黃英， 彭晴， 王荃， 徐小輕， 張宇微， 馬藍， 石波， 喬宇*

（1.中國農業(yè)科學院飼料研究所，北京 100081；2.全國畜牧總站，北京 100125）

芽孢桿菌（Bacillus）屬革蘭氏陽性菌，可形成芽孢[1]，能分泌多種酶類，如蛋白酶、纖維素酶、果膠酶；還能合成多種生物活性物質，如有機酸、維生素、氨基酸等[2]。益生芽孢桿菌能夠提高營養(yǎng)物質的消化率，維持腸道菌群平衡，增強機體免疫力和抗病力，在功能食品、畜禽養(yǎng)殖、植物病害防治、工業(yè)酶制劑生產等方面取得了很好的應用效果[3]。

蠟樣芽孢桿菌能產生溶血素、磷脂酶和其他腸毒素[4-5]，引起人類和動物的中毒反應，主要表現(xiàn)為嘔吐和腹瀉。嘔吐毒素（cereulide）[6]是由非核糖體肽合酶ces基因簇編碼的熱穩(wěn)定性環(huán)狀多肽。腸毒素主要包括溶血素Hbl、非溶血性腸毒素Nhe、腸毒素FM（entFM）、細胞毒素K（CytK）和腸毒素 T（BceT）[7]。Hbl由 L1、L2和 B 共 3 個亞基構成，分別由hblA、hblB和hblD基因編碼[8]。當3個亞基都存在時毒性最強，對宿主產生溶血、細胞毒性和皮膚壞死毒性。Nhe由nheA、nheB和nheC 3個亞基構成[9]，而entFM、CytK和BceT是單亞基蛋白[10]。近年來，具有益生功效的芽孢桿菌，如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）等陸續(xù)被報道也能分泌與蠟樣芽孢桿菌相同的毒素[5]。Parvathi等[11]從土壤中分離出一株短小芽孢桿菌，攜帶了與蠟樣芽孢桿菌相同的嘔吐毒素合成基因，且能夠分泌嘔吐毒素。Rowan等[12]用蠟樣芽孢桿菌溶血素（Hbl的L2亞基）進行反向被動乳膠凝集試驗，結果表明，凝結芽胞桿菌NB11和多粘芽孢桿菌NB6能分泌Hbl毒素。除此之外，一些枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌[13-16]和短小芽孢桿菌[13,17-20]還能產生多種類型的脂肽類毒素，如表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素（iturin）和芬芥素（fengycin）等，部分脂肽類毒素具有溶血性和細胞毒性。

安全無毒是益生類芽孢桿菌必需具備的首要條件，在使用前必需對其毒性和安全性進行評價[13,21]。采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)和生化法測定毒素存在耗時長、靈敏度低等缺點[22]；而利用PCR和全基因組測序分析檢測毒素基因的方法缺乏必要的質量控制和結果驗證，存在一定的局限性[22-23]。細胞毒性測定法通過體外檢測毒素對相關哺乳動物生長代謝產生的影響，解決了上述方法的缺陷[22,24]。Beattie等[25]用體外培養(yǎng)的CHO細胞（中國倉鼠卵巢細胞），通過細胞染色和代謝活性的變化評價芽孢桿菌的細胞毒性，該方法耗時較長，需要24～72 h才能完成。Gray等[22]用Ped-2E9細胞（小鼠雜交瘤淋巴細胞）檢測芽孢桿菌的細胞毒性，但Ped-2E9細胞只能檢測出蠟樣芽孢桿菌的細胞毒性，對枯草芽胞桿菌不敏感。Lee等[26]利用HEp-2細胞（人喉表皮樣癌細胞）的空泡化測定蠟樣芽孢桿菌的嘔吐毒素。歐洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）的官方文件中使用非洲綠猴腎細胞（Vero細胞）評估飼用芽孢桿菌的產毒潛力[28]。研究報道，流式細胞儀法、同位素釋放法、臺盼藍染色法[29]、MTT比色法[30]和CCK-8[31]法均能測定細胞毒性強弱。其中，MTT比色法和CCK-8法以其快速簡單、不需要特殊檢測儀器、無放射性同位素且適合大批量檢測等特點被廣泛應用。綜上所述，在芽孢桿菌毒性檢測中，不同株系的細胞和細胞活性測定方法在操作性、敏感性、適用性和準確性等方面存在差異，制約了細胞毒性檢測方法的應用。因此，本研究擬通過篩選試驗用細胞系，并進一步對細胞毒性的檢測方法進行優(yōu)化，建立一種簡單、快速、可靠和廣泛適用的芽孢桿菌細胞毒性檢測方法，為芽孢桿菌的安全使用提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

芽孢桿菌：蠟樣芽孢桿菌CICC 21261（標準毒株購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心）及81株芽孢桿菌（實驗室分離保存），包括3株蠟樣芽胞桿菌、44株枯草芽孢桿菌、15株解淀粉芽孢桿菌、9株地衣芽孢桿菌、6株貝萊斯芽孢桿菌、2株短小芽孢桿菌、1株人參芽孢桿菌、1株副芽孢桿菌。

細胞：非洲綠猴腎細胞（Vero細胞）購自武漢普諾賽生命科技有限公司，人喉表皮樣癌細胞（HEp-2細胞）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)條件

芽胞桿菌：取甘油保存的芽孢桿菌于LB固體平板劃線，37℃培養(yǎng)過夜后，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)16～18 h。將活化的菌液以體積比為2%的接種量轉接于腦心浸出液培養(yǎng)基（BHI）中，32℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng) 6～18 h[32]。

細胞：細胞接種于含DMEM完全培養(yǎng)基（含8%胎牛血清，1%雙抗）的T-25瓶中，在37℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)，以胰酶消化傳代。利用DMEM完全培養(yǎng)基調整細胞液密度為5×104～1×105個·mL?1[33]進行后續(xù)實驗。

1.3 細胞毒性檢測方法的建立

1.3.1 細胞活性檢測方法的確定 ①MTT比色法。取Vero細胞液100μL接種于96孔板，于37℃、5% CO2下孵育24 h后更換為100μL DMEM完全培養(yǎng)基，同時實驗組每孔加入50μL BHI培養(yǎng)基，對照組每孔加入50μL DMEM培養(yǎng)基（含1%雙抗），以不接細胞的孔作為空白對照，每組做8個重復。于37℃、5% CO2下繼續(xù)孵育2 h后，移去孔板中的液體，加入100μL質量濃度為1 mg·mL?1的MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，北京博奧拓達科技有限公司]，37℃反應4 h后移去MTT溶液，每孔加入150μL的DMSO[34]，充分振蕩混勻后，在490 nm下測定光吸收值，并計算BHI培養(yǎng)基對細胞的抑制率[35]。

②CCK-8法。取Vero細胞液100μL接種于96孔板，于37℃、5% CO2下孵育24 h后更換100μL DMEM完全培養(yǎng)基，同時實驗組每孔加入50μL BHI培養(yǎng)基，對照組每孔加入50μL DMEM培養(yǎng)基（含1%雙抗），以不接細胞的孔作為空白對照，每組做8個重復。于37℃、5% CO2條件下繼續(xù)孵育2 h后，移去孔板中的液體，加入100μL DMEM培養(yǎng)基以及10μL CCK溶液（Cell Counting Kit-8,biosharp，北京蘭杰柯科技有限公司），37℃反應2 h，在450 nm下測定光吸收值，并計算芽孢桿菌培養(yǎng)基對細胞的抑制率。

1.3.2 細胞的選擇 培養(yǎng)Vero細胞和HEp-2細胞，分別取細胞液100μL接種于96孔板，于37℃、5% CO2下孵育24 h后更換100μL DMEM完全培養(yǎng)基，同時實驗組每孔加入50μL BHI培養(yǎng)基，對照組每孔加入50μL DMEM培養(yǎng)基（含1%雙抗），以不接細胞的孔作為空白對照，每組做8個重復。37℃、5% CO2下繼續(xù)孵育2 h后，采用MTT比色法測定BHI培養(yǎng)基對兩種細胞的抑制率。

1.4 細胞毒性檢測條件的優(yōu)化

1.4.1 芽胞桿菌粗提物的制備 分別濃縮或稀釋蠟樣芽孢桿菌CICC 21261、蠟樣芽孢桿菌1-20、解淀 粉 芽 孢 桿 菌 1-16 培 養(yǎng) 液 至 108CFU·mL?1，10 000 r·min?1離心10 min，上清液用0.22 μm的微孔濾膜過濾，制成芽孢桿菌粗提物，4℃保存不超過48 h。

1.4.2 反應體系的優(yōu)化 將100μL Vero細胞液接入96孔板，于37℃、5% CO2下孵育24 h后更換100μL DMEM完全培養(yǎng)基，同時實驗組分別加入粗提物25、50、75和100 μL，對照組加入與粗提物等量的BHI培養(yǎng)基，以不接細胞的孔作為空白對照，每組做8個重復，37℃、5% CO2下孵育2 h后，測定粗提物的細胞抑制率，比較不同體積的粗提物對細胞抑制率的影響。

1.4.3 反應時間的優(yōu)化 將100μL Vero細胞液接入96孔板，于37℃、5% CO2下孵育24 h后更換100μL DMEM完全培養(yǎng)基，同時實驗組加入粗提物50μL，對照組加入與粗提物等量的BHI培養(yǎng)基，以不接細胞的孔作為空白對照，各組于37℃、5% CO2下分別孵育1、2、4、6和24 h后，計算并比較不同孵育時間下的粗提物的細胞抑制率。

1.5 細胞抑制率的計算及結果判定

測定試驗組光吸收值、對照組光吸收值和空白組光吸收值，按照下式計算細胞抑制率。

當芽孢桿菌的培養(yǎng)液對細胞抑制率＜20%時，判定該菌株無細胞毒性；當芽孢桿菌的培養(yǎng)液對細胞抑制率≥20%時，判定該株芽孢桿菌具有細胞毒性[28,35]。

1.6 芽孢桿菌分離菌株毒性檢測

利用建立的細胞毒性試驗方法對實驗室分離的81株芽孢桿菌進行細胞毒性檢測。

1.7 芽胞桿菌分泌毒素的測定

1.7.1 毒素編碼基因檢測 提取芽孢桿菌基因組DNA，參考?zdemir等[36]的方法PCR擴增entFM、ces、cytk、hblA、hblC、hblD、nheA、nheB和nheC9種毒素編碼基因，引物序列[36-39]詳見表1。以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

表1 毒素編碼基因的PCR引物Table1 Primer of virulence genes for PCR

1.7.2 芽孢桿菌培養(yǎng)上清液的耐熱性測試 芽胞桿菌產生的嘔吐毒素和脂肽類毒素具有較高的熱穩(wěn)定性，而腸毒素Hbl、Nhe和Cytk等具有熱不穩(wěn)定性。為了分析芽胞桿菌分泌毒素的類型，芽孢桿菌培養(yǎng)物上清液在58℃下處理40 min[22]后，按建立的試驗方法對其進行細胞毒性檢測。

1.7.3 溶血性測定 挑取LB平板上活化的芽孢桿菌單菌落劃線于含8%綿羊血（北京陸橋技術股份有限公司）的哥倫比亞血瓊脂（北京索萊寶科技有限公司）平板上，于37℃培養(yǎng)14～18 h，觀察菌落周圍的形態(tài)，判斷溶血性的類型，每株菌3個重復。若菌落周圍形成了界限分明、完全透明的溶血環(huán)，具有溶血性，則溶血類型為β-溶血；若菌落周圍的培養(yǎng)基沒有變化，不具有溶血性，則為γ-溶血[40]。

1.7.4 腸毒素的特異性抗體檢測 利用逆向被動乳膠凝集反應（CRET-RPLA，日本生研株式會社）檢測芽孢桿菌腸毒素，操作步驟按照試劑盒說明書進行。

2 結果與分析

2.1 用于芽胞桿菌代謝物細胞毒性檢測方法的建立

2.1.1 不同細胞活性檢測方法對Vero細胞抑制率的影響 對比MTT比色法和CCK-8法測定BHI培養(yǎng)基對Vero細胞抑制率，結果（圖1）表明，MTT比色法測定BHI培養(yǎng)基的細胞抑制率為2.46%，按照芽孢桿菌細胞毒性的判定標準，該BHI培養(yǎng)基的細胞抑制率較低，不具有細胞毒性；而使用CCK-8法測定Vero細胞抑制率時，當培養(yǎng)基與細胞反應2 h后，實驗組的光吸收值高于對照組，細胞活性沒有被抑制反而被促進，增長率達92%。根據(jù)CCK-8法的原理推斷，可能BHI培養(yǎng)基中某些組分具有還原特性，使CCK-8法的顯色反應被干擾，導致本底誤差過大而使實驗結果沒有參考意義。因此，CCK-8法測定細胞活性不適用于本試驗。MTT比色法培養(yǎng)基本底水平低，結果較穩(wěn)定，適合本試驗中細胞活性的測定。

圖1 BHI培養(yǎng)基的細胞抑制率Fig.1 Inhibition rates of Bacillus culture medium on Vero cells

2.1.2 BHI培養(yǎng)基對不同細胞活性的影響 Vero細胞和HEp-2細胞分別與BHI培養(yǎng)基反應后測定細胞抑制率，結果（圖2）表明，當BHI培養(yǎng)基與Vero細胞反應2 h后，細胞抑制率為2.46%；而BHI培養(yǎng)基與HEp-2細胞反應2 h后，細胞抑制率為29.94%。與Vero細胞相比，本試驗選用的BHI培養(yǎng)基對HEp-2細胞的抑制率達到20%以上，如此高的本底水平會影響芽孢桿菌培養(yǎng)物細胞毒性的判定，因此，選用Vero細胞作為試驗細胞。

圖2 BHI培養(yǎng)基對Vero細胞和HEp-2細胞的抑制率Fig.2 Inhibition rates of Bacillus culture medium on Vero cell and HEp-2 cell

2.2 用于芽胞桿菌代謝物細胞毒性檢測條件的優(yōu)化

2.2.1 不同反應體系對細胞抑制率的影響 不同體積粗提物對細胞抑制率的影響如表2所示，蠟樣芽孢桿菌CICC 21261具有強毒性，在加入粗提物體積為50μL時，細胞抑制率最高；蠟樣芽孢桿菌1-20和解淀粉芽孢桿菌1-16在加入粗提物體積為50μL時，細胞抑制率最高，分別為94.26%和52.64%。因此，將與細胞反應的芽孢桿菌粗提物體積確定為50μL。

表2 不同粗提物體積的細胞抑制率Table 2 Inhibition rates of cells by different volumes of Bacillus crude extract （%）

2.2.2 不同反應時間對細胞抑制率的影響 芽孢桿菌粗提物和細胞反應不同時間對細胞抑制率的影響結果如圖3所示，蠟樣芽孢桿菌CICC 21261粗提物與細胞反應1 h，細胞抑制率達94.26%，細胞抑制率曲線到達平臺期；蠟樣芽孢桿菌1-20粗提物與細胞反應2 h，細胞抑制率達94.26%，細胞抑制率曲線到達平臺期；解淀粉芽孢桿菌1-16的細胞抑制率雖然隨粗提物和細胞反應時間的延長呈上升趨勢，但反應1～4 h的細胞抑制率差異不顯著。因此，綜合3株菌的試驗結果，將待測芽孢桿菌粗提物與Vero細胞反應時間確定為2 h。

圖3 不同反應時間下的細胞抑制率Fig.3 Inhibition rate of cells at different co-incubation times

2.3 不同來源的芽胞桿菌細胞毒性檢測結果

應用建立的細胞毒性試驗方法對81株芽孢桿菌的細胞毒性進行檢測，結果（表3）表明，65株芽孢桿菌的Vero細胞抑制率小于20%，無細胞毒性作用，包括41株枯草芽孢桿菌、9株地衣芽孢桿菌、9株解淀粉芽孢桿菌、2株短小芽孢桿菌、1株人參芽孢桿菌、1株副芽孢桿菌和2株貝萊斯芽孢桿菌；16株芽孢桿菌的Vero細胞抑制率大于20%，顯示出細胞毒性作用，包括3株蠟樣芽孢桿菌、3株枯草芽孢桿菌、6株解淀粉芽孢桿菌和4株貝萊斯芽孢桿菌。

表3 芽孢桿菌細胞毒性檢測及毒素分析Table 3 Cytotoxicity tests and toxin analysis of Bacillus

2.4 產毒芽胞桿菌的毒素分析

2.4.1 毒素編碼基因檢測結果 對16株具有細胞毒性的芽孢桿菌攜帶的毒素編碼基因進行檢測，結果（表3）表明，蠟樣芽胞桿菌1-19攜帶entFM、hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC7個毒素編碼基因；蠟樣芽孢桿菌1-13攜帶entFM、Cytk、hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC8個毒素編碼基因；蠟樣芽胞桿菌1-20攜帶entFM、Cytk、hblA、hblC、hblD、nheB、nheC7個毒素編碼基因；解淀粉芽孢桿菌3-29、3-33、1-18、2-15、1-16和枯草芽孢桿菌2-17、2-13、2-14及貝萊斯芽孢桿菌3-31僅攜帶hblD毒素編碼基因；貝萊斯芽孢桿菌3-34、3-32、2-16及解淀粉芽孢桿菌1-17未檢測到上述毒素編碼基因。

2.4.2 芽孢桿菌分泌毒素的耐熱性 對具有細胞毒性的16株芽孢桿菌培養(yǎng)物的上清液進行了加熱失活處理，然后檢測細胞毒性，結果（表3）表明，枯草芽孢桿菌2-14、解淀粉芽孢桿菌1-16和1-18及貝萊斯芽孢桿菌2-16粗提物經58℃處理40 min后，細胞毒性與未經熱處理時的細胞毒性差異不顯著；另12株菌（蠟樣芽孢桿菌1-13、1-19、1-20，枯草芽孢桿菌2-13、2-17，解淀粉芽孢桿2-15、3-29、1-17、3-33，貝萊斯芽孢桿菌 3-31、3-32、3-34）培養(yǎng)物的上清液58℃處理40 min后，細胞毒性與未熱處理菌株粗提物的細胞毒性差異顯著，其中，3株蠟樣芽孢桿菌粗提物經熱處理后，細胞抑制率顯著下降，推測這3株蠟樣芽孢桿菌分泌的有毒代謝產物為不耐熱的腸毒素；另9株芽胞桿菌粗提物經熱處理后細胞毒性降幅較小，加熱處理后細胞毒性為28.19%～57.23%。

2.4.3 溶血性結果 對16株具有細胞毒性的芽孢桿菌進行溶血性試驗，結果（表3）表明，蠟樣芽孢桿菌1-13、1-19和1-20的菌落周圍形成了界限分明且完全透明的溶血環(huán)，具有溶血性，即溶血類型為β-溶血；其他13株芽孢桿菌菌落周圍的培養(yǎng)基無變化，不具有溶血性，即溶血類型為γ-溶血。

2.4.4 腸毒素的特異性抗體檢測結果 對16株具有細胞毒性的芽孢桿菌是否產生腸毒素進行檢測，結果（表3）表明，蠟樣芽孢桿菌1-13、1-19和1-20（菌體濃度為108CFU·mL-1）的檢測結果呈陽性，腸毒素含量分別為16、128和 512 ng·mL-1；其余菌株檢測結果均呈陰性。

3 討論

利用細胞毒性試驗評價細菌毒性是以生物學性狀基本相同的細胞系（或株）為對象，避免了動物的使用及個體差異，且操作簡單、檢測靈敏度高，可在細胞存活的狀態(tài)下觀察細胞毒性物質，研究其對細胞結構和功能的影響，分析作用機理和量效關系[41-42]。目前，已經報道的可用作芽孢桿菌毒性評價的細胞有CHO細胞、Ped-2E9細胞和Vero細胞等，但是不同哺乳動物細胞對芽孢桿菌毒素的敏感性不同。作為受試細胞，CHO細胞不僅對產嘔吐毒素和腸毒素的蠟樣芽孢桿菌敏感，對枯草芽胞桿菌也同樣敏感[21,25]；Ped-2E9細胞對枯草芽胞桿菌的毒素不敏感[22]；Vero細胞對多種病毒和毒素敏感[28,43]。本研究表明，蠟樣芽孢桿菌、枯草芽胞桿菌、解淀粉芽孢桿菌屬部分菌株對Vero細胞具有毒性，說明Vero細胞適宜作為受試細胞用于芽孢桿菌的毒性檢測，并在此基礎上建立了一種用于快速檢測芽孢桿菌代謝物細胞毒性的方法。通過建立的細胞毒性試驗方法對實驗室分離的81株芽孢桿菌的代謝物細胞毒性進行測定，結果發(fā)現(xiàn)，16株芽孢桿菌對Vero細胞的抑制率大于20%，顯示出細胞毒性作用[28,35]；其中，3株蠟樣芽孢桿菌的細胞抑制率達90%以上，其余13株枯草芽孢桿菌類菌株的細胞抑制率為33.29%～65.38%。

芽孢桿菌中是否存在毒素編碼基因并表達產生相應的毒素是芽孢桿菌安全性評價的重要內容。?zdemir等[36]用PCR檢測法對從土耳其市場上銷售的魚肉和牛肉中分離的52株芽孢桿菌進行檢測，11株蠟樣芽孢桿菌和1株枯草芽孢桿菌攜帶2個或3個毒素編碼基因；12株芽孢桿菌攜帶hblC和hblD基因；8株攜帶hblA基因；7株攜帶nheABC基因；1株攜帶nheB和nheC基因。朱奎等[44]發(fā)現(xiàn)，從人、動物、植物和環(huán)境中益生菌產品中分離的43株蠟樣芽胞桿菌和62株枯草芽胞桿菌中約32%（37/114）的分離株攜帶腸毒素（Nhe和Hbl）編碼基因。雖然通過PCR檢測法能夠檢測出芽孢桿菌攜帶的毒素編碼基因，但基因表達受轉錄、翻譯等多層次的調控，僅檢出毒素基因并不能判定菌株是否具有毒性。因此，需結合常用的安全性檢測方法（如芽孢桿菌毒素檢測試劑盒和溶血性試驗等）[21]確認菌株產生的毒素種類。

本研究對細胞毒性試驗與PCR檢測、溶血性試驗以及抗體免疫反應試驗的結果進行比較發(fā)現(xiàn)，3株蠟樣芽孢桿菌攜帶了腸毒素entFM基因及Nhe、Hbl的所有編碼基因，并檢測出較高的腸毒素含量且具有溶血性；3種檢測方法得出的試驗結果與細胞毒性試驗的靈敏度和準確性一致。對于13株具有細胞毒性的枯草芽孢桿菌類菌株，只有部分菌株檢測出溶血性腸毒素Hbl的一個亞基，且試劑盒與溶血性試驗結果均為陰性，因此，無法判定其安全性。但細胞毒性試驗及熱處理試驗結果表明，13株枯草芽孢桿菌類菌株產生有毒代謝產物，且這些代謝產物可能具有較好的耐熱性。研究表明，枯草芽孢桿菌類菌株可分泌熱穩(wěn)定性的脂肽類毒素[13]，該類物質能作用于細菌細胞膜，破壞膜的穩(wěn)定性并產生穿孔現(xiàn)象，同時也會對哺乳動物細胞產生毒性，導致細胞活性降低或死亡。因此，通過本研究建立的細胞毒性試驗能更靈敏地反映枯草芽孢桿菌的毒性，而針對毒素編碼基因的PCR法等更適用于蠟樣芽胞桿菌。綜上所述，與傳統(tǒng)的毒素編碼基因PCR法及抗體免疫反應等芽孢桿菌安全性評價方法相比，本研究建立的細胞毒性試驗能更準確、更靈敏地體現(xiàn)芽孢桿菌的毒性，且周期短、操作簡單、測樣量大，可作為初步選育益生芽孢桿菌的安全評估方法。