張 劍，宋 菲，王西樵

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院燒傷科，上海 200025

增生性瘢痕的發(fā)生機(jī)制尚未明晰，一直是臨床難以解決的問(wèn)題，缺乏有效的治療手段。然而值得注意的是，增生性瘢痕臨床上雖未經(jīng)治療，但多年后可能自行消退，變平變軟。細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是增生性瘢痕消退成熟最主要的方式［1］。研究表明，瘢痕中存在嚴(yán)重的缺血缺氧環(huán)境［2］，而缺血缺氧是細(xì)胞產(chǎn)生自噬的重要因素［3］。自噬是細(xì)胞在缺氧和缺營(yíng)養(yǎng)條件下，通過(guò)吞噬自身細(xì)胞器，消化后獲取能量，維持細(xì)胞代謝活動(dòng)的一種生存方式。生理狀態(tài)的自噬促進(jìn)細(xì)胞的存活，長(zhǎng)時(shí)間自噬或過(guò)度自噬可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡，稱為自噬性死亡。目前大多數(shù)研究認(rèn)為自噬是細(xì)胞凋亡的上游啟動(dòng)因素，高水平的自噬導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［4-5］。在瘢痕組織的消退過(guò)程中，自噬是否是細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)因素尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。此外，相關(guān)研究［6-8］還發(fā)現(xiàn)另外一種自噬性死亡的方式，它沒(méi)有發(fā)生細(xì)胞凋亡但具有獨(dú)特的形態(tài)特征，稱為自噬性溶解死亡。因此，本研究重點(diǎn)探索瘢痕消退過(guò)程中是否發(fā)生了自噬性溶解死亡，以期對(duì)未來(lái)瘢痕的治療提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象、試劑與儀器

1.1.1 研究對(duì)象 收集上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院燒傷科2018 年6 月—2019 年6 月燒傷患者16例的瘢痕組織。納入標(biāo)準(zhǔn)［9］：①增生性瘢痕發(fā)生時(shí)間為3～6 個(gè)月，表現(xiàn)為深紅色、厚度增加、瘙癢和疼痛。②消退期瘢痕發(fā)生時(shí)間為2 年左右，瘢痕厚度變薄，瘙癢和疼痛減輕。排除標(biāo)準(zhǔn)：①瘢痕感染。②瘢痕潰瘍。③瘢痕疙瘩。④糖尿病。⑤高血壓。根據(jù)患者增生性瘢痕發(fā)生時(shí)間分為增生期瘢痕（對(duì)照組）和消退期瘢痕（試驗(yàn)組）2 組，每組8 例。試驗(yàn)獲上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)為2021臨倫審第15號(hào)）。所有患者知情同意并簽署同意書(shū)。

1.1.2 試劑與儀器 DMEM 培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS）、胎牛血清（FCS）均購(gòu)自美國(guó)GIBCO 公司。0.1% Triton X-100、1%牛血清白蛋白、兔抗小鼠二抗、 小鼠抗兔二抗、 3- 甲基腺嘌呤 （3-methlyadenine，3-MA）均購(gòu)自北京索萊寶公司。微管相關(guān)蛋白輕鏈-3（microtuble-associated protein light chain 3，LC3）、低氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor 1，HIF-1）、beclin-1、半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、 caspase-9， BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒（BCA Protein Assay Kit） 均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司。4'，6'- 二脒基-2- 苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、單丹磺酰尸胺（monodansylcadaverin，MDC）檢測(cè)試劑盒、Calcein/PI熒光染料試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

透射電子顯微鏡（HT7700，日本日立公司），熒光顯微鏡（CFM-500，德國(guó)蔡司公司），缺氧培養(yǎng)箱（日本三洋公司），流式細(xì)胞儀（FC-500，美國(guó)貝克曼公司）。

1.2 方法

1.2.1 透射電鏡觀察瘢痕組織的超微結(jié)構(gòu)變化 瘢痕組織標(biāo)本用2.5%戊二醛和1%硫酸先后各固定2 h。然后將樣品以30%、50%、70%、80%、90%，100%乙醇梯度脫水，各10 min，然后浸泡、包埋在環(huán)氧樹(shù)脂中，切片成60 nm 的超薄切片。切片用醋酸鈾酰和檸檬酸鉛溶液染色。在75 kV 常規(guī)電壓下，用透射電鏡觀察瘢痕組織內(nèi)成纖維細(xì)胞的自噬情況。

1.2.2 瘢痕組織成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng) 將取下的2組患者的瘢痕組織立即放入DMEM 培養(yǎng)基中，送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行快速處理，碘伏消毒5 min，PBS 沖洗3 次，各5 min。用手術(shù)刀去除瘢痕表皮和剩余的脂肪組織，切成1 mm2的組織片。將組織片放入裝有DMEM 和10%FCS 的培養(yǎng)瓶中，并在37 ℃下于5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。1 周后，將孵育出的成纖維細(xì)胞遷移出組織片。2 周后，成纖維細(xì)胞匯合并進(jìn)行2～6 次傳代，供后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.2.3 建立細(xì)胞缺氧缺血模型 將匯合率為80%的成纖維細(xì)胞置于缺營(yíng)養(yǎng)和缺氧條件中，參照以往文獻(xiàn)（正常培養(yǎng)條件為10%FCS+21%O2），將培養(yǎng)條件設(shè)置為0.5% FCS+0.5% O2，模擬消退期瘢痕內(nèi)的缺血缺氧環(huán)境［7］，分別于0、12、24、48 h 收集成纖維細(xì)胞。分別做作電鏡觀察、免疫熒光、活細(xì)胞/死細(xì)胞檢測(cè)等。

另外，同上述成纖維細(xì)胞的缺營(yíng)養(yǎng)和缺氧培養(yǎng)條件，試驗(yàn)組在24 h 和/或48 h 時(shí)相點(diǎn)加入終濃度為30 μg/mL 的3-MA，對(duì)照組加入等量PBS，分別于0、12、24、48 h收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞自噬性溶解死亡和凋亡，Western blotting 檢測(cè)HIF-1、beclin-1、LC3和caspase-3、caspase-9的表達(dá)。

1.2.4 細(xì)胞死亡的測(cè)定 研究用Calcein/PI 熒光染料試劑盒檢測(cè)活/死細(xì)胞，觀察缺氧和缺營(yíng)養(yǎng)對(duì)成纖維細(xì)胞死亡的影響。具體步驟為：收集細(xì)胞，去上清液，用PBS 清洗細(xì)胞3 次；再用PBS 制備細(xì)胞懸液（1×105細(xì)胞/mL）；取100 μL 染色液加入200 μL 細(xì)胞懸液內(nèi)，混勻；37 ℃溫箱孵育15 min。熒光顯微鏡觀察和拍照，綠色熒光代表活細(xì)胞，紅色熒光代表死亡細(xì)胞。

1.2.5 免疫熒光檢測(cè) LC3 是公認(rèn)的自噬標(biāo)志物，在自噬通路中發(fā)揮核心作用，并促進(jìn)自噬小體的形成。試驗(yàn)用LC3 和Annexin V 來(lái)標(biāo)記細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡。收集成纖維細(xì)胞，4%甲醛中固定，PBS洗滌，并在室溫下用0.1% Triton X-100 滲透15 min。用1%牛血清白蛋白（1% BSA）阻斷后，用抗LC3 抗體（工作濃度1∶200）室溫孵育1 h。LC3標(biāo)記的兔抗小鼠二抗（工作濃度1∶100）在室溫下取樣1 h，然后用DAPI 染色。根據(jù)說(shuō)明書(shū)，使用TUNEL 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

選取手術(shù)室急診患者110例作為研究對(duì)象，根據(jù)護(hù)理方法將其分成兩組。其中，對(duì)照組男28例，女25例，年齡34～72歲，平均年齡（53.85±4.72）歲；觀察組男29例，女28例，年齡31～74歲，平均年齡（54.28±4.51）歲。兩組患者的一般資料對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 自噬的特征是自噬小體的形成，自噬小體包含一種酸性囊泡細(xì)胞器（acidic vesicle organelle，AVO），MDC可用于檢測(cè)AVO的形成，作為檢查自噬的發(fā)生。因此，為了區(qū)分凋亡和自噬性溶解死亡，我們使用MDC 熒光和PI 染色標(biāo)記自噬性死亡細(xì)胞，使用Annexin-V 和PI染色標(biāo)記凋亡細(xì)胞，最后通過(guò)計(jì)算，自噬性死亡細(xì)胞減去細(xì)胞凋亡細(xì)胞得出自噬性溶解死亡數(shù)量。按照說(shuō)明書(shū)，收集和孵育細(xì)胞后，用藍(lán)色（λ=488 nm）激發(fā)光照射細(xì)胞，產(chǎn)生紅色熒光（λ=650 nm，胞漿）和綠色熒光（λ=510～530 nm，細(xì)胞核），用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡和自噬性死亡細(xì)胞的數(shù)量。

1.2.7 Western blotting 分析 凋亡一般以caspase 的激活為特征，caspase-3 和caspase-9 表達(dá)升高是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志。因此，為了研究缺氧和缺營(yíng)養(yǎng)過(guò)程中自噬和凋亡相關(guān)基因的變化，我們采用Western blotting檢測(cè)HIF-1、beclin-1、LC3、caspase-3 和caspase-9 的表達(dá)。按照以上培養(yǎng)條件，將細(xì)胞接種在75 cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。0、12、24、48 h收集細(xì)胞，進(jìn)行蛋白質(zhì)抽提。采用BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行蛋白定量。SDSPAGE 膠分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗4℃孵育過(guò)夜；LC3 工作濃度1∶1 000， beclin-1 工作濃度1∶1 000， caspase-3、caspase-9 工作濃度1∶3 000，GAPDH 工作濃度1∶1 000；TBST 洗膜。二抗室溫孵育l h，TBST 漂洗。然后化學(xué)顯影，圖形軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 23.0 軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料以±s表示。符合正態(tài)分布組間定量資料采用Student'st檢驗(yàn)（單尾）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。符合正態(tài)分布的多組間定量資料的分析使用One-way ANOVA 檢驗(yàn)。當(dāng)P≥0.05 時(shí)，認(rèn)為方差齊性，用LSD 方法進(jìn)行多重比較。方差不齊時(shí)，用Dunnett'st檢驗(yàn)，進(jìn)一步做多重比較。

2 結(jié)果

2.1 透射電鏡觀察瘢痕組織結(jié)果

透射電鏡（圖1）觀察發(fā)現(xiàn)：在增生期瘢痕（對(duì)照組）內(nèi)成纖維細(xì)胞肥大，內(nèi)含大量細(xì)胞器，可見(jiàn)少量自噬小體，其中部分細(xì)胞器被吞噬。在消退期瘢痕（試驗(yàn)組）內(nèi)，成纖維細(xì)胞顯著縮小，自噬小體顯著增加，大部分細(xì)胞質(zhì)空泡化。隨后，細(xì)胞質(zhì)逐漸消失，細(xì)胞膜破裂，分解為珠狀小泡或散在碎片，具有典型的自噬性細(xì)胞溶解死亡形態(tài)。

圖1 增生期和消退期瘢痕組織自噬的透射電鏡觀察Fig 1 Transmission electron microscope observation of autophagy in proliferative and regressive scar

2.2 成纖維細(xì)胞透射電鏡觀察

在0 h 時(shí)相點(diǎn)，成纖維細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中有少量的細(xì)胞自噬小體。12 h 后，自噬小體和空泡明顯增多，不僅吞噬細(xì)胞器，還吞噬細(xì)胞質(zhì)中的膠原。24 h 后，部分細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物降解，細(xì)胞核收縮。48 h后，大部分細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物消失，細(xì)胞質(zhì)呈空泡化。細(xì)胞核凹陷，染色質(zhì)降解。隨后，可見(jiàn)細(xì)胞膜破裂，一些殘留的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物流出（圖2）。提示成纖維細(xì)胞在缺氧和缺營(yíng)養(yǎng)條件下發(fā)生自噬性溶解死亡。

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)成纖維細(xì)胞的自噬觀察Fig 2 Investigation of autophagy in fibroblasts at different time points

2.3 細(xì)胞死亡的測(cè)定結(jié)果

圖3 成纖維細(xì)胞在缺氧和缺營(yíng)養(yǎng)條件下的細(xì)胞死亡情況Fig 3 Cell death of fibroblasts under hypoxia and nutritional deficiency

2.4 免疫熒光結(jié)果

圖4 中，紅色為L(zhǎng)C3 表達(dá)，代表自噬；綠色為Annexin V表達(dá)，代表細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示：0 h時(shí)點(diǎn)有少量細(xì)胞自噬和少量細(xì)胞凋亡（0.14%±0.02%）。在12 h，細(xì)胞自噬和凋亡均有增加（0.20%±0.02%）。在24 h，大多數(shù)細(xì)胞發(fā)生自噬，細(xì)胞凋亡也達(dá)到高峰（0.45%±0.52%，P=0.031）。在48 h，自噬也有高表達(dá)，但細(xì)胞凋亡率減少（0.33%±0.03%）。結(jié)果表明細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)均有自噬的發(fā)生，然而48 h的結(jié)果與Calcein/PI 熒光染料試劑盒檢測(cè)的死亡細(xì)胞不一致，說(shuō)明在48 h時(shí)相點(diǎn)，除了細(xì)胞凋亡外，可能還有自噬性溶解死亡。

圖4 成纖維細(xì)胞缺氧和缺營(yíng)養(yǎng)條件下自噬和凋亡共染色結(jié)果Fig 4 Co-staining of autophagy and apoptosis in fibroblasts under hypoxia and nutritional deficiency

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

研究分別標(biāo)記細(xì)胞凋亡和自噬誘導(dǎo)的死亡（簡(jiǎn)稱自噬性死亡），采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)2 組細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在0 時(shí)相點(diǎn)，細(xì)胞凋亡率為0.12%±0.01%，12 h 有所增加，24 h 時(shí)顯著升高（0.42%±0.04%，P=0.038），48 h 時(shí)略有下降（0.34%±0.03%，P=0.031）；然而，在24 h 和48 h 組加入3-MA 后，細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯降低，表明細(xì)胞凋亡是由自噬引起的。

此外，我們利用MDC 和PI 標(biāo)記檢測(cè)自噬性死亡。結(jié)果見(jiàn)圖5，在治療前（0 h），有少量細(xì)胞死亡發(fā)生（2.00%±0.21%），12 h有增加。24 h細(xì)胞死亡明顯增加（5.15%±0.47%，P=0.030），48 h 達(dá)到高峰（5.98%±0.61%，P=0.020）。而在培養(yǎng)24 h 和48 h 時(shí)加入3-MA 后，細(xì)胞死亡顯著降低，分別為3.20%±0.31%和4.05%±0.43%（P=0.039 和P=0.041）。研究結(jié)果表明，隨著缺氧和缺營(yíng)養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，自噬性死亡逐漸增加，并可通過(guò)抑制自噬而降低。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)成纖維細(xì)胞自噬性死亡和細(xì)胞凋亡Fig 5 Assay of cell autosis and apoptosis by flow cytometry

試驗(yàn)中，大部分細(xì)胞都可以觀察到自噬。自噬是細(xì)胞死亡的啟動(dòng)因子，包括細(xì)胞凋亡和自噬性溶解死亡2 種形式。自噬引起的死亡代表總細(xì)胞死亡，因此，自噬性溶解死亡數(shù)量=自噬引起細(xì)胞死亡的總數(shù)量-細(xì)胞凋亡數(shù)量，因此計(jì)算得出自噬性溶解死亡的細(xì)胞數(shù)量為：0 時(shí)相點(diǎn)為1.90%±0.25%，12 h 有所增加，24 h 顯著增加（4.73%±0.51%，P=0.038），在48 h 達(dá)到高峰（5.64%±0.61%，P=0.021）。加入3-MA 后，細(xì)胞死亡數(shù)量顯著降低，24 h 和48 h 分別為3.10%±0.35% （P=0.042） 和 4.05%±0.43% （P=0.036）。由此可見(jiàn)自噬性溶解是細(xì)胞死亡的主要形式，細(xì)胞凋亡是次要的死亡形式。

2.6 Western blotting檢測(cè)結(jié)果

Western blotting檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6。HIF-1在0 h有一定表達(dá)，12 h表達(dá)增加，24 h達(dá)到峰值。同時(shí)beclin-1、LC3和caspase-3、caspase-9表達(dá)增加。3-MA抑制后，除beclin-1 外，HIF-1、LC3、caspase-3 和caspase-9 的表達(dá)均降低。這是由于3-MA抑制作用于beclin-1的下游，抑制自噬體形成，因此對(duì)其表達(dá)沒(méi)有影響。結(jié)果表明，抑制自噬，能夠減少細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)，也說(shuō)明凋亡是由自噬引起。48 h時(shí)，除LC3仍保持高表達(dá)外，其余蛋白均顯著下降。這些結(jié)果表明，缺氧缺營(yíng)養(yǎng)延長(zhǎng)時(shí)（比如48 h），凋亡蛋白表達(dá)減少，而LC3維持在高水平，導(dǎo)致自噬性溶解死亡。

圖6 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞自噬和凋亡Fig 6 Assay of apoptosis-and autophagy-related proteins by Western blotting

3 討論

細(xì)胞在饑餓、ATP 不足、生長(zhǎng)因子缺乏條件下，就可以啟動(dòng)自噬的發(fā)生。自噬是一種在營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)，消化細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞器，以實(shí)現(xiàn)能量循環(huán)的細(xì)胞代償過(guò)程。生理水平的自噬可促進(jìn)細(xì)胞存活，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和瘢痕增生［10］。而過(guò)度的自噬可導(dǎo)致成纖維細(xì)胞自噬性死亡，促進(jìn)瘢痕消退成熟。

研究在瘢痕組織和體外實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬性溶解死亡。在早期，自噬體形成過(guò)多，自噬體不僅吞噬細(xì)胞器，還吞噬膠原纖維，然后大部分的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物逐漸消失，細(xì)胞質(zhì)空泡化。細(xì)胞核凹陷，染色質(zhì)降解。在自噬后期，細(xì)胞破裂為囊泡樣顆粒。此前在對(duì)瘢痕的研究中未見(jiàn)報(bào)道。

此外，體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞24 h時(shí)，一方面透射電鏡下觀察到大量自噬小體形成，同時(shí)免疫熒光觀察到細(xì)胞凋亡和自噬也達(dá)到高峰。另一方面，蛋白表達(dá)層面發(fā)現(xiàn)beclin-1 和LC3 的表達(dá)也明顯增加，凋亡相關(guān)蛋白caspase-3 和caspase-9 的表達(dá)也明顯增加。但加入3-MA 后，細(xì)胞凋亡和自噬性溶解死亡降低，說(shuō)明2 種細(xì)胞死亡形式都是由自噬引起的，阻斷自噬可降低細(xì)胞死亡。此外，嚴(yán)重缺氧和缺營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)48 h后，caspase-3 和caspase-9 也下降，伴隨低水平的細(xì)胞凋亡，但LC3保持高水平，并伴有高水平的自噬性溶解死亡。與細(xì)胞凋亡呈相反趨勢(shì)，說(shuō)明延長(zhǎng)缺氧和缺營(yíng)養(yǎng)時(shí)間，產(chǎn)生以自噬性溶解為主的細(xì)胞死亡，LC3可能發(fā)揮主要作用。

需要指出的是，前期研究表明，線粒體自噬的過(guò)程依賴于HIF-1的表達(dá)，阻斷HIF-1可以抑制自噬，抑制細(xì)胞存活，增加細(xì)胞凋亡［11-12］。本研究結(jié)果顯示，在缺氧和缺營(yíng)養(yǎng)早期（6～24 h），其在促進(jìn)細(xì)胞自噬和凋亡方面起主導(dǎo)作用。但在晚期（48 h），HIF-1降低，但自噬仍然保持在較高水平，說(shuō)明此時(shí)HIF-1 不是導(dǎo)致自噬的決定因素，而過(guò)度缺氧和缺營(yíng)養(yǎng)可能就是發(fā)生自噬溶解的獨(dú)立死亡因素，細(xì)胞從“自我代償”進(jìn)入“自我死亡”。因此在缺氧和缺營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下，自噬性溶解死亡和凋亡可能共同參與了細(xì)胞的死亡。

總之，缺氧是增生性瘢痕的微環(huán)境特征，自噬貫穿了瘢痕演變的整個(gè)過(guò)程。在嚴(yán)重缺氧和缺營(yíng)養(yǎng)條件下，除了細(xì)胞凋亡以外，自噬性溶解死亡可能是引起瘢痕消退成熟的主要方式，有別于以往瘢痕成熟的“細(xì)胞凋亡論”。因此，在未來(lái)瘢痕治療過(guò)程中，誘導(dǎo)瘢痕中過(guò)度自噬和自噬性溶解死亡，可能促進(jìn)和加快瘢痕的消退和成熟。