雷玉梅,安陽(yáng),張軍,徐暉,陸道敏,曹躍朋,寧喬怡,王瑩

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550002)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為主要病理特征的慢性疾病，滑膜炎是RA病情發(fā)展致殘的重要因素。

高遷移率族蛋白B1(High mobility group protein,HMGB1)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種促炎中介，它可誘導(dǎo)及參與炎癥的發(fā)生與發(fā)展，在自身免疫性疾病中可能具有十分重要的作用。研究證實(shí)，HMGB1在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清、滑膜液中存在且異常增高[1-2]；HMGB在RA炎癥的持續(xù)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。HMGB與TLR2、TLR4受體結(jié)合，誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β等致炎因子釋放[3-4]導(dǎo)致炎癥持續(xù),造成關(guān)節(jié)破壞，這些炎性因子又能促進(jìn)HMGB1的釋放[5]，以此形成一個(gè)正向炎癥反饋通路。

侗醫(yī)藥松蘿具有祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛的功效。經(jīng)課題組前期研究證實(shí)松蘿提取物對(duì)RA的治療具有良好療效[6]。經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)松蘿能緩解CIA模型大鼠的關(guān)節(jié)腫脹情況并能抑制NF-κB的蛋白活性[7-8]。因此，在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究提出HMGB1介導(dǎo)的細(xì)胞炎癥是RA患者關(guān)節(jié)滑膜炎癥發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素，侗醫(yī)“趕邪、消水”理論指導(dǎo)下的侗族藥松蘿提取物可能通過(guò)調(diào)控HMGB1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，抑制RA關(guān)節(jié)滑膜炎癥的科學(xué)假說(shuō)，具有充分的理論依據(jù)和堅(jiān)實(shí)的前期研究基礎(chǔ)。為驗(yàn)證此假說(shuō)，本研究從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討松蘿提取物通過(guò)HMGB1炎癥通路調(diào)控RA炎癥因子的分子機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)器材及試劑

儀器：全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo scientific，Multiskan MK3)，PCR儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司，EDC-810)，垂直電泳槽(北京六一儀器廠，DYCZ-40)等。試劑：磷酸酶抑制劑(碧云天，S1873)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天，P0010)，RIPA裂解液(碧云天，P0013B)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物及分組

SPF級(jí)5周齡Wistar雌性大鼠54只，體質(zhì)量150～180 g,購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(鄂)2020-0018，喂養(yǎng)環(huán)境室溫20～25 ℃、濕度70%左右，自由進(jìn)食、自由飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后開始試驗(yàn)。按隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行編號(hào)，隨機(jī)分為松蘿提取物低、中、高劑量組和羥氯喹組、空白組、模型組[1]，每組9只。

1.2.2 模型的制備

將Ⅱ型膠原溶于0.1 mol/L的醋酸中，攪拌溶解，配制成2 mg/mL溶液，置4 ℃冰箱過(guò)夜。與弗氏完全佐劑等體積混合，乳化配制成Ⅱ型膠原乳劑，分別于大鼠尾根部多點(diǎn)皮內(nèi)注射0.1 mL致炎，復(fù)制穩(wěn)定的CIA大鼠模型[9]。造模成功評(píng)價(jià)：采用關(guān)節(jié)炎評(píng)分法，即造模成功的大鼠趾端至踝關(guān)節(jié)段紅腫，關(guān)節(jié)炎癥評(píng)分>4分[10]。

1.2.3 給藥劑量

根據(jù)課題組前期的藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果，本研究的給藥劑量為松蘿提取物6 mg/kg為中劑量，其1/3劑量(2 mg/kg)為低劑量，9倍劑量(54 mg/kg)定為高劑量。羥氯喹成人用量400 mg/日，參照60 kg成人與動(dòng)物藥物劑量換算系數(shù)表，大鼠用藥劑量(mg/kg)=5.4×人用藥劑量(mg/kg)[11]。

1.2.4 樣品采集

末次灌胃2 h后，以烏拉坦按0.4 mL/100 g的劑量，經(jīng)腹腔注射麻醉后，股動(dòng)脈取血4～6 mL，室溫靜置30 min后3 000 r/min離心15 min，提取血清。處死大鼠后，取大鼠后右足踝關(guān)節(jié)，取出滑膜組織，提取組織蛋白。

1.2.5 ELISA法檢測(cè)血清致炎因子

ELISA法檢測(cè)IL-23、IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌。按照試劑盒設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔,分別加樣，36 ℃孵育90 min，洗板5次，加入酶標(biāo)試劑，36 ℃反應(yīng)，溫育1 h，洗板5次，加入TMB 100 μL，覆膜36 ℃避光，溫育15 min，后加入終止液，測(cè)量OD值，進(jìn)行計(jì)算。

1.2.6 HMGB1、TLR4與TLR2 mRNA表達(dá)檢測(cè)

采用PCR法檢測(cè)TLR2、TLR4與HMGB1表達(dá)量。提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 sec，60 ℃30 sec，40 cycles。引物設(shè)計(jì)如下，β-actin：(F)5’- CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC -3’，(R) 5’- TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT -3’;TLR2:(F)5’-GGAAGCAGGTGACAACCATT-3’,(R)5’-CGCCTAAGAGCAGGATCAAC-3’;TLR4:(F)5’-TGGTGGCTGTGGAGACAAAAATGAC-3’(R)5’- CTGAAAGGCTTGGGCTTGAATGGAG-3；每個(gè)樣本3個(gè)副孔，重復(fù)3次。

1.2.7 Western Blot法檢測(cè)HMGB1、TLR2與TLR4蛋白表達(dá)量

將少量剪碎的組織塊置于2 mL EP管中，加入洗凈的鋼珠，裂解、勻漿，置于冰上30 min。用移液器將裂解液移至1.5 mL離心管中在4 ℃下12 000 r/min離心5 min，取上清分裝于0.5 mL離心管。以BSA為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。沸水浴10 min將蛋白變性。10% SDS-PVDF電泳，各樣品總蛋白量為40 μg。加樣后先恒壓80 V電泳至溴酚藍(lán)指示劑在濃縮膠與分離膠交界處成線狀，改為恒壓120 V至溴酚藍(lán)到凝膠底部，此過(guò)程約用時(shí)1.5 h。封閉2 h。一抗4 ℃過(guò)夜，二抗孵育2 h。將ECL試劑中增強(qiáng)液與穩(wěn)定的過(guò)氧化物酶溶液按1∶1比例混勻，滴加工作液于PVDF膜上，反應(yīng)數(shù)分鐘待熒光帶明顯后，用濾紙吸去多余的底物液，覆上保鮮膜，X光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影，沖洗膠片，晾干膠片，掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 松蘿提取物對(duì)CIA大鼠血清中HMGB1含量的影響

與空白組比較，松蘿提取物低劑量組、中劑量組、高劑量組、羥氯喹組及模型組的HMGB1含量均增高(P<0.05)，與模型組相比較,不同濃度的松蘿提取物、羥氯喹組均可降低HMGB1含量(P<0.05)；松蘿中劑量組、高劑量組與羥氯喹組相比降低HMGB1的效果相當(dāng)，無(wú)顯著差異，見(jiàn)表1。

表1 松蘿提取物對(duì)CIA大鼠血清中HMGB1含量的影響

2.2 松蘿提取物對(duì)CIA大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-23與IL-6含量的影響

與空白組比較，松蘿提取物低劑量組、中劑量組、高劑量組、模型組、羥氯喹組的IL-1β、IL-6、IL-23、TNF-α含量均增加(P<0.05)；與模型組比較，松蘿提取物中劑量組、高劑量組及羥氯喹組均能降低TNF-α、IL-23、IL-1β、IL-6含量(P<0.05)，松蘿中劑量組、高劑量組與羥氯喹組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

表2 松蘿提取物對(duì)CIA大鼠血清中IL-6、IL-23、IL-1β、TNF-α含量的影響

2.3 RT-PCR法檢測(cè)CIA大鼠滑膜組織中HMGB1、TLR4與TLR2 mRNA的表達(dá)

與空白組相比較，松蘿提取物低、中、高劑量組與模型組、羥氯喹組HMGB1、TLR4、TLR2 mRNA表達(dá)均增加(P<0.05)；與模型組相比較，松蘿提取物中、高劑量組及羥氯喹組均能抑制 mRNA表達(dá)(P<0.05)；與羥氯喹組相比較松蘿提取物中、高劑量組抑制HMGB1、TLR4、TLR2表達(dá)的效果相當(dāng)，見(jiàn)表3。

表3 松蘿提取物對(duì)CIA大鼠滑膜組織中HMGB1、TLR2、TLR4 mRNA表達(dá)的影響

2.4 Western Blot法檢測(cè)CIA大鼠滑膜組織中HMGB1、TLR2與TLR4蛋白的表達(dá)量

與空白組相比較，松蘿提取物低、中、高劑量、模型組、羥氯喹組表達(dá)均增加(P<0.05)；與模型組相比較，松蘿提取物中劑量組、高劑量、羥氯喹組均能抑制HMGB1、TLR4、TLR2表達(dá)(P<0.05)；與羥氯喹相比較，松蘿中劑量組、高劑量組在抑制蛋白表達(dá)上無(wú)顯著差異,見(jiàn)圖1，表4。

圖1 各組CIA大鼠滑膜組織HMGB1、TLR2與TLR4蛋白表達(dá)條帶圖

表4 松蘿提取物對(duì)CIA大鼠滑膜組織中HMGB1、TLR2、TLR4蛋白表達(dá)的影響

3 討論

RA是一種自身免疫性疾病，發(fā)病因素復(fù)雜，其中滑膜炎癥是其主要病理表現(xiàn)。當(dāng)人體出現(xiàn)刺激或免疫損傷的情況下，HMGB1作為促炎因子從細(xì)胞核內(nèi)釋放，通過(guò)與RAGE、TLR2及TLR4受體結(jié)合，促進(jìn)IL-6、IL-23等的分泌，誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β等致炎因子釋放[3-4]，這些炎癥因子又可以反過(guò)來(lái)促進(jìn)HMGB1 的釋放而形成持續(xù)的炎癥反應(yīng)。有研究[13]發(fā)現(xiàn) RA 患者與健康人相比較，血清中 HMGB1含量明顯升高，活動(dòng)期的RA患者與非活動(dòng)期RA患者相比較，血清中HMGB1水平增高，提示HMGB1可能與疾病活動(dòng)相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)將重組HMGB1蛋白注射進(jìn)大鼠關(guān)節(jié)腔可引起滑膜炎，給CIA大鼠模型注射HMGB1抗體干預(yù)后，滑膜炎癥減輕[1]。TLR屬于跨膜蛋白，是HMGB1的特異性受體，在炎癥信號(hào)傳遞中有著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1可被TLRs識(shí)別，參與免疫應(yīng)答過(guò)程[14]。在小鼠或者大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射TLR配體如細(xì)菌DNA，LPS等可誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)生，LPS與Ⅱ型膠原聯(lián)合進(jìn)行關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射可加重關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)，而敲除TLR2、TLR4的動(dòng)物表現(xiàn)出炎癥程度明顯下降。IL-6、IL-23、TNF-α、IL-1β是RA病程中的主要促炎因子[15-16]。HMGB1可以通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)炎癥因子的釋放。本研究證實(shí)，松蘿提取物具有較好的抗炎作用。中劑量及高劑量組的松蘿提取物可有效減輕CIA大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-23、TNF-α、HMGB1的濃度，以及滑膜細(xì)胞中 HMGB1、TLR2、TLR4蛋白表達(dá)。

綜上所述，松蘿提取物能降低HMGB1、TLR2、TLR4 mRNA的表達(dá)量，并抑制HMGB1、TLR2、TLR4的蛋白表達(dá)，減少IL-6等細(xì)胞因子的含量，阻斷HMGB1/TLR炎癥通路，從而減輕RA滑膜炎癥，達(dá)到控制關(guān)節(jié)炎的目的。