吳鑫宇，曲苗，宋寒冰，關子赫，張婷婷

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

糖尿病作為一種慢性代謝性疾病，發(fā)病率逐年上升，發(fā)病人群趨于年輕化。流行病學統(tǒng)計數(shù)據(jù)預測，全球糖尿病患病總?cè)藬?shù)將由2017年4.5億增至2045年6.9億[1]。隨著科研及臨床對糖尿病領域認識的不斷深入，治療藥物不斷開發(fā)并投入市場，糖尿病已不再是嚴重威脅患者健康的疾病[2]。但由于長期高血糖所致的大血管、小血管、微血管損傷是不可逆的，進而患者會出現(xiàn)心、腦、腎、眼睛、足、周圍神經(jīng)等并發(fā)癥[3]。糖尿病腎病(DN)是糖尿病嚴重的微小血管并發(fā)癥之一，是導致終末期腎臟病的重要誘因[4]。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示，腎臟疾病與血糖、血壓有密切關系，超過80%終期腎臟疾病是由糖尿病和/或高血壓引起的[5]。

隨著對DN治療手段及藥物研究的不斷深入，中西醫(yī)以各自的理論體系在診治DN中均發(fā)揮著重要作用。西醫(yī)治療以控制血糖血脂，改善蛋白尿為主，可很大程度上改善患者臨床癥狀，但并未能阻止DN的發(fā)展[6]。在中醫(yī)藥理論的指導下，針對糖尿病陰虛為本燥熱為標的病機，采用清熱潤燥、養(yǎng)陰生津之法。DN作為糖尿病常見并發(fā)癥，除具有糖尿病典型癥狀如多食、多飲、多尿外，還兼見尿液渾濁如膏脂、腰膝酸軟、乏力、耳鳴、口干唇燥、舌紅苔少等癥狀表現(xiàn)。治以清熱養(yǎng)陰、益腎固本之法，方用大補陰丸可標本兼顧。大補陰丸作為一首經(jīng)典方劑，廣泛用于DN治療，文獻中可見臨床應用論著[7]，但未見大補陰丸治療DN的動物實驗研究報道。阿司匹林在臨床中可用于治療糖尿病腎病，該療效得到了臨床及動物實驗證實[8-9]，故選用阿司匹林作為陽性對照藥。本實驗以自發(fā)性糖尿病(db/db)小鼠為模型動物，應用大補陰丸對其進行治療，觀察本方對DN小鼠腎功能改善作用，以期為大補陰丸治療DN提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

C57BL/6種系野生型db/m模型小鼠，10只雄性，周齡16周；C57BL/6種系自發(fā)性糖尿病db/db模型小鼠，40只雄性，周齡16周，由牡丹江醫(yī)學院提供，實驗動物許可證號：SCXK(黑)2019-003。飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，濕度(45±5)%，于實驗前適應性喂養(yǎng)1周，自由攝食及飲水。

1.2 藥物與試劑

大補陰丸(杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司),阿司匹林腸溶片(廣東九明制藥有限公司),尿蛋白酶聯(lián)免疫分析試劑盒(美國R&D公司),Cys-C免疫試劑盒(湖南永和陽光科技有限公司),RBP酶聯(lián)免疫試劑盒(美國R&D公司),蘇木素-伊紅染液(南京建成)。

1.3 儀器

全自動生化分析儀(7180),德國萊卡切片機(LEICARM 2135),顯微攝影成像系統(tǒng)(moticam 3000),微量加樣器(NICHIRYO),羅氏血糖儀及血糖試紙(批號：07124112，羅氏)。

1.4 方法

1.4.1 分組及給藥

db/m小鼠10只，作為空白組；db/db小鼠40只，隨機分為4組，每組10只，分別為模型組,陽性藥組(阿司匹林),大補陰丸高、低劑量組。其中空白組及模型組給予生理鹽水灌胃，依據(jù)人-小鼠體表面積公式，陽性藥小鼠給藥量為0.013 g/(kg·d)，大補陰丸成人每日服藥量作為小鼠低劑量，大補陰丸低劑量組小鼠給藥量為2.34 g/(kg·d)，高劑量給藥量為低劑量2倍，大補陰丸高劑量組小鼠給藥量為4.68 g/(kg·d)。每日1次，連續(xù)灌胃4周。

1.4.2 樣本采集

分別于用藥前及藥物治療2周、4周后采血。末次給藥后，將小鼠分別置于代謝籠中，收集24 h尿液，置于離心管中，離心取上清液，于-20 ℃冰箱保存待測。末次給藥24 h后，麻醉小鼠并摘除眼球取血，3 000 r/min離心15 min，取血清，置于-20 ℃冰箱保存待測。在冰塊上解剖腹部迅速剝離左側(cè)腎臟，去除包膜，置于4%多聚甲醛中固定。

1.4.3 標本檢測

血糖測定：小鼠尾靜脈取血，用血糖儀檢測第0周、第2周及第4周小鼠隨機血糖值，以FPG≥11.1 mmo1/L作為模型成功的判斷標準[10]。

尿液檢測：全自動生化分析儀檢測小鼠24 h尿蛋白排泄率(UAE)、肌酐(Scr)及尿素氮(BUN)。

血清檢測：免疫比濁法檢測血清中胱抑素(Cys-c)；ELISA試劑盒檢測血清中視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)。

腎臟病理變化：置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切片，進行HE染色，觀察腎臟病理變化。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠治療前后血糖數(shù)值

空白組小鼠血糖數(shù)值在正常值范圍，整個實驗過程血糖數(shù)值基本保持穩(wěn)定，模型組小鼠血糖數(shù)值隨周齡增大持續(xù)升高，數(shù)值符合糖尿病小鼠標準，此模型動物可靠。給藥前空白組與其余各組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。模型組小鼠血糖數(shù)值持續(xù)升高，第2周各給藥組血糖均下降與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。第4周各給藥組血糖下降到正常范圍與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 各組小鼠治療前后血糖的比較

2.2 各組小鼠尿液中UAE、Scr及BUN含量

比較各組小鼠尿液中UAE含量，與空白組相比，其他組UAE含量均有不同程度升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，各給藥組與模型組相比尿液中UAE含量有所下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。比較各組小鼠尿液中Scr含量，與空白組相比其余各組Scr含量均升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)，各給藥組與模型組相比尿液中Scr含量有所下降，其中低劑量組、高劑量組與模型組相比降低更明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。比較各組小鼠尿液中BUN含量，與空白組相比其余各組BUN含量均升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)，各給藥組與模型組相比尿液中BUN含量有所下降，其中陽性藥組、低劑量組與模型組相比降低更明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組小鼠尿液中UAE、Scr及BUN含量

2.3 各組小鼠血清中Cys-c、RBP含量

用免疫比濁法檢測各組小鼠血清中Cys-c含量，空白組Cys-c含量最低，其余各組與空白組比較含量顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，各給藥組與模型組相比Cys-c含量有所下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。用ELISA試劑盒檢測各組小鼠血清中RBP含量，空白組RBP含量最低，其余各組與空白組比較含量顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，各給藥組與模型組相比RBP含量有所下降，其中陽性藥組與模型組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，低劑量組、高劑量組與模型組相比降低更明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表3。

表3 各組小鼠血清中Cys-c、RBP含量

2.4 各組小鼠腎臟病理變化

HE染色可見，空白組小鼠腎臟組織中腎小球、腎小管以及小管間質(zhì)結(jié)構(gòu)完整，細胞排列規(guī)整、大小正常，基底膜、系膜區(qū)均未見異常。模型組小鼠腎臟局部腎小管擴張，腎小管上皮細胞脫落、萎縮，系膜增生，基質(zhì)增加，基底膜增厚，腎小球毛細血管袢模糊。與模型組相比，各給藥組腎小球血管內(nèi)皮細胞、系膜細胞數(shù)量明顯增多，腎小球系膜間質(zhì)減少，腎小球毛細血管袢較清晰，見圖1。

圖1 各組小鼠腎臟病理學觀察(HE，400×)

3 討論

隨著高血糖狀態(tài)的持續(xù)，腎臟會出現(xiàn)由代償期到失代償期的轉(zhuǎn)變[11]。DN病理變化十分復雜，早期由于高糖狀態(tài)使腎臟出現(xiàn)血流動力學變化，高濾過高灌注之下腎小球出現(xiàn)肥大，系膜增生，基質(zhì)增加，基底膜增厚等病理變化[12]。實驗末期模型組小鼠腎臟已呈現(xiàn)以上變化，隨著疾病進一步發(fā)展，小鼠腎小球及腎小管間質(zhì)會出現(xiàn)纖維化，使腎小球濾過及腎小管重吸收功能下降，發(fā)展為終末期腎病[13]。但是由于本實驗動物周齡尚小，沒有表現(xiàn)出晚期腎臟變化。本次實驗以db/db小鼠為研究對象，該品種小鼠是由于瘦素受體基因突變而得到的，對瘦素敏感性差，不會出現(xiàn)飽腹感，會出現(xiàn)多食、多飲、多尿的表現(xiàn)，與人類糖尿病癥狀表現(xiàn)相似。研究證實db/db小鼠4周齡時血糖開始升高，于6周齡時出現(xiàn)高血糖，8周時出現(xiàn)蛋白尿，15周齡左右出現(xiàn)腎功能衰退，癥狀與病理變化均與臨床DN相似，常作為DN的實驗動物模型[14]。故本實驗以具備DN特征的16周齡db/db小鼠為實驗動物。

蛋白排泄率(UAE)、肌酐(Scr)及尿素氮(BUN)可反映腎臟功能，在出現(xiàn)腎臟功能異常的早期階段即可表現(xiàn)出尿液中含量的變化，對判斷DN預后和療效有十分重要的意義。胱抑素C(Cys-c)是半胱氨酸蛋白酶抑制劑，屬于小分子蛋白。循環(huán)中的Cys-c可自由通過腎小球濾過屏障，在近端腎小管上皮細胞中被完全分解，Cys-c產(chǎn)生速度穩(wěn)定，腎臟是唯一清除Cys-c的器官，腎小球濾過率是調(diào)節(jié)Cys-c的主要方式，因此血清Cys-c是反映腎小球濾過率情況的理想同源性標志物[15-16]。視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)是由肝臟分泌的一種小分子維生素轉(zhuǎn)運蛋白，在體內(nèi)主要以前蛋白、視黃醇結(jié)合的形式存在，經(jīng)腎小球過濾，再由近端腎小管重新吸收、降解。當腎臟出現(xiàn)疾病時，血液和尿液中RBP都會升高，該變化在腎病早期即可出現(xiàn)[17]。

中醫(yī)將糖尿病腎病歸屬于“消渴”范疇，在世界醫(yī)學史中，中醫(yī)學對本病的認識最早，且論述甚詳。消渴之名首見于《素問·奇病論》，認為五臟虛弱、過食肥甘厚味、情志失調(diào)等都是引起消渴的病因，陰虛內(nèi)熱是其主要病機?！蹲C治準繩·消癉》在消渴上、中、下分類上又做了規(guī)范，即“渴而多飲為上消，消谷善饑為中消，渴而便數(shù)有膏為下消?！薄杜R證指南醫(yī)案》云：“三消一證，雖有上、中、下之分，其實不越陰虧陽亢，津涸熱淫而已。”大補陰丸出自《丹溪心法》，以熟地黃滋補真陰，益精填髓；龜板滋陰潛陽，補腎健骨。兩藥相須，補陰固本，滋水亦可制火，共為君藥。知母、黃柏可清降陰虛之火，共為臣藥。全方滋陰培本為主，降火清源為輔，實乃補瀉并施之方[18]。本課題組在臨床實踐基礎上[19]，提出針對DN陰虛為本燥熱為標的病機，應用大補陰丸進行干預。研究結(jié)果顯示，大補陰丸能夠平穩(wěn)地降低db/db小鼠血糖，降低尿液中UAE、Scr及BUN含量，降低血清中Cys-c、RBP含量，HE染色觀察腎臟病理變化，可見大補陰丸組小鼠腎臟結(jié)構(gòu)異常表現(xiàn)不嚴重。但本實驗也存在一些不足之處，一是治療機理應進一步探究闡釋；二是治療時間應適當延長，驗證該藥遠期療效，觀察小鼠各項生理指標是否可恢復到正常范圍。

綜上所述，大補陰丸對db/db小鼠模型出現(xiàn)的DN具有良好的治療作用，為大補陰丸治療DN奠定了實驗基礎。