■張 佳 王 園* 安曉萍 齊景偉

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)草食家畜飼料工程技術研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

自2006 年歐盟禁止使用飼用抗生素以來，人們一直在不斷地尋找能夠維持以及改善動物健康狀態(tài)和生產(chǎn)性能的飼料添加劑，其中，植物源天然化合物被認為是飼用抗生素的良好替代品之一。植物多酚（plant polyphenol，PP）作為植物次級代謝產(chǎn)物的一種，存在于水果、蔬菜、谷物、茶、咖啡等多種植物中，其基本結(jié)構為不含氮的帶有一個或多個羥基基團的酚環(huán)結(jié)構，具有廣泛的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗菌等。文章在闡明PP 結(jié)構和分類的基礎上，綜述其生物活性及作用機制，總結(jié)其在反芻動物生產(chǎn)中應用情況，以期為今后PP的廣泛應用提供理論依據(jù)。

1 PP的分類及組成

PP 是植物中的第四大主要成分，其含量僅次于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。最初人們按照PP 的化學結(jié)構特征將其分為水解單寧（hydrolysable tannins，HT）和縮合單寧（condensed tannins，CT）兩個類型。隨著研究的深入，Haslam等（1990）在不考慮分子量的基礎上，根據(jù)單寧的分子結(jié)構，將PP分為聚棓酸脂類（含HT及相關化合物）和聚黃烷醇類（含CT及相關化合物）。直到2011 年，Quideau 等（2011）重新提出了PP 的定義：指由莽草酸衍生的苯丙烷和/或聚酮途徑合成的植物次級代謝產(chǎn)物，其結(jié)構中具有多個酚環(huán)，且在基本結(jié)構中不含氮的一類酚類化合物。因此，目前根據(jù)酚環(huán)的數(shù)量及其相互結(jié)合的結(jié)構元素，分為類黃酮型和非類黃酮型兩大類。PP的分類、結(jié)構、來源及生物活性見表1，典型PP化學結(jié)構見圖1。

表1 常見植物多酚的來源、分類、結(jié)構及生物活性

圖1 典型植物多酚化學結(jié)構

類黃酮型種類達到4 000 多種，其結(jié)構中共有兩個苯環(huán)，由三個碳原子形成的含氧雜環(huán)相連，通常為C6-C3-C6結(jié)構。根據(jù)雜環(huán)的類型，可分為以下亞類：黃酮醇、黃酮、黃烷-3-醇、黃烷酮、花青素和異黃酮。常見類黃酮型包括槲皮素、兒茶素、花青素、大豆苷元等。非類黃酮型主要為酚酸、芪類兩類。酚酸于谷物中多見，根據(jù)碳骨架分為兩類，分別是C6-C3型（如阿魏酸、咖啡酸、香豆酸和芥子酸等肉桂酸）和C6-C1型（如沒食子酸、香草酸等苯甲酸）。芪類為二苯乙烯類化合物，白藜蘆醇最為典型，其結(jié)構為由一個雙碳亞甲基橋連接的兩個酚環(huán)。PP在化合物中的含量如表2所示。

表2 部分植物多酚在化合物中的含量

2 PP的生物活性及其作用機制

2.1 抗氧化活性

抗氧化活性是PP研究最為深入的特性。體外研究證實，PP對DPPH、羥基自由基、超氧陰離子自由基具有很強的清除活性。目前研究發(fā)現(xiàn)，PP 中抗氧化活性最高的物質(zhì)是楊梅酮。Barzegar（2016）以二氯二氫熒光素（DCF）探針作為MCF-7 細胞內(nèi)活性氧（ROS）的指示劑，發(fā)現(xiàn)2 μg 和5 μg 的楊梅酮均可直接抑制細胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生。這與PP 的結(jié)構密切相關，如圖2所示：①B環(huán)上的鄰苯二酚基團具有顯著的清除ROS 或活性氮（RNS）的能力；②B 環(huán)上的羥基是自由基的電子和氮的供體；③C 環(huán)可以使苯氧自由基更具穩(wěn)定性，增強抗氧化活性；④當A 環(huán)和C 環(huán)上存在4-OH時，7-OH具有最大的自由基清除能力；⑤A環(huán)的5-OH和7-OH基團可以與金屬離子絡合，增加自由基清除能力。目前PP螯合金屬離子，抑制氧化應激產(chǎn)生的能力已得到證實。Bong-Jeun（2004）研究發(fā)現(xiàn)，綠茶多酚可以螯合金屬離子（Cu2+、Fe2+），加速阻止O2-和H2O2變成羥自由基（·OH）。當其濃度在5 mg/kg以上時，Cu2+的螯合效果可達80%以上，而在50 mg/kg以上時，F(xiàn)e2+的螯合效果可達70%左右。不僅如此，近年來國內(nèi)外學者通過對PP 抗氧化機制的深入研究，發(fā)現(xiàn)PP 還可以通過核因子E2 相關因子2（Nuclear factorerythroid 2-related factor-2，Nrf2）-抗氧化反應原件（antioxidant responsive element，ARE）信號通路誘導抗氧化酶或Ⅱ相解毒酶表達上調(diào)。買地娜依等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，1、10、50 μg/mL 的表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）均可以上調(diào)3T3-L1 脂肪細胞Nrf2 和HO-1 的基因表達量，進而提高細胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）含量，降低丙二醛（MDA）含量，抑制細胞發(fā)生氧化應激，且呈劑量依賴性。進一步研究表明，EGCG 可激活絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK），觸發(fā)Nrf2磷酸化，或直接與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）中的半胱氨酸殘基互作，從而誘導Nrf2 解離。此外，Gan 等（2016）證實25 μmol/L白藜蘆醇可通過ERK5/HDAC5途徑激活Mn-SOD的表達，從而減輕內(nèi)皮細胞線粒體氧化應激。Liu 等（2018）發(fā)現(xiàn)，藍靛果多酚（0.05%和0.1%）可有效促進高脂飼糧誘導的小鼠肝臟內(nèi)Nrf2、HO-1和MnSOD等抗氧化蛋白的表達，從而降低脂質(zhì)過氧化水平。綜上所述，PP 參與調(diào)控抗氧化作用的調(diào)節(jié)機制主要包括：①清除自由基；②螯合金屬離子抑制活性氧的形成；③激活Nrf2-ARE、ERK5/HDAC5等信號通路，誘導抗氧化酶或Ⅱ相解毒酶表達。

圖2 類黃酮型植物多酚的基本結(jié)構

2.2 抗炎活性

體內(nèi)、外試驗均已證明PP 可通過抑制促炎細胞因子的表達實現(xiàn)其抗炎活性。藍莓花色苷、黑莓花色苷和黑醋栗花色苷（20 μg/mL）能顯著降低脂多糖（LPS）誘導的小鼠巨噬細胞白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNFα）mRNA 的表達水平及含量。綠茶多酚（1 mg/mL）則可以抑制Caco-2細胞（人結(jié)直腸腺癌細胞）、白細胞介素-6（IL-6）和白細胞介素-8（IL-8）的釋放，降低細胞通透性，預防炎癥性腸道疾病。在炎癥過程中，誘導型一氧化氮合酶（iNOS）和環(huán)氧化酶2（cyclooxygenase，COX-2）及各自催化產(chǎn)物一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2），參與并加重炎癥。Koeberle（2009）發(fā)現(xiàn)姜黃素（30 μmol/L）可以通過抑制COX-2 的表達和直接激活mPGE2 活性來抑制PGE2的產(chǎn)生。蔡美云等（2020）進一步發(fā)現(xiàn)，80 μmol/L的山奈酚（KAE）可通過抑制P38 MAPK/NF-κB信號通路，顯著降低iNOS 和COX-2 的表達，進而減輕神經(jīng)毒素6-羥多巴胺誘導的PC12 細胞炎癥反應的發(fā)生。NF-κB原本與I-κBα抑制劑結(jié)合存在于胞漿中，但當細胞受到炎癥因子刺激時，I-κBα被磷酸化和降解，從而釋放NF-κB 進入細胞核，誘導促炎基因表達。研究發(fā)現(xiàn)，PP 可以抑制NF-κB 核轉(zhuǎn)位，如從黑豆中分離出的花青素就可以有效抑制NF-κB轉(zhuǎn)位到細胞核中。故PP 發(fā)揮抗炎活性的途徑有：①抑制促炎細胞因子的表達；②抑制MAPKs 及NF-κB 信號通路介導iNOS 和COX-2 的表達，進而抑制炎癥；③抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位。

2.3 抗菌活性

多酚是植物抵抗蟲害、病害而產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，本身就具有廣譜的抗菌活性。研究發(fā)現(xiàn)，PP可以抑制細菌胞內(nèi)DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子的合成。Katarzyna（2006）在哈維氏弧菌中加入染料木黃酮（0.1 mmoL/L），15 min 后菌體DNA 和RNA 合成就受到了強烈抑制。PP 抑制生物大分子合成的作用，可能與其降低細胞膜流動性、提高細胞膜通透性的特性有關。在Rosangela 等（2010）的研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過百里香酚、丁香酚和香芹酚處理后，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等菌株內(nèi)，飽和C16 脂肪酸和飽和C18脂肪酸含量增加，不飽和C18 脂肪酸含量相應減少，表明PP可通過減少不飽和脂肪酸含量降低細胞膜流動性。另外，PP提高了菌體細胞膜通透性，可造成細胞內(nèi)ATP 外泄，達到抑菌效果。近年來還有研究證實，PP 對葡萄糖運輸或利用的抑制作用及對細胞膜滲透性的影響是導致細菌ATP 的合成被抑制的重要原因。如百里香酚可通過參與三羧酸循環(huán)來降低沙門氏菌胞內(nèi)ATP的合成。不僅如此，隨著研究的深入人們發(fā)現(xiàn)，PP 可通過堵塞外膜孔蛋白阻礙葡萄糖等親水小分子進入胞內(nèi)而發(fā)揮抗菌作用。Motokazu 等（2013）通過透射電鏡分析發(fā)現(xiàn)，EGCG 會沉積在大腸桿菌細胞表面最外層的膜上，與細菌外膜蛋白G（OmpG）的通道相互作用，進入孔道并通過氫鍵與孔道內(nèi)表面的精氨酸（Arg）殘基結(jié)合，從而抑制葡萄糖等親水小分子的被動轉(zhuǎn)運，進而達到抑制大腸桿菌生長的目的。綜上所述，PP 發(fā)揮抑菌作用的機理主要包括：①抑制胞內(nèi)DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子的合成；②改變細胞膜中脂肪酸的組成，降低細胞膜流動性，提高細胞膜的通透性；③抑制ATP的合成，影響細菌的能量代謝；④堵塞外膜孔蛋白，阻礙葡萄糖等親水小分子進入胞內(nèi)。

3 PP在反芻動物生產(chǎn)中的應用

3.1 對反芻動物生長性能的影響

在反芻動物飼養(yǎng)過程中，飼料的成本一直以來均是影響?zhàn)B殖經(jīng)濟效益的主要因素之一，如何在減少飼料成本的基礎上仍然能夠提高反芻動物采食量及日增重是畜禽生產(chǎn)中有待解決的問題。研究發(fā)現(xiàn)，PP可以提高反芻動物的生長性能。一方面是由于PP作為天然的抗氧化劑能夠降低反芻動物在飼養(yǎng)過程中受到的應激；另一方面是由于PP 可以降低蛋白質(zhì)在瘤胃內(nèi)的降解率，進而促進機體對蛋白質(zhì)的吸收。薛樹媛（2011）研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加1%和2%的五倍子單寧酸可以提高綿羊的增重，降低料重比，但當添加量達到3.5%時，綿羊的平均日增重（ADG）卻降低。同樣，楊文軍等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，10 mg/kg和20 mg/kg葡萄籽原花青素（含有96.40%原花青素、0.53%兒茶素、0.24%表兒茶素、0.23%兒茶素沒食子酸酯和0.17%表兒茶素沒食子酸酯）可以顯著提高羔羊的ADG 和平均日采食量（ADFI），但是40 mg/kg 葡萄籽原花青素卻降低了羔羊的ADFI。這是因為，高濃度的PP 會影響瘤胃內(nèi)菌群的數(shù)量及組成，尤其是抑制瘤胃內(nèi)纖維分解菌的生長，使飼料轉(zhuǎn)化率降低，生長受到抑制。楊春濤（2016）研究發(fā)現(xiàn)，PP還可以增強犢牛瘤胃內(nèi)消化酶活性、降低腹瀉率，以此提高飼料轉(zhuǎn)化率和ADG。此外，白藜蘆醇是有效的植物雌激素，可以通過下丘腦-垂體激素軸影響生長激素（GH）、表皮生長因子（EGF）和類胰島素樣生長因子1（IGF-1）的分泌，促進犢牛肌肉組織的生長，最終加快生長速度。

綜上所述，盡管大部分的PP 均可以改善反芻動物的生長性能，但是不同PP的提取方法、添加水平等因素對反芻動物生長性能的影響均不一致。且研究發(fā)現(xiàn)PP添加劑量過大還會給反芻動物生長帶來一定的負面影響，推測其原因可能是PP 的添加水平存在一定的差異性，當添加水平不適時會導致反芻動物瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)以及機體免疫功能受到影響，進而表現(xiàn)出生長性能降低或無任何影響。因此在實際應用中應注意PP種類、提取方法和添加水平等的選擇，以此達到增加養(yǎng)殖者經(jīng)濟效益的目的。

3.2 對反芻動物瘤胃發(fā)酵的影響

研究發(fā)現(xiàn)，PP可以改善瘤胃發(fā)酵，提高蛋白質(zhì)代謝率、降低甲烷產(chǎn)生、減少瘤胃脹氣，進而改善動物的健康狀況和生產(chǎn)性能。同時，PP 被認為是一種天然的過瘤胃蛋白保護劑，在瘤胃pH 5～7時，PP中的酚羥基和苯基可與蛋白質(zhì)的氨基與羧基結(jié)合，形成難以被瘤胃降解的多酚-蛋白質(zhì)復合物，減少瘤胃中飼料蛋白質(zhì)的降解，提高瘤胃內(nèi)微生物蛋白的合成量。研究表明，大豆異黃酮可以提高山羊瘤胃內(nèi)菌體蛋白濃度及揮發(fā)性脂肪酸的含量，促進瘤胃微生物的氮代謝。同樣，苜蓿黃酮可以穩(wěn)定瘤胃內(nèi)環(huán)境，促進瘤胃對氮的吸收，有效改善瘤胃發(fā)酵功能。牟春堂（2020）發(fā)現(xiàn)，葡多酚可以調(diào)控綿羊瘤胃發(fā)酵，提高pH，降低丁酸比例，且200 mg/kg 添加量效果最佳。此外，PP 還可以通過抑制瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌從而降低甲烷排放量。Oskoueian（2013）研究發(fā)現(xiàn)，在干物質(zhì)基礎上添加4.5%的柚皮苷和槲皮素，可以抑制甲烷的產(chǎn)生，降低瘤胃內(nèi)原生動物和甲烷菌的數(shù)量，且不影響干物質(zhì)降解率及其他發(fā)酵參數(shù)。由此可見，適宜的PP 可以有效改善瘤胃發(fā)酵過程，促進氮代謝，提高微生物蛋白合成量及揮發(fā)性脂肪酸的濃度，同時降低瘤胃內(nèi)有害菌的數(shù)量，減少養(yǎng)殖過程中甲烷的排放。原蟲代謝過程中所產(chǎn)生的氫是甲烷菌合成甲烷的原料，PP 之所以能夠有效減少甲烷的產(chǎn)生，其原因主要是PP 提高了厭氧真菌的數(shù)量，進而降低了原蟲和甲烷菌的數(shù)量。但截至目前，有關PP 對原蟲數(shù)量的抑制機制尚不明確，可能是PP改變了細胞膜的流動性和通透性，造成細胞溶解死亡，以此降低了原蟲數(shù)量。

3.3 對反芻動物抗氧化能力的影響

隨著現(xiàn)代畜牧業(yè)集約化程度不斷提高，氧化應激在畜禽生產(chǎn)中的危害已大量顯現(xiàn)，不僅給養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失，還因氧化產(chǎn)物的積累導致畜禽產(chǎn)品品質(zhì)降低，進而影響食品的衛(wèi)生質(zhì)量，危及人類健康和環(huán)境安全。PP 是天然的外源性抗氧化劑，可以有效調(diào)節(jié)反芻動物機體抗氧化酶活性。孫玉麗等（2012）選取40 頭中國荷斯坦奶牛，試驗組灌服20 g/d 的杜仲素，發(fā)現(xiàn)其顯著降低奶牛血液中MDA 的水平，SOD、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）的活性則有一定的上升趨勢。與之相似，Wang 等（2018）選取28 d 荷斯坦斷奶前公犢利用大腸桿菌O141∶K99 進行攻毒試驗，試驗組飼喂3 g/d 桑葉黃酮，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，飼喂桑葉黃酮后犢牛血液中SOD、GSH-Px 升高，MDA 水平降低。不僅如此，Basiricò等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，EGCG可以通過提高奶牛乳腺上皮細胞中GSH 和γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶（γ-GCL）活性，進而降低MDA 水平。葡萄籽原花青素則可以改善羔羊氧化應激狀態(tài)，減輕高精料日糧誘導的羔羊氧化應激。眾所周知，過多的ROS積累不僅會導致氧化應激，還可以激活NF-κB，誘導促炎細胞因子的表達，這表明氧化應激可以觸發(fā)炎癥反應。在Colitti（2006）的一項早期研究中，在圍產(chǎn)期每天給母牛飼喂10 g 的葡萄多酚，觀察到Nrf2 靶基因SOD 的mRNA 濃度在產(chǎn)犢后增加，且ROS 的生成受到了抑制。這說明葡萄多酚可能誘導胎后細胞保護機制，以應對氧化應激和炎癥應激。

PP作為植物源的天然抗氧化劑具有高效、安全、無副作用的特點，加之其在生物體內(nèi)具有清除自由基、防止氧化損傷等作用，故可作為化學合成抗氧化劑的新型替代品。將PP 應用于飼料添加劑中，既可以改善動物免疫力及抗氧化損傷能力，還可提高動物的生產(chǎn)性能和品質(zhì)，可見PP 是很具有發(fā)展前景的天然抗氧化劑之一。

3.4 對反芻動物免疫功能的影響

良好的免疫系統(tǒng)可以抵抗病原入侵、預防疾病發(fā)生、清除體內(nèi)衰老損傷及死亡的細胞，在動物的健康生長方面發(fā)揮著重要的作用。PP可以增加機體免疫細胞數(shù)目，提高免疫細胞活性及分泌能力，進而提高反芻動物的免疫功能。免疫細胞是機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分之一，包括T 細胞和B 細胞。其中T 細胞介導的細胞免疫由CD8+抑制殺傷亞群和CD4+輔助亞群組成。CD4+細胞根據(jù)分泌因子的不同又分為Th1 和Th2 兩個亞群。Th1 細胞主要分泌白介素-2（IL-2）、干擾素（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-β（TNF-β）等Th1型細胞因子，介導細胞免疫、抑制B細胞等；Th2細胞分泌白介素-4（IL-4）、白介素-5（IL-5）、IL-6、白介素-10（IL-10）等Th2 型細胞因子，可促進B 細胞激活及分化并產(chǎn)生抗體，介導體液免疫反應。研究發(fā)現(xiàn)，在綿羊日糧中添加PP 后，其會在綿羊的腸道內(nèi)發(fā)揮作用，促進B淋巴細胞的增殖，增加免疫球蛋白的分泌，最終增加綿羊外周血中CD4+淋巴細胞的數(shù)量，提高綿羊的免疫性能。在Oliveira等（2010）的一項試驗中，研究了石榴多酚對荷斯坦奶牛免疫功能的影響，犢牛飼喂5 g/d 或10 g/d 的石榴多酚，顯著增加其外周血IFN-γ、IL-4以及免疫球蛋白G（IgG）含量。與之相似，郭竟升（2018）研究發(fā)現(xiàn)，精料中添加牛至精油可顯著提高犢牛血液免疫球蛋白濃度，增強犢牛免疫功能。此外，解湧芳（2020）研究發(fā)現(xiàn)PP可通過抑制NF-κB通路激活，下調(diào)綿羊外周血淋巴細胞IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA表達量，提高機體的免疫功能。大量研究已證實，PP可以通過不同的途徑提高機體的免疫功能，但PP本身結(jié)構較為復雜，因此目前對PP功能系統(tǒng)的認知并不全面。機體的免疫系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)是相互聯(lián)系且相互影響的，當機體發(fā)生免疫應激時，隨之也會引起抗氧化系統(tǒng)的失衡，進而發(fā)生氧化應激反應，可見PP具有聯(lián)動發(fā)揮抗炎/抗氧化活性保護機體的活性。

4 小結(jié)

PP 具有抗氧化、抗炎、抗菌等生物活性，有來源廣泛、無副作用、攝入后易被腸道消化吸收等特點，是一種應用前景十分廣闊的飼料添加劑。然而，PP 的來源和結(jié)構、添加劑量、動物品種、飼養(yǎng)環(huán)境以及飼喂周期均可能影響反芻動物對其調(diào)控作用的響應，因此希望通過不斷的探索和完善，PP 能早日大規(guī)模投入生產(chǎn)，實現(xiàn)其在反芻動物生產(chǎn)中的廣泛應用。