王海城，劉 宇，葉 薈，倪 琳，曹 英，孫云龍，肖 冰，馬彩霞，唐利芳

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院上海市兒科醫(yī)學(xué)研究所小兒內(nèi)分泌與遺傳代謝病研究室，上海 200092；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院兒科，上海 201700

性別發(fā)育分化包括染色體性別確定、性腺分化與形成及內(nèi)外生殖管道的發(fā)育，以高度有序的組織特異性和時(shí)間依賴性的方式誘導(dǎo)性發(fā)育。任何影響性別決定和性別分化過程的基因缺陷都可能導(dǎo)致性發(fā)育障礙（disorders of sex development，DSD）。根據(jù)染色體核型，DSD可分為3種類型：46，XX DSD、46，XY DSD和性染色體DSD。其中46，XY DSD 患者臨床表現(xiàn)異質(zhì)性大，根據(jù)性腺分化異常的程度不同，分為46，XY完全性性腺發(fā)育不全（46，XY complete gonadal dysgenesis，46，XY CGD）和46，XY 部分性性腺發(fā)育不全（46，XY partial gonadal dysgenesis， 46，XY PGD）。46，XY CGD臨床特征為女性表型，原發(fā)閉經(jīng)，青春期乳房不發(fā)育，外生殖器幼稚，子宮、輸卵管、陰道發(fā)育不良，無睪丸，正常苗勒管結(jié)構(gòu)和條索狀性腺［1］。目前已發(fā)現(xiàn)30余個(gè)DSD 相關(guān)基因，多由SRY、NR5A1（SF1）、SOX9、DHH、GATA4、WT1、ZFPM2、WWOX等基因突變，DMRT1、SF1、WT1的單拷貝基因表達(dá)或NR0B1、WNT4基因重復(fù)所致［2-4］。其中SRY、NR5A1基因突變?cè)?6，XY DSD 患者中各占10%～15%［5］，MAP3K1基因突變占10%～18%［6］。以往通過病史、激素水平、影像資料、染色體核型分析及對(duì)致病基因Sanger測(cè)序診斷DSD；但因發(fā)病機(jī)制尚不清楚，基因型與表型相關(guān)性較差，僅有20%的DSD患者可得到明確的分子診斷。隨著染色體微陣列（chromosome microarray，CMA）和二代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）等高通量分子診斷技術(shù)的發(fā)展，遺傳病因不明的DSD 患者的診斷率大大提高。NGS 技術(shù)包括外顯子組測(cè)序（whole exome sequencing， WES） 和靶向基因測(cè)序 （target sequencing，TS）等。WES 捕獲蛋白質(zhì)編碼區(qū)的核苷酸序列，測(cè)序較全面；而TS捕獲已知的特定基因或候選基因組區(qū)域的外顯子、內(nèi)含子和部分調(diào)控序列，基因覆蓋范圍較深，檢測(cè)成本低。46，XY DSD 患者TS/WES測(cè)序的診斷率為35%～69%［2-3，7-9］。國(guó)內(nèi)一項(xiàng)研究應(yīng)用靶向基因Panel對(duì)87例46，XY DSD患者進(jìn)行高通量基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)AR、NR5A1和SRD5A2基因突變較常見，比例分別為35.0%、21.7%和21.7%［10］。CMA的優(yōu)勢(shì)是可以檢測(cè)到小而隱秘的拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNVs）。一項(xiàng)研究應(yīng)用靶向微陣列篩選了116 例46，XX 和46，XY DSD 患者，檢測(cè)出21.5%的CNVs［11］。本研究對(duì)9例46，XY CGD 患者先行常規(guī)的SRY基因測(cè)序、染色體核型分析，在未發(fā)現(xiàn)SRY致病突變時(shí)進(jìn)一步應(yīng)用高通量的測(cè)序技術(shù)如CMA、WES或TS進(jìn)行分析，以期更精確、全面了解患者發(fā)病的分子遺傳病因。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2010—2017 年就診于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院遺傳咨詢門診的9 例46，XY CGD 患者（P1～P9）的臨床資料?；颊叩纳鐣?huì)性別均為女性，具體臨床表型見表1。本研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（XHEC-D-2021-186）。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 染色體核型分析 將新鮮的肝素抗凝外周血1 mL 加入到10 mL 含20% 小牛血清（Invitrogen Gibco，美國(guó)）的RPMI1640 培養(yǎng)基液中，置于5%二氧化碳培養(yǎng)箱（37 ℃）培養(yǎng)72 h，收獲前1 h 加入終濃度為8×10-5g/L 的秋水仙素。收獲中期淋巴細(xì)胞，依次進(jìn)行低滲、固定、制片、胰酶處理、Giemsa 染色，光學(xué)顯微鏡［CX21，奧林巴斯（中國(guó)）有限公司，中國(guó)］下觀察染色體G顯帶。制片后配置硝酸銀溶液，Giemsa 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察N 顯帶。鏡下分析50個(gè)染色體中期分裂相，鏡下配對(duì)分析5個(gè)中期核型，核型描述按《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制》（ISCN2009）。

1.2.2 DNA 提取和SRY測(cè)序 抽取先證者和父母EDTA 抗凝外周血。使用QIAampDNA Blood Mini 試劑盒（Qiagen，美國(guó)）按照標(biāo)準(zhǔn)步驟提取DNA。利用特異引物通過PCR 擴(kuò)增SRY基因整個(gè)編碼區(qū)［12］，擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用ABI （Applied BioSystem，美國(guó)）3700XL進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 采用單核苷酸多態(tài)性陣列進(jìn)行CNVs 分析 2個(gè)家族樣本DNA 應(yīng)用SNP 6.0 芯片（Affymetrix，美國(guó)）按照制作商提供的標(biāo)準(zhǔn)化流程進(jìn)行拷貝數(shù)分析。采用Affymetrix CytoScanTM750k 芯片（Santa Clara，美國(guó)）分析2 例散發(fā)患者的CNVs。使用染色體分析軟件（ChAS）1.2.2（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）分析樣本的染色體CNVs。染色體位置信息參照GRCh 37/Hg19。

1.2.4 TS/WES 測(cè)序 本研究中使用的DSD Panel 的設(shè)計(jì)和操作標(biāo)準(zhǔn)參照相關(guān)文獻(xiàn)［8］。共捕獲并測(cè)序了2 972 個(gè)外顯子，共219 個(gè)基因的1 078 042 個(gè)堿基。參照XIE 等［13］的方法進(jìn)行靶向基因組捕獲和NGS，參照SUN 等［14］的方法行WES 檢測(cè)。結(jié)果顯示：病例P2、P6 和P9 的SRY基因測(cè)序點(diǎn)突變陰性，未發(fā)現(xiàn)致病突變。對(duì)該3 例早期收集的散發(fā)患者，采用高通量TS篩查致病基因；后期收集的2例患者（P7和P8）在未檢測(cè)到SRY致病突變后，應(yīng)用WES 進(jìn)行高通量檢測(cè)。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 高通量測(cè)序原始數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控、比對(duì)、去重等步驟，應(yīng)用GATK （Version 3）（Broad Institute，美國(guó)）檢測(cè)單核苷酸變異（single nucleotide variation， SNV） 和插入缺失標(biāo)記（insertion-deletion，indel），將高頻的變異［在千人基因組項(xiàng)目、人群基因組突變頻率數(shù)據(jù)庫（gnomAD）和Exome Variant Server（EVS）中頻率＞1%或包含500 個(gè)外顯子的當(dāng)?shù)財(cái)?shù)據(jù)庫中頻率＞5%］從候選的變異中過濾掉。候選突變經(jīng)過逐級(jí)評(píng)估后，根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（The American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）指南進(jìn)行分類［15］。采用PhastCons軟件對(duì)家族病例內(nèi)含子的缺失片段進(jìn)行保守區(qū)段分析并予以保守性計(jì)分。

2 結(jié)果

9 例46，XY CGD 先證者通過SRY基因測(cè)序，4 例患者（P1、P3、P4、P5）檢測(cè)出明確SRY致病/疑似致病變異。其中2個(gè)為已知致病突變［NM_003140.1：c.264dup（P3）和NM_003140.1：c.169C＞T（P4）］，其余2 個(gè)為未見報(bào)道的致病/疑似致病突變［SRY缺失突變（P1）和NM_003140.1：c.208T＞C（P5）］。

NGS 測(cè)序發(fā)現(xiàn)P9 患者攜帶MAP3K1基因的NM_005921.1：c.1016G＞A 疑似致病突變?；颊逷6 因SRY基因測(cè)序點(diǎn)突變陰性，經(jīng)Affymetrix CytoScan芯片檢測(cè)未檢出致病性CNVs；為進(jìn)一步明確有無致病變異，采用TS 測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)該患者攜帶HSD17B3基因的c.590T＞C 錯(cuò)義雜合突變，該突變臨床意義不明?；颊逷2 經(jīng)核型分析、DSD 常見致病基因測(cè)序未檢出致病突變，進(jìn)一步行NGS 檢測(cè)未檢出明確致病突變，芯片檢測(cè)未檢出明確致病性CNVs。

芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)2個(gè)家族病例（P7和P8）的DMRT1基因內(nèi)含子2的片段缺失。該家系是一對(duì)46，XY CGD姐妹，其父母為近親，其系譜如圖1所示。首先對(duì)SRY基因編碼區(qū)進(jìn)行測(cè)序，未檢測(cè)到任何突變。為進(jìn)一步篩查疾病相關(guān)基因，對(duì)妹妹DNA 進(jìn)行高通量WES，仍未發(fā)現(xiàn)已知基因的致病突變或可能與性發(fā)育相關(guān)的基因變異。遂采用SNP 6.0芯片對(duì)先證者和妹妹的基因組DNA 進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)9p24.3基因片段中DMRT1內(nèi)含子2 中約14 kb 純合缺失（Chr9：866，388-880，086，hg19），因純合缺失范圍大，考慮可能為疑似致病變異（圖2）。對(duì)其缺失片段進(jìn)一步驗(yàn)證，設(shè)計(jì)一組引物位于2 個(gè)斷點(diǎn)外（F1-AGATCCGTTTGATTTTAGACAGC；R1-AGGGCCATCGTTTTAAACTCA），另一組包含末端缺失斷點(diǎn)（F2-TTGTGCCCATACATTCAAGCC；R1-AGGGCCATCGTTTTAAACTCA），見圖3。引物F1-R1 在2 個(gè)姐妹及其雙親中均擴(kuò)增出700～800 bp 的基因片段（圖4），而F2-R1 僅在雙親中擴(kuò)增出800～900 bp 的基因片段（圖5）。最后，對(duì)F1-R1 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，發(fā)現(xiàn)低拷貝重復(fù)區(qū)（low copy repeats，LCR）位于缺失片段的兩側(cè)，提示可能LCR介導(dǎo)的基因重排。應(yīng)用PhastCons軟件進(jìn)一步對(duì)內(nèi)含子2中缺失片段進(jìn)行保守性分析，發(fā)現(xiàn)2個(gè)保守的非編碼元件（conserved non-coding elements，CNEs）；最保守的CNE 的PhastCons LOD 得分為524，得分第二的CNE 的PhastCons LOD 得分為325。9 例CGD 患者的分子遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 9例CGD患者的臨床特征和分子遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果Tab 1 Phenotypic description and genetic findings in 9 patients

Continued Tab

圖1 兩姐妹（P7和P8）先證者的家系譜Fig 1 Family pedigree of two sisters(P7 and P8)

圖2 CMA檢測(cè)出DMRT1內(nèi)含子2中約14 kb純合缺失Fig 2 An approximate 14 kb homozygous deletion in intron 2 of DMRT1 by CMA

圖3 F1-R1和F2-R1擴(kuò)增產(chǎn)物驗(yàn)證CMA結(jié)果Fig 3 Amplified products of F1-R1 and F2-R1 verify CMA result

圖5 F2-R1僅在親本中擴(kuò)增出的800～900 bp基因片段Fig 5 800-900 bp product amplified by F2-R1 only in parents

3 討論

本研究中，經(jīng)過分子遺傳學(xué)檢測(cè)，9 例46，XY CGD 患者中，5 例獲得了明確的分子遺傳學(xué)病因診斷。有研究［9］表明表型嚴(yán)重的CGD 患者基因異常檢出的頻率較高。EGGERS 等［3］在24 例46，XY CGD患者中，共發(fā)現(xiàn)11例具有致病性變異。

在本次小樣本分析中，SRY突變相對(duì)常見。我們?cè)?例患者中發(fā)現(xiàn)了SRY基因致病/疑似致病變異?；颊逷1 確定為SRY缺失，患者P3 和P4 為SRY基因截短突變，患者P5 為SRY一個(gè)新的錯(cuò)義變異（NM_003140.1：c.208T＞C）。SRY是引發(fā)性腺發(fā)育成睪丸的最重要的性別決定基因［4］。在人類基因突變數(shù)據(jù)庫中記錄了100余種SRY突變，其中包括錯(cuò)義/無義插入缺失突變、小片段插入/缺失突變及大型片段插入/缺失突變。人類SRY編碼區(qū)翻譯204 個(gè)氨基酸，包含3 個(gè)功能區(qū)域：N-末端、中心域（DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域）和C-末端。中心結(jié)構(gòu)域由編碼高遷移率族蛋白（high mobility group，HMG） 的79 個(gè)氨基酸組成。在高度保守的HMG 盒已發(fā)現(xiàn)較多新發(fā)突變，同時(shí)在SRY的其他區(qū)域鑒別出小部分突變。在本研究中，病例P3、P4 和P5 突變涉及SRY基因關(guān)鍵的HMG 盒區(qū)，病例P1突變發(fā)生在SRY其他區(qū)域。

本研究中患者P6攜帶HSD17B3基因c.590T＞C 雜合突變，為一新發(fā)突變，位于外顯子8，ACMG 評(píng)級(jí)為臨床意義不明變異。HSD17B3基因位于人類染色體9q22，包含11 個(gè)外顯子，編碼17β-羥基類固醇脫氫酶3 （17β-hydroxysteroid dehydrogenase 3，17β-HSD3）。該酶參與雄激素合成，是一種含有310 個(gè)氨基酸的微粒體酶，主要在睪丸中表達(dá)，在輔助因子的作用下轉(zhuǎn)化為睪酮。17β-HSD3 缺乏癥是由HSD17B3基因突變引起的46，XY DSD 的罕見常染色體隱性疾病。國(guó)內(nèi)有一項(xiàng)研究［10］，在中國(guó)46，XY DSD 患者中檢測(cè)到HSD17B3突變率為4.9%，相較英國(guó)、美國(guó)和土耳其人群突變率低。一項(xiàng)國(guó)內(nèi)研究［16］在3 例46，XY DSD 患者中發(fā)現(xiàn)該基因2 個(gè)新發(fā)突變（c.852G＞A和c.124_127delTCTT）。本例樣本僅檢出1 處意義不明變異，根據(jù)隱性遺傳規(guī)律，這一雜合突變無法解釋患者的表型。

患者P9 經(jīng)基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)1 個(gè)既往報(bào)道過的MAP3K1基因外顯子4 的突變位點(diǎn)c.1016G＞A （p.Arg339Gln）［2］。MAP3K1是一個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，是調(diào)控睪丸特異性發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)蛋白網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵成分［6］。MAP3K1突變所致臨床表現(xiàn)有很大的異質(zhì)性，包括從CGD 到尿道下裂的多種表型［2-3，17］?；仡櫼酝鶊?bào)道的MAP3K1突變病例，10%～18%的46，XY DSD 患者由MAP3K1致病突變引起，尤其是46，XY CGD 或46，XY PGD 個(gè)體；MAP3K1致病突變是導(dǎo)致完全或部分性腺發(fā)育異常的46，XY DSD 最常見的原因之一［6］。

P7 和P8 兩姐妹檢出9p24.3 上同一片段缺失。目前，尚未見此片段缺失的文獻(xiàn)報(bào)道。9p 缺失綜合征的性別反轉(zhuǎn)候選區(qū)域已縮小到9p24.3 區(qū)域，且DMRT1和DMRT3為主要的候選基因［18］。DMRT1是決定性別和性發(fā)育的關(guān)鍵基因之一，其編碼具有鋅指DNA 結(jié)合區(qū)域的男性特定轉(zhuǎn)錄因子。LEDIG等［19］在1 例46，XY DSD 兩性畸形的女性患者中檢測(cè)到約35 kb 的片段缺失，該缺失突變?yōu)橛绊慏MRT1基因外顯子3 和4 的最小缺失，表明單獨(dú)DMRT1突變足以引起XY DSD。MELLO 等［20］報(bào)道了1 例XY 部分性腺發(fā)育不良患者的DMRT13'UTR中存在一個(gè)核苷酸插入突變，因此推測(cè)DMRT1非編碼區(qū)可能存在的未檢測(cè)到的突變改變了DMRT1的表達(dá)。近年來，多項(xiàng)研究表明，多種疾病相關(guān)基因的內(nèi)含子突變可影響信使mRNA 剪接［21-22］；若缺失區(qū)域包含保守區(qū)域，也可影響基因的表達(dá)［23］。為尋找14 kb 區(qū)域內(nèi)的保守片段，本研究采用UCSC基因組瀏覽器提供的PhastCons 軟件，其對(duì)于保守片段的出現(xiàn)更敏感。在MULTIZ 創(chuàng)建的多個(gè)脊椎動(dòng)物基因組序列中進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)的2 個(gè)CNEs，LOD 得分較高，序列保守性強(qiáng)，因此推測(cè)，患者DMRT1內(nèi)含子2 的突變可能會(huì)影響DMRT1的表達(dá)。然而，因缺失片段（約14 kb）太大，無法預(yù)測(cè)潛在的剪接元件或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，而這些位點(diǎn)在功能上有重要作用。遺憾的是，我們沒有取得患者的組織來檢測(cè)DMRT1的表達(dá)。DMRT1非編碼區(qū)的變異可能是該家族的致病候選基因，但沒有進(jìn)一步的證據(jù)支持這一假設(shè)。

本研究表明SRY突變?yōu)?6，XY CGD 較常見的原因，逐步分析46，XY CGD 患者的遺傳病因有助于全面了解46，XY CGD 患者的分子病因，從而可為臨床咨詢和決策提供依據(jù)。