張濤， 宋海云， 賀鵬， 韋媛榮， 許鵬， 譚秋錦，鄭樹芳， 覃振師， 陸宇明， 王文林*

（1.廣西農(nóng)業(yè)科學院廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學研究所，廣西 崇左 532415；2.廣西農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所，南寧 530007）

澳洲堅果（Macadamia ternifoliaF.Muell.）是熱帶、亞熱帶多年生的常綠喬木果樹［1］，又名夏威夷果、昆士蘭堅果，原產(chǎn)于澳大利亞昆士蘭州東南部和新南威爾州北部沿海的亞熱帶雨林地區(qū)，為山龍眼科（Proteaceae）澳洲堅果屬（Macadamia）。我國于20世紀70年代引進并開始在云南、廣東、廣西等地種植［2］。目前，我國澳洲堅果種植面積居世界第一位，已被國家列入特色木本糧油推廣種植樹種，是適宜地區(qū)特色產(chǎn)業(yè)的重要收入來源和脫貧致富的主要途徑［3］。

澳洲堅果果仁營養(yǎng)豐富，有獨特的奶油香味，是世界上品質(zhì)較佳的食用果之一。澳洲堅果果仁脂肪含量高［4］，同時也是很好的蛋白質(zhì)來源，所含必需氨基酸的量可以滿足成人和兒童每日所需［5］。郭剛軍等［6-7］采用氨基酸自動分析儀、凱氏定氮法及蒽酮?硫酸法等方法研究了澳洲堅果粕的營養(yǎng)成分和氨基酸組成，結(jié)果顯示，澳洲堅果粕中含有17種氨基酸，包含全部人體必需氨基酸，且配比均衡，可作為人體氨基酸營養(yǎng)平衡的優(yōu)質(zhì)食品原料；杜麗清等［8-9］采用全自動氮基酸分析儀研究了澳洲堅果果仁氨基酸組成，發(fā)現(xiàn)澳洲堅果果仁富含17種氨基酸，其中包含7種人體必需氨基酸，且必需氨基酸占氨基酸總量的比例穩(wěn)定，主要以脂肪族氨基酸為主，芳香族和雜環(huán)族氨基酸也占有較大的比例；宋海云等［10］采用全自動氮基酸分析儀研究了不同日期采摘的不同品種澳洲堅果果仁的氨基酸組成，結(jié)果顯示，澳洲堅果果仁中含有7種人體必需氨基酸，其中蛋氨酸含量在不同品種間差異較大，且必需氨基酸含量與氨基酸總量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，各種氨基酸的比例均衡且有較高的營養(yǎng)價值。以上研究表明，無論是澳洲堅果果仁還是壓榨去油后的果粕，均含有人體必需氨基酸，且種類齊全、配比均衡穩(wěn)定，部分種類氨基酸含量在不同品種間存在差異。因此，根據(jù)氨基酸組分差異篩選某種必需氨基酸或者功能性氨基酸含量高的優(yōu)良澳洲堅果品種在理論上是可行的，這將有助于澳洲堅果優(yōu)良品種的選育和種植推廣，對澳洲堅果資源的高值化利用也具有重要指導(dǎo)意義。

本課題組在前期試驗中發(fā)現(xiàn)，GR1、JW、B7等10份澳洲堅果種質(zhì)的農(nóng)藝性狀較優(yōu)，其果仁蛋白質(zhì)含量較高。本研究以這10份澳洲堅果優(yōu)良種質(zhì)為試驗材料，通過檢測分析不同澳洲堅果種質(zhì)的氨基酸組成及含量，結(jié)合系統(tǒng)聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）和正交偏最小二乘法?判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）［11-15］等多元統(tǒng)計分析方法對不同澳洲堅果種質(zhì)的氨基酸品質(zhì)特征展開分析評價，以期了解不同澳洲堅果種質(zhì)與其果仁氨基酸組分之間的關(guān)系，為選育適合氨基酸飲料加工的澳洲堅果品種提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取種植于廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學研究所澳洲堅果種質(zhì)資源圃的GR1、JW、B7、B4、B3、A4、HJ、A16、A38、SH 共10份澳洲堅果優(yōu)良種質(zhì)，于2019年9—10月每份種質(zhì)選取長勢樹形相近的15株樹，每5株為一個生物學重復(fù)，即每份種質(zhì)3次重復(fù)，在果樹東、南、西、北4個方向，分別選取果實大小相對均勻、成熟度基本一致且無病蟲害的果實鮮樣。樣品帶回實驗室脫外層青皮后，低溫烘干至果仁水分降至1.5%±0.5%后取出，自然晾干真空包裝備用。

試劑：6 mol·L?1鹽酸溶液、100 nmol·mL?117種混合氨基酸標準溶液（百靈威科技有限公司）、茚三酮染色劑、500 g·L?1氫氧化鈉溶液和pH 2.2檸檬酸鈉緩沖溶液［c（Na＋）＝0.2 mol·L?1］。

1.2 主要儀器與設(shè)備

澳洲堅果開果器、高速萬能粉碎機（溫嶺市百樂粉碎設(shè)備廠）、AR224NC型萬分之一電子分析天平（奧豪斯儀器有限公司）、全自動氨基酸分析儀（日本日立公司）、GZX-9246MBE電熱鼓風干燥箱（日本日立公司）、氮氣吹掃儀（杭州安研儀器制造股份有限公司）、Vortex-Genie2T型美國SI渦旋振蕩器（美國Scientific Industries公司）、恒溫水浴鍋［冠森生物科技（上海）有限公司］。

1.3 試驗方法

1.3.1 水解氨基酸的制備 參考宋亞康等［16］的方法制備水解氨基酸，并略加改動。準確稱取澳洲堅果果仁粉碎樣品0.600 0 g于水解試管中，加入 6 mol·L?1的鹽酸溶液 15 mL，置于渦旋振蕩器混勻；再將水解管放入冷凍劑中，冷凍3～5 min后抽真空（接近0Pa），充入氮氣，重復(fù)抽真空?充入氮氣3次后，在充氮氣狀態(tài)下封口，封口狀態(tài)下置于電熱鼓風干燥箱中110℃消化24 h；取出冷卻后將溶液倒入50 mL容量瓶中定容，準確吸取1 mL樣品液于15 mL試管內(nèi)，60℃水浴使酸完全蒸發(fā)；最后加入2 mL檸檬酸鈉緩沖液（pH 2.2）到干燥后試管內(nèi)溶解，震蕩混勻后，吸取溶液通過0.45μm濾膜過濾，過濾后的樣品液備用。

1.3.2 水解氨基酸的檢測 采用全自動氨基酸分析儀對樣品水解氨基酸的組成和含量進行檢測。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

1.4.1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用Excel 2007軟件對數(shù)據(jù)進行整理統(tǒng)計。采用SPSS 26.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，采用鄧肯氏復(fù)極差測驗法（Duncan’s multiple-range test）進行檢驗［17-18］。

1.4.2 聚類分析 根據(jù)不同澳洲堅果種質(zhì)果仁樣品中氨基酸組成及含量測定結(jié)果，采用SPSS 26.0軟件對不同澳洲堅果種質(zhì)果仁樣品進行聚類分析，所用方法為Ward法和歐氏距離平方法［19-21］。

1.4.3 判別分析 采用SIMCA 14.1軟件對聚類結(jié)果進行OPLS-DA分析，篩選特征性氨基酸組分［22-24］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同澳洲堅果種質(zhì)果仁氨基酸的組成與含量

對不同澳洲堅果種質(zhì)果仁氨基酸組成及含量、氨基酸總量、必需氨基酸總量和藥效氨基酸總量進行分析，結(jié)果（表1）表明，澳洲堅果果仁中氨基酸種類齊全，含有17種氨基酸組分，其中，必需氨基酸7種，半必需氨基酸2種，藥效氨基酸9種。Glu、Arg、Asp、Leu、Gly 5種氨基酸在各澳洲堅果種質(zhì)果仁中的平均含量較高；His、Cys、Met在各澳洲堅果種質(zhì)中的平均含量較低。

表1 不同澳洲堅果種質(zhì)果仁氨基酸組成及含量Table1 Amount and composition of amino acid of Macadamia ternifolia among different germplasms

對10份種質(zhì)進行比較，JW中 Lys、His、Arg、Asp、Ser、Glu、Pro、Ala、Asp、Leu含量最高，其中，Leu含量與B7、A38差異不顯著，但顯著高于其他種質(zhì)（P＜0.05），Arg和Glu含量顯著高于其他種質(zhì)（P＜0.05），氨基酸總量和藥效氨基酸總量也最高，顯著高于其他種質(zhì)（P＜0.05）；A38中必需氨基酸總量最高，與B7、HJ和SH差異不顯著，但顯著高于其他種質(zhì)（P＜0.05）；A4中氨基酸總量、必需氨基酸總量和藥效氨基酸總量均最低，顯著低于其他種質(zhì)（P＜0.05）。

從不同澳洲堅果種質(zhì)間各氨基酸含量的變異系數(shù)看，Cys、Pro、Glu、Tyr、Arg變異系數(shù)較大，Val、Ala變異系數(shù)較小，表明澳洲堅果不同種質(zhì)果仁中 Cys、Pro、Glu、Tyr、Arg含量差異較大，Val、Ala含量的差異相對較?。凰幮О被峥偭孔儺愊禂?shù)較大，其中Glu、Arg兩種藥效氨基酸含量的變異系數(shù)排在前兩位；氨基酸總量的變異系數(shù)次之；必需氨基酸總量變異系數(shù)最小，但必需氨基酸中Met含量的變異系數(shù)較大，表明澳洲堅果果仁中藥效氨基酸總量在不同種質(zhì)間差異較大，其中Glu和Arg兩種藥效氨基酸的差異明顯；不同種質(zhì)間氨基酸總量差異次之；不同種質(zhì)間必需氨基酸總量的差異性相對較小，但Met在不同種質(zhì)間差異較大。

2.2 聚類分析

對10份澳洲堅果種質(zhì)進行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果（圖1）表明，當類遺傳距離為10時，10份澳洲堅果種質(zhì)明顯地被劃分為2類：第Ⅰ類包含B4、B3、A16和A4，占總材料數(shù)的40%；第Ⅱ類包括GR1、B7、SH、HJ、A38和JW，占總材料數(shù)的60%。

圖1 不同澳洲堅果種質(zhì)的系統(tǒng)聚類分析譜系Fig.1 Dendrogram of HCA of Macadamia ternifolia nuts among different germplasms

對不同類群澳洲堅果種質(zhì)氨基酸含量的平均值進行分析，結(jié)果（表2）表明，第Ⅱ類群的17種氨基酸和3類氨基酸的平均值均高于第Ⅰ類群，其中，Arg、Glu含量及氨基酸總量、必需氨基酸總量、藥效氨基酸總量在兩類群間存在顯著差異，表明第Ⅱ類澳洲堅果種質(zhì)的氨基酸綜合品質(zhì)更好。

表2 不同類群澳洲堅果種質(zhì)的氨基酸含量Table 2 Contents of amino acids in different cluster of Macadamia germplasms （g·100 g?1）

2.3 聚類結(jié)果的OPLS-DA

2.3.1 建立基于氨基酸組分判別2類澳洲堅果種質(zhì)的PLS-DA模型 以17種氨基酸和3類氨基酸數(shù)據(jù)為X變量，10份澳洲堅果種質(zhì)為Y變量進行OPLS-DA分析，建立氨基酸組分與2類澳洲堅果種質(zhì)樣本之間的關(guān)系模型，通過S-plot圖初步篩選具有代表性的氨基酸組分，觀察置換20次檢驗圖的直線斜率判定模型是否存在過擬合現(xiàn)象，并通過計算變量投影重要度（variable important for the projection，VIP）判別各氨基酸組分對各組樣本分類判別的影響強度和解釋能力，篩選特征性氨基酸組分［24-28］。

由圖2可知，各澳洲堅果種質(zhì)聚類趨勢明顯，即建立的PLS-DA模型有良好的擬合參數(shù)，其中R2x為 0.932，R2x越接近 1，模型越穩(wěn)定；R2Y為0.758，R2Y越大，模型的解釋能力越強，樣本可信度全部處于95%置信區(qū)間內(nèi)；Q2為0.641，Q2大于0.5，說明模型的預(yù)測能力較強。

圖2 澳洲堅果種質(zhì)OPLS-DA得分圖和Hotelling T2分布圖Fig.2 OPLS-DA score scatter plot and Hotelling T2distribution plot of Macadamia germplasms

2.3.2 模型的可靠性驗證 分別對2類澳洲堅果種質(zhì)的判別模型進行20次置換后驗證，結(jié)果（圖3）表明，2個模型Q2的一元線性回歸曲線在縱軸上的截距均小于零，說明2個模型均不存在過擬合現(xiàn)象，模型可靠，可用于2類澳洲堅果種質(zhì)的判別分析。

圖3 PLS-DA模型置換驗證Fig.3 PLS-DA model replacement validation plots

2.3.3 對2類澳洲堅果種質(zhì)的判別起關(guān)鍵作用的氨基酸組分鑒定 圖4A是OPLS-DA分析得到的二維載荷圖，反映了各變量對不同澳洲堅果種質(zhì)果實在得分圖上分布的影響，離密集區(qū)越遠的變量對樣本區(qū)分的影響越大，同時每一類別（Y）附近的變量（X）均在該類別的樣品中相對含量較大［24］。圖4B是變量重要性VIP值圖，通常認為VIP＞1.0的變量在判別過程中具有重要作用［24］，VIP值越大，所對應(yīng)的氨基酸組分在不同澳洲堅果種質(zhì)果實間的差異越顯著。結(jié)合圖4，確定有5種氨基酸組分VIP值大于1，分別為Glu、Arg、氨基酸總量、必需氨基酸總量和藥效氨基酸總量，這些組分離密集區(qū)較遠，屬于組間差異顯著的特征性組分。由圖4還可知，變量（X）明顯靠近Y（Ⅱ），表明20種氨基酸組分在第Ⅱ類澳洲堅果種質(zhì)中相對含量較高，其中Glu、Arg和Asp含量及氨基酸總量、必需氨基酸總量、藥效氨基酸總量最為明顯。

圖4 澳洲堅果種質(zhì)氨基酸組分OPLS-DA得分圖和VIP值Fig.4 OPLS-DA score scatter plot and VIP value of amino acid composition in Macadamia germplasms

3 討論

Mahesh等［29］對杏仁、巴西堅果、腰果、榛子、澳洲堅果、美洲山核桃、松子、開心果、核桃、弗吉尼亞花生10種堅果仁中的氨基酸組成及含量進行了檢測分析，均檢測出包括Trp在內(nèi)的18種氨基酸，且均含有7種人體必需的氨基酸，其中Glu、Arg和Asp 3種氨基酸的平均含量在10種堅果仁中均排在前3位；杏仁中Glu含量最高，松子中Arg含量最高，弗吉尼亞花生中Asp含量最高。杜麗清等［8］對湛江地區(qū)5個澳洲堅果主栽品種（HAES 246、HAES 800、H2、O.C、own venture）果實樣品的氨基酸含量進行了差異性分析，發(fā)現(xiàn)5個品種的果仁均含有17種氨基酸，未檢測到Trp，其中Glu含量最高，Arg次之，Asp第3；各品種均含有7種人體必需的氨基酸，且人體必需氨基酸占總氨基酸比例的變異系數(shù)很?。辉?種人體必需氨基酸中，Met含量的變異系數(shù)最大，Phe的變異系數(shù)最小。本研究從10份澳洲堅果種質(zhì)果仁樣品中也只檢測到17種氨基酸，其中Glu、Arg、Asp 3種氨基酸含量較高；同時也含有7種人體必需的氨基酸，必需氨基酸總量變異系數(shù)較小，其中Met含量的變異系數(shù)最大，與前人研究結(jié)果相一致，表明各類堅果的氨基酸組成差異較小，但含量存在顯著差異。本研究未檢測到Trp，這可能與試驗方法有關(guān)。本研究還對不同澳洲堅果種質(zhì)果仁樣品的藥效氨基酸進行了分析，表明藥效氨基酸總量變異系數(shù)較大，其中Glu和Arg藥效氨基酸含量的變異系數(shù)較大。藥效氨基酸含量的豐富變異為選育功能性氨基酸（Glu、Arg）含量高的優(yōu)良澳洲堅果品種提供了可能與依據(jù)。

譚秋錦等［30］對12份澳洲堅果種質(zhì)（GR1、JW、B7、B4、B3、A4、HJ、344、788、A16、A38、SH）果仁的10個主要營養(yǎng)成分進行了變異分析、相關(guān)分析、主成分分析和聚類分析，結(jié)果表明，在不同澳洲堅果果仁的營養(yǎng)成分中，礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、氨基酸和脂肪差異明顯，并將12份種質(zhì)聚為3類，并篩選出3個果實綜合品質(zhì)較好的種質(zhì)（B7、B4和JW），其中，B7和JW的礦質(zhì)元素、蛋白質(zhì)和氨基酸含量較高。本研究對10份澳洲堅果種質(zhì)也進行了聚類分析，結(jié)果將10份澳洲堅果種質(zhì)聚為2類，其中，第Ⅱ類（GR1、B7、SH、HJ、A38、JW）氨基酸綜合品質(zhì)較高；OPLS-DA分析進一步驗證了系統(tǒng)聚類結(jié)果，并發(fā)掘出2類間差異顯著的特征性氨基酸組分，再次證明第Ⅱ類澳洲堅果種質(zhì)的氨基酸綜合品質(zhì)較好，可作為選育適合功能性氨基酸飲料加工的澳洲堅果品種的種質(zhì)資源，為澳洲堅果的有效選育以及澳洲堅果氨基酸的高值化利用供理論支撐。