李夢怡，王宏偉，董喆，曹進

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

亞硝酸鹽是含有亞硝酸根陰離子的鹽，較常見的形式是亞硝酸鈉，它廣泛存在于人類生活環(huán)境中。食用亞硝酸鹽含量較高的腌制肉制品、泡菜及變質(zhì)的蔬菜可引起中毒。參考世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)公布的“致癌物清單初步整理”，在導(dǎo)致內(nèi)源性亞硝化條件下攝入的硝酸鹽或亞硝酸鹽在2A 類致癌物清單中［1］。

食品基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在分析質(zhì)量控制領(lǐng)域起到了舉足輕重的作用［2］。在食品安全國家抽檢工作中，承檢機構(gòu)被要求每一次檢驗均隨行檢測相應(yīng)基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為內(nèi)部質(zhì)量控制，以保證檢測結(jié)果的可靠性。通過國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源共享平臺查詢，我國暫無肉粉中亞硝酸鹽食品基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)出售。目前市場上出售食品基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的種類遠無法滿足檢驗質(zhì)量控制的需求，當(dāng)產(chǎn)品售罄后，補貨需要重新制備、定值、評估、申報，且供貨周期不穩(wěn)定。食品基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)市場長期處于供不應(yīng)求的狀態(tài)。

為監(jiān)控亞硝酸鹽的檢測能力，保證檢測結(jié)果有效、可靠，并且具有溯源性、可比性和準(zhǔn)確性，結(jié)合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和類似基質(zhì)標(biāo)物研制方法［3-9］，筆者研制了豬肉凍干粉中亞硝酸鈉成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可用于相關(guān)檢測實驗進行亞硝酸鈉分析方法的確認(rèn)和過程質(zhì)量控制，保證測試分析量值溯源鏈的有效性和不間斷性，并為研制食品基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)提供了可操作的流程實例。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

分光光度計：U 3900 型，單色光學(xué)系統(tǒng)，日立科學(xué)儀器（北京）有限公司。

電子分析天平：（1）AL 204 型，感量為0.1 mg；（2）XP 205 型，感量為0.01 mg，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司。

超純水系統(tǒng)：H2Opro-DI-B 型，德國賽多利斯公司。

離心機：HC 型，轉(zhuǎn)速大于5 000 r/min，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.7%，北京曼哈格生物科技有限公司。

亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰乙酸、硼酸鈉、鹽酸、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺：均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

實驗用水為超純水。

原料：新鮮市售豬肉。

1.2 溶液配制

精密稱取亞硝酸鈉10 mg（精確至0.1 mg），用水溶解并定容至10 mL，配制成亞硝酸鈉質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再用水稀釋成亞硝酸鈉質(zhì)量濃度為5.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品制備

亞硝酸鈉對濕度較為敏感，而豬肉的含水率很高，在儲存過程中，為了保證基質(zhì)不變質(zhì)且目標(biāo)物含量的穩(wěn)定，最終采用冷凍干燥方式將豬肉制備成凍干粉。選擇市售新鮮豬肉作為對照物質(zhì)的基體加工原料，滿足標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備具有代表性、消除基體效應(yīng)、均勻性、穩(wěn)定性保證等相關(guān)要求。對市售豬肉進行加標(biāo)浸泡、粉碎、混勻、凍干、均勻性初檢。制成約含亞硝酸鈉10 mg/kg 的粉末樣品，分裝為5 g/瓶，于塑料瓶密閉冷凍保存。

1.4 樣品處理

1.4.1 樣品復(fù)原

精密稱取1 g 樣品（精確至0.01 mg），置于150 mL 具塞錐形瓶中，以稱樣量4 倍質(zhì)量的比例加入超純水使其復(fù)原為肉糜，振搖使其充分混勻，浸泡30 min 以上。

1.4.2 提取與凈化

（1）提取。向1.4.1 復(fù)原液中加入12.5 mL 的50 g/L 的飽和硼砂溶液，再加入150 mL 溫度約為70 ℃的水，混勻，于沸水浴中加熱15 min，取出，置于冷水浴中，冷卻至室溫。

（2）凈化。定量轉(zhuǎn)移上述提取液，置于200 mL容量瓶中，加入5 mL 106 g/L 亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，再加入5 mL 220 g/L 乙酸鋅溶液以沉淀蛋白質(zhì)，用水稀釋并定容至標(biāo)線，搖勻，放置30 min，除去上層脂肪，上清液用濾紙過濾，棄去初濾液30 mL，濾液備用。

1.4.3 樣品測定

吸取1.4.2 中濾液40.0 mL，置于50 mL 帶塞比色管（試樣管）中；另分別吸取0.00、0.20、0.40、0.80、1.50、2.00 mL 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別置于50 mL 帶塞比色管（標(biāo)準(zhǔn)管）中。分別于標(biāo)準(zhǔn)管與試樣管中加入2 mL 4 g/L 對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5 min 后，再各加入1 mL 2 g/L 鹽酸萘乙二胺溶液，加水定容至標(biāo)線，混勻，靜置15 min，用1 cm 比色杯，以零管調(diào)節(jié)零點，于波長538 nm 處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線［10-12］。

1.5 樣品均勻性和穩(wěn)定性考察

分別參照CNAS-GL03: 2006 《能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南》、CNAS-GL017: 2018 《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法》、JJF 1343—2012 《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學(xué)原理》中關(guān)于均勻性、穩(wěn)定性檢驗的要求進行統(tǒng)計［13-15］。

1.5.1 均勻性檢驗

當(dāng)實驗樣品總數(shù)小于500 時，隨機抽取15 個樣品進行均勻性檢驗，每個樣品平行測定2 次。采用單因素方差分析，計算測定結(jié)果的F值，在95%置信區(qū)間內(nèi)，當(dāng)F值小于查表值Fα?xí)r，可認(rèn)為樣品是均勻的。

1.5.2 穩(wěn)定性檢驗

（1）短期穩(wěn)定性。樣品采用棕色塑料瓶包裝，屬于避光密封狀態(tài)，因此短期穩(wěn)定性主要考察在運輸過程中，高溫、高濕條件對豬肉粉中亞硝酸鈉含量的影響。按照目前的物流運輸速度，運輸時間一般不超過7 天。模擬在40 ℃、濕度為80%的極端條件下存放7 天后，對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行短期穩(wěn)定性研究。以均勻性檢測結(jié)果為短期穩(wěn)定性0 點，分別在第1、3、7 天取樣，每次取3 份樣品，每份樣品檢測2 次，采用t檢驗法評定樣品的短期穩(wěn)定性。

（2）長期穩(wěn)定性。按照先密后疏的考察原則設(shè)置不同的采樣時間點，采用同步穩(wěn)定性評估方法進行穩(wěn)定性分析。以均勻性檢測結(jié)果為長期穩(wěn)定性0點，按推薦方式儲存樣品。分別在第1、2、4、6 月取樣，每次取3 份樣品，每份樣品檢測2 次，采用t檢驗法評定樣品的長期穩(wěn)定性。

1.6 定值方法

分別參照J(rèn)JF 1343—2012 《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學(xué)原理》、ISO GUIDE 35: 2017 《均勻性和穩(wěn)定性表征和評估用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)指南》，采用同一種方法多家實驗室聯(lián)合定值的方式對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行定值。選擇7 家在行業(yè)領(lǐng)域中經(jīng)驗豐富且經(jīng)國家認(rèn)證的檢測實驗室或檢測中心，分別向每個定值實驗室提供肉粉空白樣品和陽性樣品各不少于4 份，每個樣品分別平行測定2 組數(shù)據(jù)。各定值機構(gòu)向中國食品藥品檢定研究院提供不少于8 組測量數(shù)據(jù)。同時，定值過程中，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制單位制定了明確的定值方案，并要求隨行做加標(biāo)回收試驗，以確保各實驗室定值結(jié)果可靠、穩(wěn)定。

剔除離群值后，計算出各實驗室檢測結(jié)果中位值的中位值，該總體中位值即樣品的定值結(jié)果。

1.7 不確定度的評定

1.7.1 指定值的不確定度計算

計算各協(xié)作定值單位結(jié)果的中位值，記為Ni。以這些中位值的中位值作為指定值，記為X。計算N1、N2…Ni與X之差的絕對值，記為Q1、Q2…Qi，其中位值記為Qm。協(xié)作定值引入的不確定度按照公式(1)計算：

1.7.2 均勻性的不確定度計算

均勻性的不確定度及相對不確定度分別按公式(3)、(4)計算，結(jié)果見表6。

1.7.3 長期穩(wěn)定性的不確定度計算

將穩(wěn)定性檢驗結(jié)果按時間-濃度做線性擬合，計算擬合直線殘差為斜率不確定度，如公式(5)。按公式(6)、(7)分別計算長期穩(wěn)定性的不確定度和相對不確定度。

1.7.4 合成不確定度計算

以定值、均勻性、穩(wěn)定性引入的不確定度計算標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的合成相對不確定度，按公式(8)計算。按照公式(9)計算標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)合成不確定度。在95%的置信區(qū)間，取包含因子k=2，按照公式(10)計算標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的擴展不確定度。

2 結(jié)果與分析

2.1 均勻性檢驗結(jié)果

按1.5 方法進行樣品均勻性檢驗，采用單因素方差分析方法對樣品測定結(jié)果進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，肉糜樣品中亞硝酸鈉含量測定結(jié)果如表1 所示，F(xiàn)檢驗分析結(jié)果如表2 所示。

表1 肉糜樣品中亞硝酸鈉含量測定結(jié)果 mg/kg

表2 肉糜樣品中亞硝酸鈉含量測定方差分析結(jié)果

查表得F0.05(14，15)=2.42，豬肉粉中亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的F計算值為1.95，F(xiàn)＜F0.05(14，15)，表明在95%置信區(qū)間內(nèi)，研制的豬肉粉中亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品均勻性良好。

2.2 穩(wěn)定性檢驗結(jié)果

2.2.1 短期穩(wěn)定性

按1.5.2 方法進行樣品短期穩(wěn)定性檢驗，檢測結(jié)果見表3。

表3 亞硝酸鈉短期穩(wěn)定性檢測結(jié)果

以均勻性檢測結(jié)果為穩(wěn)定性0 天，采用t檢驗法評定樣品的短期穩(wěn)定性。由表3 可知，短期穩(wěn)定性的t值均小于查表值，表明在40 ℃、濕度為80%的極端條件下，研制的豬肉粉中亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在7 天內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.2.2 長期穩(wěn)定性

按照1.5.2 方法進行樣品長期穩(wěn)定性檢驗，檢測結(jié)果見表4。以均勻性檢測結(jié)果為穩(wěn)定性0 天，與穩(wěn)定性3 個月次的檢測結(jié)果（表4）以時間-濃度做線性擬合，并做回歸方差分析（表5）。

表4 長期穩(wěn)定性檢測結(jié)果 mg/kg

表5 長期穩(wěn)定性檢測回歸方差分析（95%置信水平）

由表5 可知，在95%的置信水平，斜率的P值大于0.05，說明研制的豬肉粉中亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在6 個月內(nèi)穩(wěn)定性良好［15］。

2.3 協(xié)作定值結(jié)果及離群值檢驗

發(fā)放協(xié)作定值樣品，按照1.6 方法進行定值，回收各協(xié)作單位定值檢測結(jié)果，其中單位A～F 與樣品制備方H 均返回8 個檢測數(shù)據(jù)，單位G 返回10 個檢測數(shù)據(jù)，協(xié)作定值結(jié)果見表6。

表6 協(xié)作定值結(jié)果 mg/kg

采用格拉布斯（Grubb’s）檢驗，對8 家協(xié)作定值單位的實驗室內(nèi)檢測結(jié)果進行離群值檢驗，檢驗結(jié)果見表7。由表7 可知，格拉布斯法組內(nèi)可疑值檢驗νi/S均小于查表值λ(0.05，8)=2.126，未觀測到組內(nèi)離群值。

表7 格拉布斯法組內(nèi)可疑值檢驗結(jié)果

采用狄克森檢驗對對8 家定值單位（7 家協(xié)作定值單位和樣品制備方H）的實驗室間檢驗結(jié)果的一致性進行評價，檢驗結(jié)果見表8。由表8 可知，狄克森檢驗對組間數(shù)據(jù)進行離群值檢驗，r1及rn值均小于查表值f(0.05，8)=0.608，未觀測到組間離群值。

表8 狄克遜法組間顯著性差異檢驗

采用科克倫檢驗對組間數(shù)據(jù)做等精度檢驗，檢驗結(jié)果見表9。由表9 可知，單位測定數(shù)據(jù)C值小于臨界值C(0.05,8,8)=0.318 5，各組數(shù)據(jù)等精度，可保留所有數(shù)據(jù)。

表9 科克倫法組間等精度檢驗

2.4 定值不確定度的計算

按照1.7 方法進行豬肉粉中亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值不確定度計算。定值過程引入的不確定度計算結(jié)果見表10。

表10 豬肉粉中亞硝酸鈉協(xié)作定值計算結(jié)果

豬肉粉中亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)協(xié)作定值、均勻性、穩(wěn)定性引入的不確定度計算結(jié)果見表11。

表11 不確定度計算結(jié)果

按95%的置信區(qū)間，取包含因子k=2，按照公式(10)計算豬肉粉中亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的擴展不確定度為1.01 mg/kg。

2.5 豬肉粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果

分別經(jīng)過均勻性檢驗、穩(wěn)定性檢驗以及8 家實驗室協(xié)作定值，最終確定豬肉粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中亞硝酸鈉的定值結(jié)果（以肉糜計）為（10.35±1.01） mg/kg（k=2）。

3 結(jié)語

制備了豬肉粉中亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。采用鹽酸萘乙二胺法對樣品中亞硝酸鈉含量進行測定。樣品均勻性和穩(wěn)定性滿足標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備要求，經(jīng)8 家實驗室協(xié)作定值，并對定值結(jié)果的不確定度進行評估，最終確定該樣品中亞硝酸鈉的定值結(jié)果（以肉糜計）為（10.35±1.01） mg/kg（k=2）。研制的豬肉粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具備做豬肉粉中亞硝酸鈉檢測基體參考物質(zhì)的使用條件［16］。