蘇煜， 黃劭理

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2.廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，南寧 530001）

烤煙為葉用經(jīng)濟(jì)作物，其煙葉品質(zhì)的優(yōu)劣直接決定了經(jīng)濟(jì)效益的高低，因此應(yīng)給予煙葉生長(zhǎng)所需的充足養(yǎng)分?；瘜W(xué)肥料雖釋效快，但養(yǎng)分易流失，長(zhǎng)期大量施用會(huì)引發(fā)水質(zhì)污染、土壤酸化板結(jié)和土傳病害等生態(tài)問(wèn)題［1-3］，繼而對(duì)煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生不利影響。有機(jī)肥不僅能有效改良土壤肥力、活化土壤養(yǎng)分、提高土壤相關(guān)酶活力、克服土壤連作障礙，還可降低土傳病害的發(fā)生［4-6］?；逝c生物有機(jī)肥的合理配施能夠有效培肥土壤，協(xié)調(diào)煙葉化學(xué)成分，改良品質(zhì)［7］，彌補(bǔ)施用單一肥料的缺陷。大量研究報(bào)道了生物有機(jī)肥對(duì)烤煙根際土壤微生物的影響：張?jiān)苽サ龋?］研究表明，增施生物有機(jī)肥能提高烤煙根際土壤微生物數(shù)量和碳源利用強(qiáng)度，明顯改變烤煙根際微生物的群落功能；趙蘭鳳等［9］認(rèn)為，生物有機(jī)肥可以增加根際土壤微生物活性；黃玥［10］研究也表明，生物有機(jī)肥可以增加烤煙根際細(xì)菌和放線菌的數(shù)量，但對(duì)真菌無(wú)顯著影響。有關(guān)生物有機(jī)肥和化肥配施的研究大多集中于對(duì)根際微生物的影響，而對(duì)烤煙葉片光合特性的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究從烤煙的光合特性、土壤根際微生物數(shù)量和群落多樣性的角度進(jìn)行分析，探究施用不同配比生物有機(jī)肥對(duì)煙葉光合特性和根際土壤微生物的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2019年1—7月在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)中南煙草試驗(yàn)站進(jìn)行。土壤為沙質(zhì)壤土，前茬作物為水稻，土壤基本理化性狀為：有機(jī)質(zhì) 21.85 g·kg?1、堿解氮 126 mg·kg?1、速效磷 27.48 mg·kg?1、速效鉀 115.32 mg·kg?1、pH 6.2。供試品種為湘煙3號(hào)?；蕿闊煵輰Ｓ脧?fù)合肥，N、P2O5、K2O含量分別為14%、16%、15%，總養(yǎng)分≥45%。生物有機(jī)肥由湖南百田新型肥料化工有限公司提供，以動(dòng)物糞便和植物秸稈為主要原料，含CSP3復(fù)合有益活性促生菌、內(nèi)合枯草芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌及巨大芽孢桿菌等高效有益活性菌，其中，N、P2O5和K2O含量分別為0.8%、1%和4%，N-P2O5-K2O含量≥5%，有機(jī)質(zhì)含量≥45%，有益活菌數(shù)≥0.2億·g?1，氨基酸含量≥10%，腐植酸含量≥10%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置常規(guī)化肥處理（100%化肥，CK）、T1 處理（90%化肥+1 500 kg·hm?2生物有機(jī)肥）、T2處理（80%化肥+3 000 kg·hm?2生物有機(jī)肥）、T3處理（70%化肥+4 500 kg·hm?2生物有機(jī)肥）共4個(gè)處理。CK施氮量按120 kg·hm?2施入，T1、T2和T3處理化肥施氮量分別按108 kg·hm?2、96 kg·hm?2和 84 kg·hm?2施入。各處理均按照基肥∶追肥為6∶4施入，總養(yǎng)分比為N∶P2O5∶K2O＝1∶1∶2.4。生物有機(jī)肥作基肥全施，N和K2O不足部分用硫酸銨和硫酸鉀補(bǔ)齊。每個(gè)處理3次重復(fù)，共12個(gè)小區(qū)。每個(gè)小區(qū)植煙50株，株行距為0.5 m×1.2 m，小區(qū)面積30 m2。田間管理按當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)栽培措施進(jìn)行。

1.3 取樣與指標(biāo)測(cè)定

在烤煙旺長(zhǎng)期（移栽后60 d）測(cè)定光合速率，選擇在天氣晴朗的上午11：00，采用Li-6400便攜式光合作用測(cè)定儀（美國(guó)LI-COR公司生產(chǎn)）從底部葉往上數(shù)選取煙株的第8片葉測(cè)定煙葉的凈光合速率（net photosynthetic rate，Pn）、氣孔導(dǎo)度（stomataconductance，Gs）、胞 間 CO2濃 度（intercellular CO2concentration，Ci）和 蒸 騰 速 率（transpiration rate，Tr）；用便攜式SPAD儀（北京海天友誠(chéng)科技有限公司生產(chǎn)）測(cè)定同一片煙葉的葉綠素SPAD值。同期（移栽后60 d），采用五點(diǎn)取樣法從每個(gè)小區(qū)選取5株生長(zhǎng)較一致的煙株，通過(guò)抖土法采集根系土樣，用于測(cè)定根際土壤微生物數(shù)量和碳代謝特征。采用稀釋平板計(jì)數(shù)法對(duì)細(xì)菌（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）、真菌（馬丁式培養(yǎng)基）和放線菌（高氏一號(hào)培養(yǎng)基）的數(shù)量和多樣性進(jìn)行分析［11］。不同碳源利用能力及代謝特征的測(cè)定采用BIOLOG ECO微平板法［12］，具體步驟如下：稱取5 g土樣置于高壓滅菌的三角瓶中，加入0.85%氯化鈉100 mL，封口，120 r·min?1振蕩30 min，冰浴中靜置2 min，取5 mL上清液至100 mL滅菌三角瓶中，加入45 mL無(wú)菌水，重復(fù)稀釋3次，制得1∶1 000的提取液，立即用于ELISA反應(yīng)。將BIOLOG ECO平板預(yù)熱到25℃，用移液器取150μL提取液于各孔中，28℃恒溫培養(yǎng)，分別在0、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240 h 用BIOLOG 讀板儀測(cè)定吸光值（590 nm）［13］。用BIOLOG ECO平板每孔顏色平均變化率（average well color development，AWCD）來(lái)表征土壤微生物對(duì)碳源的利用能力［14］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析，用SPSS 17.0進(jìn)行顯著性分析，用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行主成分分析及灰色關(guān)聯(lián)度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 增施生物有機(jī)肥對(duì)烤煙光合特性的影響

葉綠素含量是衡量植物衰老程度的重要參數(shù)，與植物光合作用的進(jìn)行密切相關(guān)。旺長(zhǎng)期由于煙株體內(nèi)代謝旺盛，養(yǎng)分利用率高，促進(jìn)了葉綠素的合成。增施生物有機(jī)肥處理的煙葉SPAD值均顯著高于對(duì)照，且生物有機(jī)肥配比越高，變化越明顯（表1）。凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導(dǎo)度（Gs）和胞間CO2濃度（Ci）的變化趨勢(shì)較一致，各參數(shù)均呈現(xiàn)出隨生物有機(jī)肥配施量的增加而增大的趨勢(shì)（表1）。王通明等［15］認(rèn)為，有機(jī)肥的施用能延緩煙株的衰老，提高煙葉合成淀粉的能力和葉片光能利用率。生物有機(jī)肥中含有豐富的有機(jī)質(zhì)和諸多有益菌種，能夠有效延緩葉綠素的降解速率，使得煙株的碳代謝強(qiáng)度得以增強(qiáng)，從而為葉綠素的生物合成提供更多的碳骨架和能量。

表1 不同生物有機(jī)肥處理下烤煙的光合特性Table 1 Photosynthetic characteristics of flue-cured tobacco with different treatment of bio-organic fertilizer

2.2 生物有機(jī)肥對(duì)烤煙根際土壤微生態(tài)的影響

2.2.1 生物有機(jī)肥對(duì)微生物數(shù)量的影響 細(xì)菌、真菌、放線菌是土壤微生物中的主要菌類，具有氧化、硝化、氨化、固氮和硫化等功能，在土壤有機(jī)物質(zhì)的分解轉(zhuǎn)化過(guò)程中起主導(dǎo)作用［16］。表2表明，生物有機(jī)肥用量的增加促進(jìn)了細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量的增加，總體微生物數(shù)量呈現(xiàn)細(xì)菌＞放線菌＞真菌。各處理間的細(xì)菌數(shù)量存在顯著差異，表現(xiàn)為T3＞T2＞T1＞CK。相較于CK，T2和T3處理的真菌數(shù)量分別增長(zhǎng)了15.6%和16.8%，但T1與CK處理間差異不顯著。施用生物有機(jī)肥顯著提高了根際放線菌數(shù)量，相較于CK，T1、T2和T3處理的放線菌數(shù)量分別增加了33.9%、72.4%和86.2%，表明施用生物有機(jī)肥有益于微生物的生長(zhǎng)和繁殖，提升了根際土壤微生物的密度。

表2 不同生物有機(jī)肥用量下土壤微生物的數(shù)量Table 2 The amount of microorganism in soil with different amount of bio-organic fertilizer

2.2.2 生物有機(jī)肥對(duì)土壤微生物碳代謝指紋的影響 碳源AWCD是單一碳源利用能力的重要參數(shù)，反映了土壤微生物活性，AWCD值與碳源利用能力呈正相關(guān)［17-18］。圖1表明，0～24 h內(nèi)土壤微生物活性較低；24～72 h區(qū)間內(nèi)微生物活性急速上升，碳源利用力增強(qiáng)；72～144 h內(nèi)，土壤微生物對(duì)碳源的利用能力仍在提升但增速逐漸放緩；144 h以后，AWCD值趨于平穩(wěn)。AWCD值隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，表明土壤微生物對(duì)31種碳源利用能力在不斷增強(qiáng)，且不同處理AWCD值差異顯著，配施生物有機(jī)肥處理的AWCD值明顯高于CK處理。在生物有機(jī)肥的作用下，根際微生物活性增強(qiáng)，碳源利用強(qiáng)度和程度均得到提高。

圖1 不同生物有機(jī)肥用量下烤煙根際土壤微生物AWCD值動(dòng)態(tài)變化Fig.1 AWCD value dynamics over incubation time in the rhizosphere of flue-cured tobacco with different amount of bio-organic fertilizer

2.2.3 生物有機(jī)肥對(duì)微生物不同種類碳源利用強(qiáng)度的影響 將31種碳源分為糖類、氨基酸類、聚合類、酚類、胺類和羧酸類共6大類，不同施肥處理下土壤微生物對(duì)各類碳源的利用偏好存在差異。相較于CK，配施生物有機(jī)肥能夠不同程度地提高各類碳源的利用能力（圖2）。T3處理中，微生物對(duì)各類碳源的利用率皆高于其他處理，其中對(duì)糖類碳源的利用率較CK提高了291%。但T1、T2和T3處理間，生物有機(jī)肥施用量的差異并未對(duì)胺類碳源利用率的提升起到明顯作用；氨基酸類、酚類和羧酸類碳源的利用能力在T2和T3處理間也無(wú)顯著差異。由此表明，增施生物有機(jī)肥，碳源利用能力得到提高，達(dá)到一定值后，生物有機(jī)肥用量與碳源利用率的相關(guān)性降低，碳源利用力趨于穩(wěn)定。

圖2 根際土壤微生物對(duì)不同種類碳源的利用能力Fig.2 Utility for different types of carbon sources by rhizospheric microbes in soil with different amount of bio-organic fertilizer

2.2.4 不同碳源主成分分析 為探究配施不同用量的生物有機(jī)肥處理下土壤微生物群落對(duì)31種單一碳源的利用，提取4個(gè)主成分因子（表3），主成分1（PC1）可以解釋碳源利用64.705%的變異；主成分2（PC2）可以解釋14.544%；前兩個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到79.249%。主成分3（PC3）和主成分4（PC4）的方差貢獻(xiàn)率較小，分別為9.996%和4.105%。

表3 主成分貢獻(xiàn)率Table 3 Contribution rate of principal component

PC1和PC2分析結(jié)果（表4）表明，對(duì)PC1貢獻(xiàn)較大的碳源有27個(gè)（載荷值＞0.6），羧酸類占22.58%、糖類占19.35%、氨基酸類占19.35%、聚合類占12.90%、酚類和胺類各占6.45%。糖類碳源中D-甘露醇、氨基酸類中L-天冬酰胺酸和羧酸類α-丁酮酸對(duì)PC1的載荷值較高；與PC2相關(guān)性較高的2個(gè)碳源（載荷值＞0.6）分別為糖類中的β-甲基 D-葡萄糖苷和 D，L-α-甘油。除 D，L-α-甘油和α-D-乳糖外，其他碳源與PC1的相關(guān)性皆高于PC2。

表4 主成分載荷值Table 4 Loading values of principal components

2.2.5 微生物群落多樣性分析 根據(jù)根際微生物AWCD動(dòng)態(tài)變化和碳源利用總能力情況，選取144 h的平均吸光度數(shù)值來(lái)分析不同生物有機(jī)肥施用量下土壤微生物群落的多樣性差異。結(jié)果（表5）表明，Shannon豐富度指數(shù)、Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)和McIntosh均勻度指數(shù)在生物有機(jī)肥處理下均有所升高，總體表現(xiàn)為T3＞T2＞T1＞CK，各生物有機(jī)肥處理與CK處理間均存在顯著差異。而T1、T2、T3處理間，Shannon和Simpson指數(shù)差異不顯著，表明生物有機(jī)肥的施用量對(duì)群落豐富度和優(yōu)勢(shì)度的提升無(wú)顯著影響。

表5 土壤微生物群落多樣性Table 5 The diversity of microbial community in soil

2.3 烤煙光合特性與土壤微生物部分參數(shù)關(guān)聯(lián)度分析

通過(guò)灰色關(guān)聯(lián)度分析，對(duì)施用生物有機(jī)肥下微生物與光合特征指數(shù)、微生物多樣性及碳源利用程度的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行探究，結(jié)果（表6）表明，與光合特性的表征參數(shù)葉綠素SPAD值、凈光合速率（Pn）以及微生物豐富度和優(yōu)勢(shì)度指數(shù)的關(guān)聯(lián)性表現(xiàn)為細(xì)菌＞放線菌＞真菌＞生物有機(jī)肥；與微生物均勻度和碳源利用能力關(guān)聯(lián)程度較大的參數(shù)是放線菌，關(guān)聯(lián)度較小的參數(shù)是生物有機(jī)肥。相較于生物有機(jī)肥，根際微生物與烤煙葉片光合性能、土壤微生物群落多樣性和碳源利用能力的關(guān)聯(lián)性更強(qiáng)。

表6 光合參數(shù)與土壤微生物多樣性的關(guān)聯(lián)度Table 6 Correlation between photosynthetic parameters and soil microbial diversity

3 討論

相較于單施化肥，配施生物有機(jī)肥后，烤煙葉片的光合能力增強(qiáng)，根際土壤微生物的菌群密度和活躍率增加，與張?jiān)苽サ龋?0］的研究結(jié)果一致；土壤微生物的均勻度、優(yōu)勢(shì)度及群落豐度均得到提高，但生物有機(jī)肥的施用量對(duì)土壤微生物的多樣性無(wú)顯著影響。綜合各性狀的表現(xiàn)，70%化肥配施4 500 kg·hm?2生物有機(jī)肥處理效果最佳。

生物有機(jī)肥中含有大量的益菌群和有機(jī)質(zhì)，外源有益菌種和活性碳源的介入豐富了土壤中可利用的養(yǎng)分，在一定程度上活化了土壤微生物，同時(shí)也加劇了微生物間的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)。相較于生物有機(jī)肥，根際微生物數(shù)量與煙葉中葉綠素SPAD值和光合速率的關(guān)聯(lián)性更強(qiáng)，有研究表明微生物對(duì)植株葉綠素?zé)晒鈪?shù)和有效光的利用產(chǎn)生提高效應(yīng)［21-23］，由此說(shuō)明微生物對(duì)煙葉光合性能的改善起到一定的調(diào)節(jié)作用。微生物中細(xì)菌對(duì)生物有機(jī)肥的增施最為敏感，這可能與供試肥料中主要功能菌為芽孢桿菌類細(xì)菌有關(guān)?？莶菅挎邨U菌等有益微生物能利用土壤中的有機(jī)質(zhì)，產(chǎn)生大量生長(zhǎng)素和赤霉素等次級(jí)代謝物，促進(jìn)了烤煙的生長(zhǎng)發(fā)育，從而實(shí)現(xiàn)微觀效應(yīng)向表觀參數(shù)優(yōu)化的轉(zhuǎn)變。且外源介入的細(xì)菌與本土細(xì)菌形成了共生增殖的關(guān)系，對(duì)土壤營(yíng)養(yǎng)物的轉(zhuǎn)化、供應(yīng)能力及土壤肥力產(chǎn)生不同程度的影響。