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        高效液相色譜法測定血液透析器中N-甲基吡咯烷酮

        2022-02-26 09:47:08沈永郭利娟薄曉文孟凱
        化學(xué)分析計量 2022年2期

        沈永,郭利娟,薄曉文,孟凱

        (山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗研究院,國家藥品監(jiān)督管理局生物材料器械安全性評價重點(diǎn)實(shí)驗室,山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評價重點(diǎn)實(shí)驗室,濟(jì)南 250101)

        近年來,隨著人口老齡化的加深,糖尿病、高血壓患者越來越多,致使終末期腎病急劇增加,從而導(dǎo)致腎臟替代治療的需求持續(xù)增長[1-3]。血液透析、腹膜透析和腎臟移植是目前現(xiàn)有的腎臟替代療法,其中血液透析普遍應(yīng)用于腎臟替代治療[4]。血液透析是治療急、慢性腎功能衰竭和某些急性藥物、毒物中毒的有效方法[5],主要是利用透析膜通過彌散及吸附等機(jī)理去除中小分子毒素,通過超濾和滲透清除體內(nèi)殘留過多的水分,達(dá)到血液凈化的目的[6]。血液透析器是血液透析系統(tǒng)的主要組成部分,通常由空心纖維(透析膜)、外殼、端蓋和醫(yī)用異氰酸酯密封膠組成。常見的高分子合成膜材料有聚砜、聚酰胺、醋酸纖維素等,其中聚砜膜具有優(yōu)良的生物相容性、良好的滲透性能等優(yōu)點(diǎn),因此被廣泛應(yīng)于血液透析器[7]。

        聚砜膜的生產(chǎn)工藝通常采用浸沒沉淀相轉(zhuǎn)換法[8-10]。聚砜材料在N-甲基吡咯烷酮(NMP)中可形成均相溶液,聚砜溶液與非溶劑相互作用形成聚砜膜。據(jù)研究報道,NMP 具有刺激作用和潛在的生殖毒性,經(jīng)吸收后,以消化系統(tǒng)為主要的靶器官,還有可能影響中樞系統(tǒng),從而影響人體機(jī)能[11-13]。血液透析器為三類高風(fēng)險醫(yī)療器械,臨床使用時與患者血液直接接觸,故血液透析器中殘留的NMP 可能會遷移至患者血液,從而給患者造成較高的安全風(fēng)險,所以需對血液透析器中NMP 溶出量進(jìn)行研究,以準(zhǔn)確評估血液透析器的安全性和有效性。

        目前,在藥物、紡織品及食品包裝材料中NMP的主要檢測方法有高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法[14-16]。目前尚無高效液相色譜法測定血液透析器中NMP 溶出量的報道,且無相關(guān)的測試方法標(biāo)準(zhǔn)。筆者以超純水為替代溶劑,模擬臨床使用條件浸提血液透析器中NMP 的溶出量,采用高效液相色譜法進(jìn)行測定。該方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、精密度及準(zhǔn)確度好,可測定血液透析器中NMP 的溶出量,以評估血液透析器中NMP 臨床接觸量,此外,該分析方法成本低,易于推廣,具有較好的應(yīng)用前景。

        1 實(shí)驗部分

        1.1 主要儀器與試劑

        高效液相色譜儀:Waters Arc 型,沃特世科技(上海)有限公司。

        滾壓泵:JHBP-2000 型,廣州市暨華醫(yī)療器械有限公司。

        電子天平 XP205 型,感量為0.01mg,瑞士梅特勒托利多集團(tuán)。

        pH 計:Seven Excellence 型,梅特勒-托利多(香港)控股有限公司。

        數(shù)顯電子恒溫水浴鍋:HH-8 型,常州國華電器有限公司。

        超純水系統(tǒng):Milli-Q A10 型,美國密理博公司。

        NMP 對照品:純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為99.8%,批號為9C-11-23,廣州佳途科技股份有限公司。

        甲醇、乙腈:色譜純,德國默克公司。

        磷酸:優(yōu)級純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

        磷酸二氫鉀、無水磷酸氫二鉀:分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

        實(shí)驗用水為超純水,由Milli-Q A10 型超純水系統(tǒng)制備。

        血液透析器樣品:山東新華醫(yī)療器械股份有限公司。

        1.2 溶液配制

        NMP 系列對照品工作溶液:精密稱取NMP 對照品54.19 mg 于50 mL 棕色容量瓶中,用超純水稀釋并定容至標(biāo)線,得質(zhì)量濃度為1.081 6 mg/mL的NMP 對照品儲備液,再用逐級稀釋法配制成NMP 的質(zhì)量濃度分別為0.054 08、0.108 2、0.216 3、0.540 8、1.08 2、2.163、5.408、10.82、21.63 μg/mL 的系列對照品工作溶液。

        磷酸鹽緩沖溶液:精密稱取磷酸二氫鉀2.085 0 g、無水磷酸氫二鉀0.217 5 g 于1 L 容量瓶中,用超純水溶解、稀釋,加入磷酸1.0 mL,再用超純水定容至標(biāo)線。

        1.3 色譜條件

        色譜柱:XSelect?HSS T3 柱(150 mm×4.6 mm,3.5 μm,美國沃特世公司);流量:0.5 mL/min;檢測波長:200 nm;柱溫:25 ℃;進(jìn)樣體積:100 μL;流動相:乙腈-磷酸鹽緩沖溶液(體積比為3∶97),洗脫方式:等度洗脫。

        1.4 樣品處理

        1.4.1 樣品供試液

        (1)預(yù)沖。參照血液透析器臨床使用說明書,按照血液透析器預(yù)沖示意圖(圖1)所示連接血液透析器及硅膠管路,形成2 個分別獨(dú)立的循環(huán)系統(tǒng),在玻璃燒杯中各加入1 000 mL 超純水,通過滾壓泵注滿整個閉路系統(tǒng),以200 mL/min 的流速分別沖洗血液透析器血液側(cè)與透析液側(cè),沖洗完畢后吹入氮?dú)馊コ和肝銎髦械囊后w。

        圖1 血液透析器預(yù)沖示意圖

        (2)浸提。按照血液透析器NMP 浸提示意圖(圖2)所示連接血液透析器及硅膠管路形成閉合循環(huán)系統(tǒng),溶劑瓶中加入500 mL 水,通過滾壓泵在(37±1) ℃下以200 mL/min 的流量循環(huán)5 h,循環(huán)完畢后將硅膠管路及血液透析器中浸提液轉(zhuǎn)移至溶劑瓶,溶劑瓶中加入水至溶液體積為600 mL,即得樣品供試液。

        圖2 血液透析器NMP 浸提示意圖

        1.4.2 空白對照液

        移取500 mL 水于溶劑瓶中,采用硅膠管形成閉合循環(huán)回路,通過滾壓泵在(37±1) ℃下以200 mL/min 的流量循環(huán)5 h,將循環(huán)管路中水轉(zhuǎn)移至溶劑瓶,溶劑瓶中加入水至溶液體積為600 mL,即得空白對照液。分別取樣品供試液、空白對照液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾,待測。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 色譜條件的選擇

        甲醇、乙腈、水、緩沖鹽為高效液相色譜常用流動相,磷酸緩沖鹽有助于改善色譜峰峰形,乙腈的紫外截止吸收波長較甲醇低,故選乙腈與磷酸鹽緩沖液為流動相。NMP 紫外最大吸收波長為200 nm,故選用200 nm 為檢測波長。NMP 極性較大,在色譜柱保留較弱,故選用XSelect?HSS T3 極性色譜柱為分析柱,以增強(qiáng)NMP 在色譜柱的保留。

        2.2 浸提方式與浸提溶劑的選擇

        血液透析器在臨床應(yīng)用時,血液側(cè)與人體直接接觸,透析液側(cè)與人體間接接觸。血液透析器為三類高風(fēng)險醫(yī)療器械,故因此將血液透析器的血液側(cè)與透析液側(cè)連接形成閉合回路進(jìn)行循環(huán)制備樣品供試液。NMP 易溶于水、乙醇、乙醚、丙酮等溶劑,考慮到血液透析器組成材料的耐受性以及經(jīng)濟(jì)環(huán)保等因素,選取超純水為浸提溶劑,以減少非目標(biāo)化合物干擾。

        2.3 專屬性試驗

        分別取適量空白對照液、NMP 對照品溶液及樣品供試液,按1.3 色譜條件分別測定,高效液相色譜圖見圖3。由圖3 可知,NMP 對照品溶液的保留時間約為7.8 min,樣品供試液中NMP 的保留時間與空白對照溶液基本一致,NMP 色譜峰峰形良好,與鄰近色譜峰分離度均大于1.5,空白對照液對分析測定無干擾,滿足試驗要求,表明該方法專屬性良好。

        圖3 高效液相色譜圖

        2.4 線性方程與檢出限

        取NMP 系列對照品工作溶液,按1.3 色譜條件進(jìn)行測定,以NMP 的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo),以色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,得NMP 的線性方程為y=807 374x+47 765,相關(guān)系數(shù)r=0.999 9,表明NMP 的質(zhì)量濃度在0.054 08~21.63 μg/mL 范圍內(nèi)與色譜峰面積的線性關(guān)系良好。

        用超純水對1.2 配制的NMP 對照品儲備液逐級稀釋并按1.3 色譜條件進(jìn)行測定,根據(jù)《中國藥典》2020 版9101 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則中信噪比法測定NMP 的檢出限和定量限[17]。當(dāng)NMP 的質(zhì)量濃度為0.027 04 μg/mL 時,信噪比約為3;當(dāng)NMP 的質(zhì)量濃度為0.054 08 μg/mL 時,信噪比約為10,故該方法NMP 的檢出限與定量限分別為0.027 04、0.054 08 μg/mL。

        2.5 精密度試驗

        移取質(zhì)量濃度分別為0.054 08、0.540 8、5.408 μg/mL 的NMP 對照品溶液,按照1.3 色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次進(jìn)行分析,試驗結(jié)果見表1。由表1 可知,3 個濃度水平6 次測定峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.086%~1.332%,表明該方法的精密度良好。

        表1 精密度試驗結(jié)果

        2.6 加標(biāo)回收試驗

        取適量樣品供試液,精密加入對照品溶液,制成低、中、高3 個濃度水平的加標(biāo)供試溶液,各平行制備3 份,按1.3 色譜條件進(jìn)行測定,試驗結(jié)果見表2。由表2 可知,NMP 3 個濃度水平的平均回收率為93.12%~95.13%,表明該方法準(zhǔn)確度良好,滿足《中國藥典》2020 版藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則中的規(guī)定。

        表2 加標(biāo)回收試驗結(jié)果

        2.7 樣品測定

        選取4 套血液透析器樣品,按照1.4 方法分別制備樣品供試液(編號分別為1#、2#、3#、4#),采用1.3色譜條件測定樣品供試液中NMP 的含量,結(jié)合樣品供試液制備方法,計算NMP 臨床接觸量,測定結(jié)果見表3。由表3 可知,單套血液透析器樣品中NMP 最大臨床接觸量為446.36 μg。根據(jù)GB/T 16886.17—2005 《醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第17部分:可瀝濾物允許限量的建立》對血液透析器中NMP允許限量進(jìn)行評估,血液透析器中NMP 的測定值在允許限量范圍內(nèi)[18]。

        表3 血液透析器中NMP 含量及臨床接觸量測定結(jié)果

        3 結(jié)語

        建立了高效液相色譜法測定血液透析器中N-甲基吡咯烷酮溶出量的分析方法,該方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、精密度及準(zhǔn)確度良好。采用該分析方法測定血液透析器中NMP 溶出量,以評估血液透析器中NMP 臨床接觸量,可用于血液透析器安全性風(fēng)險評估,為產(chǎn)品生產(chǎn)工藝控制提供參考,以及為監(jiān)管部門提供技術(shù)支持。

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