張紹仁 胡靜嫻 周皓 蔣淼 樊曉明

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能與肥胖癥和2型糖尿病等代謝紊亂密切相關(guān)，目前尚無(wú)有效治療方法[1-5]。饑餓素O-?；D(zhuǎn)移酶(ghrelin o-acyltransferase, GOAT)是饑餓素(Ghrelin)特異的?；D(zhuǎn)移酶[6, 7]。有研究提示GOAT-Ghrelin在能量代謝、脂質(zhì)代謝等環(huán)節(jié)發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[8, 9]。GOAT拮抗劑GO-CoA-Tat是一種基于多肽的雙底物類似物，腹腔注射可改善小鼠血葡萄糖耐量及減少食物攝入[10-12]。GO-CoA-Tat能否調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝尚不清楚。本研究探索GO-CoA-Tat對(duì)小鼠肝臟脂肪變性和脂肪性肝炎相關(guān)炎癥指標(biāo)的作用。

材料與方法

一、動(dòng)物飼養(yǎng)和處理方案

雄性C57bl/6小鼠18只，8～10周齡，體質(zhì)量(23.0±2.0)g，購(gòu)自上海靈昌生物科技有限公司。高脂飲食(high fat diet, HFD)飼料(D12492，上海睿安生物有限公司)用于誘導(dǎo)小鼠肥胖及脂肪肝。小鼠在23℃環(huán)境下標(biāo)準(zhǔn)方法飼喂，隨機(jī)分成3組，每組6只。正常組：給予小鼠正常飲食。HFD+Saline組：小鼠HFD喂養(yǎng)8周，每周1次腹腔注射0.9% NaCl溶液。HFD+GO-CoA-Tat組：小鼠HFD喂養(yǎng)8周，每周1次腹腔注射GO-CoA-Tat 96 μg/kg。所有小鼠在第8周處死，采集肝臟樣本和血液進(jìn)行組織學(xué)和血清學(xué)分析。

二、生化檢測(cè)

微孔板檢測(cè)試劑盒(上海閃譜生物公司)測(cè)定血清ALT、AST、TG、TC和GLU水平。細(xì)胞脂質(zhì)測(cè)定試劑盒(上海閃譜生物公司)檢測(cè)小鼠肝臟三酰甘油濃度。

三、實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

分離總RNA，SYBR Green PCR依據(jù)生產(chǎn)商的操作流程進(jìn)行。總RNA提取采用TRIzol試劑盒。使用7900HT Fast Real-Time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國(guó))進(jìn)行SYBR Green定量RT-PCR，依據(jù)SYBR Premix EX Taq(TaKaRa生物公司)操作介紹確定靶基因表達(dá)，引物序列GAPDH：上游5′-TATGTCGTGGAGTCTACTGGT-3′；下游5′-GAG-TTGTCATATTTCTCGTGG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度149 bp。TNF-α：上游5′-CACCACTTCGAAACCTGGGA-3′；下游5′-TGTAGGCCCCAGTGAGTTCT-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度105 bp。IL-6：上游5′-TCAATATTAGAGTCTC-AACCCCCA-3′；下游5′-TTCTCTTTCGTTCCCG-GTGG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度90 bp。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、3組小鼠體質(zhì)量和血糖水平比較

喂養(yǎng)第8周末，小鼠體質(zhì)量HFD+Saline組為(37.327±0.296)g，正常組為(31.765±0.235)g，HFD+GO-CoA-Tat組(33.125±0.153)g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=26.43，P=0.009)。在喂養(yǎng)第8周末檢測(cè)各組小鼠空腹血糖水平，HFD+Saline組為(6.370±0.296)mmol/L，正常組為(2.867±0.299)mmol/L，HFD+GO-CoA-Tat組為(4.103±0.184)mmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=44.96，P=0.021)。組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

二、3組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)和血脂水平比較

各組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)三酰甘油水平，HFD+Saline組為(101.332±2.052)mmol/L，正常組為(54.373±0.9694)mmol/L，HFD+GO-CoA-Tat組為(75.602±1.487)mmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=224.7，P=0.023)。HFD+Saline組TG及TC分別為(1.943±0.136)、(5.013±0.369)mmol/L，正常組分別為(0.660±0.709)、(1.763±0.293)mmol/L，HFD+GO-CoA-Tat組分別為(1.237±0.071)、(2.403±0.151)mmol/L，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為43.30和36.29，P值分別為0.023和0.031)。組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

三、3組小鼠炎性指標(biāo)比較

HFD+Saline組ALT及AST分別為(54.901±5.201)、(173.321±13.971)U/L，正常組分別為(27.914±2.401)、(96.473±3.491)U/L，HFD+GO-CoA-Tat組分別為(37.862±2.425)、(122.932±6.907)U/L，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為14.44和17.91，P值分別為0.029和0.015)。HFD+Saline組TNF-α和IL-6分別為(2.740±0.140)、(2.980±0.070)，正常組分別為(1.000±0.070)、(1.000±0.040)，HFD+GO-CoA-Tat組分別為(1.730±0.040)、(1.630±0.040)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為89.12和68.34，P值分別為0.021和0.034)。組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

討 論

NAFLD發(fā)病機(jī)制目前仍不明確，可能與冠心病的危險(xiǎn)因素密切相關(guān)，如血脂異常、糖尿病和代謝綜合征等[13, 14]。

肥胖癥和糖耐量異常在NAFLD的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用?！岸嘀卮驌簟睂W(xué)說(shuō)認(rèn)為初次打擊為糖耐量異常，導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)大量脂肪聚集，引起肝細(xì)胞脂肪變性[15, 16]。本研究發(fā)現(xiàn)，腹腔內(nèi)注射GO-CoA-Tat可降低HFD小鼠的體質(zhì)量增加并維持血糖穩(wěn)定。GO-CoA-Tat能顯著抑制肝細(xì)胞及小鼠體內(nèi)GOAT表達(dá)，在野生型小鼠中GO-CoA-Tat能控制體質(zhì)量增加、改善血糖水平和調(diào)節(jié)食欲[10]。本研究結(jié)果顯示，GO-CoA-Tat能顯著緩解小鼠肝臟脂肪變性，并能減少肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚。HFD+GO-CoA-Tat組TG及TC較HFD+Saline組有明顯下降，提示GO-CoA-Tat能有效降低小鼠血脂濃度。Ghrelin-GOAT系統(tǒng)可能胰島素抵抗、脂代謝調(diào)節(jié)過(guò)程發(fā)揮作用，而后兩者均參與了NAFLD病理的發(fā)生及進(jìn)展[8, 9]。本研究顯示GO-CoA-Tat可能在減輕NAFLD的脂肪變性以及改善血糖方面發(fā)揮作用。

炎癥性肝損傷是非酒精性肝脂肪變向非酒精性脂肪性肝炎進(jìn)展的重要因素。肝細(xì)胞內(nèi)大量脂肪聚集，導(dǎo)致氧化應(yīng)激、炎癥因子激活及肝細(xì)胞線粒體障礙，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞炎癥、纖維化等發(fā)生[17]。GO-CoA-Tat干預(yù)后HFD小鼠血清肝功能指標(biāo)水平有效降低，表明GO-CoA-Tat可緩解小鼠肝臟炎癥損傷，其作用可能源于潛在的對(duì)肝臟直接抗炎作用以及改善高脂肪飲食所致的代謝異常。

總之，GO-CoA-Tat可減輕小鼠的肝脂肪變性及炎癥反應(yīng)，為將來(lái)更進(jìn)一步的藥理學(xué)研究和治療藥物提供更多選擇。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。