斑塊不穩(wěn)定性增加。TMAO通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞炎癥信號傳導(dǎo)和基因表達，促使巨噬細胞轉(zhuǎn)化為泡沫細胞，從而形成動脈粥樣硬化斑塊［13，26］。GENG等［27］提出，高水平的TMAO可增加巨噬細胞聚集、CD36和促炎細胞因子表達，從而誘導(dǎo)泡沫細胞形成，增加動脈粥樣硬化斑塊活動性，而動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性可直接影響AIS事件的發(fā)生［28］。（2）升高血小板反應(yīng)性、促進血栓形成。TMAO通過增加組織因子的表達和活性來促進血栓形成，從而增加AIS發(fā)生風(fēng)險［29］。目前認為，TMAO是動脈粥樣硬化疾病發(fā)病機制及繼發(fā)附壁血栓所致相關(guān)疾病的潛在重要中介［12］。這表明TMAO可能作為臨床有價值的評估AIS發(fā)生風(fēng)險的生物標(biāo)志物，甚至超過了目前使用的危險因素和實驗室檢查指標(biāo)。也有部分研究認為，抑制TMAO的產(chǎn)生或降低其血清水平可改善由飲食引起的動脈粥樣硬化［30］。因此，TMAO可能成為預(yù)防AIS的新型生物標(biāo)志物和AIS的潛在治療靶點。

本研究尚存在一定的局限性，首先，本研究是單中心研究，存在一定的地域性和選擇性偏移，可能會降低研究結(jié)果的價值。其次，本研究采用“中風(fēng)”危險評分卡預(yù)測AIS發(fā)生風(fēng)險，這將導(dǎo)致預(yù)測準(zhǔn)確性的降低。提高預(yù)測效能最直接準(zhǔn)確的方法是進行隊列研究，追蹤高危人群AIS的真實患病率，進而判斷TMAO預(yù)測效果，目前本研究團隊已開展本項目的隊列研究。再次，本研究未采用穩(wěn)定同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測血清TMAO［31］，可能與其他文獻略有偏差，但本研究方向是值得肯定的。最后，本研究中未評估動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性、凝血因子和血小板活性，需要后續(xù)研究來明確TMAO水平預(yù)測AIS發(fā)生風(fēng)險的機制。

綜上所述，血清TMAO水平升高與AIS發(fā)生風(fēng)險獨立相關(guān)，但仍需縱向研究來檢驗和證實這些關(guān)聯(lián)，為AIS一級預(yù)防和治療策略提供新的前景。

作者貢獻：羅嘉欣進行文章構(gòu)思與設(shè)計、負責(zé)文獻、資料收集、實驗操作、撰寫論文及文章質(zhì)控；張傲琪進行實驗操作及文獻資料的整理；高瑞江進行篩查評估、采集血樣及數(shù)據(jù)整理；李自如進行論文修訂；朱潤秀進行文章質(zhì)控；姚遠進行研究設(shè)計、方案改進、英文修正及文章質(zhì)控；袁軍對文章整體負責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。