孫曉春， 黃文靜， 李鉑

（陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽 712083）

桔梗（Platycodon grandiflorus（Jacq.）A.DC）為桔梗科多年生草本植物，具有祛痰止咳、抗腫瘤、降血糖等多種藥理功效［1-2］。目前，隨著桔梗越來越多的藥用價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值被發(fā)現(xiàn)，人們對(duì)桔梗的需求量逐年增大。干旱已成為影響植物生長(zhǎng)的普遍存在的問題。植物通過形態(tài)變化、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累、抗氧化酶活性提高等應(yīng)答機(jī)制來抵御干旱脅迫［3］。葉綠素是植物葉綠體內(nèi)參與光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，葉綠素的生物合成由多基因調(diào)控。葉綠素酸酯a氧化酶（chlorophyllide a oxygenase，CAO）催化葉綠素酸酯b的形成，葉綠素合酶（chlorophyll synthase，CHLG）催化葉綠素酸酯a、b合成葉綠素 a、b［4］。干旱脅迫下，植物體內(nèi)的脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)被積累，其含量的升高有利于提高植物對(duì)干旱脅迫的抗性。吡咯啉-5-羧酸還原酶（pyrroline-5-carboxylate reductase，P5CR）是廣泛存在于原核和真核生物中的重要看家蛋白，其主要功能是在NAD（P）H的作用下，將吡咯啉-5-羧酸（P5C）轉(zhuǎn)化為脯氨酸［5］。過氧化物酶（peroxidase，POD）催化過氧化氫參與各種還原劑的氧化反應(yīng)［6］。研究表明，添加外源物質(zhì)可提高植物的抗逆能力［7-8］。水楊酸（salicylic acid，SA）是植物體內(nèi)的一種小分子酚類物質(zhì)，能調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，包括種子萌發(fā)、果實(shí)成熟、開花、衰老以及對(duì)生物和非生物脅迫的防御反應(yīng)［9］。SA能有效增強(qiáng)紫御谷對(duì)干旱、高溫的抵抗能力［10］。馬樂元等［11］研究表明，外源添加水楊酸能夠降低干旱脅迫下小冠花葉片的活性氧水平，提高小冠花葉片抗氧化能力。蔣明敏等［12］研究表明，較低濃度水楊酸可顯著提高石蒜的抗旱性，而高濃度則發(fā)生毒害作用。

本研究室前期研究表明，20%PEG脅迫下，外源添加水楊酸可提高桔梗葉片中超氧化物歧化酶、過氧化物酶、抗壞血酸過氧化物酶活性及可溶性糖和脯氨酸含量［13］。而不同程度干旱脅迫下，水楊酸對(duì)桔梗生理生化指標(biāo)的影響以及分子機(jī)制尚未見報(bào)道。因此，本研究以不同濃度PEG6000模擬干旱脅迫，同時(shí)外源添加不同濃度水楊酸處理，對(duì)不同處理下桔梗葉片和根中葉綠素、丙二醛、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量和保護(hù)酶活性進(jìn)行比較；同時(shí)檢測(cè)葉綠素合成相關(guān)基因CAO、CHLG、POD和脯氨酸代謝相關(guān)基因P5CR表達(dá)量的變化，為解析外源SA提高桔?？垢珊的芰Φ姆肿訖C(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

桔梗種子購自河北省保定市安國(guó)中藥材推廣站。選取顆粒飽滿、大小均一的桔梗種子播種于裝有營(yíng)養(yǎng)土的花盆中，在14 h光照/10 h黑暗、25℃恒溫培養(yǎng)，光照強(qiáng)度4 000 lx；培養(yǎng)60 d后，將長(zhǎng)勢(shì)基本一致的桔梗幼苗移栽于裝有石英砂的塑料花盆中（口徑7 cm，高8 cm），每盆移栽幼苗3棵。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

移栽后，每天向盆中一次性澆灌10 mL Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，培養(yǎng)7 d后進(jìn)行PEG干旱和SA處理。PEG質(zhì)量濃度設(shè)置為0（P0）、5%（P5）、10%（P10）、15%（P15）和20%（P20），每日向盆中一次性澆灌10 mL PEG溶液。同一PEG處理下，每天上午10：00分別用噴壺向桔梗葉片噴灑0（S0）、10（S10）、20（S20）和30（S30）mg·L?1SA 溶液。每個(gè)處理3盆植株，重復(fù)3次。處理5 d后分別收取桔梗全部葉片和根，液氮冷凍后置于?80℃冰箱。葉片用于生理指標(biāo)的測(cè)定和RNA的提取；根用于生理指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 生理指標(biāo)檢測(cè) 丙二醛（malondial-dehyde，MDA）、可溶性糖（soluble sugar，SS）、脯 氨 酸（proline，Pro）、超 氧 化 物 歧 化 酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性的檢測(cè)均按照試劑盒說明書進(jìn)行（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）。葉綠素（chlorophyll，Chl）和可溶性蛋白（soluble protein，SP）含量檢測(cè)參照張以順等［14］的方法進(jìn)行。

1.3.2 RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將采集的桔梗葉片在液氮中研磨，按照試劑盒說明書（北京天根生化科技有限公司）提取桔?？俁NA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性，核酸濃度檢測(cè)儀測(cè)定RNA的純度及濃度，依據(jù)試劑盒說明書（日本TaKaRa有限公司）進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄。然后，以各處理cDNA為模板，actin基因作為內(nèi)參，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)POD、P5CR、CAO和CHLG基因的表達(dá)量?；蛳鄬?duì)表達(dá)量的計(jì)算采用 2?△△Ct法［15-16］?；蛐蛄杏杀菊n題組前期桔梗轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果獲得，引物采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列詳見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan法進(jìn)行差異顯著性分析，采用Excel 2013軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 水楊酸對(duì)干旱脅迫下桔梗葉片葉綠素含量的影響

如圖1所示，隨干旱脅迫程度的加劇，葉綠素含量逐漸降低。未添加SA時(shí)，P20處理的葉綠素含量為對(duì)照（P0處理）的39.87%。在10%和15%PEG處理下，S10和S20處理的葉綠素含量均顯著高于S0處理，其中S20處理的葉綠素含量最高。在10%和15%PEG處理下，S20處理的葉綠素含量分別是S0處理的1.22和1.32倍；當(dāng)SA達(dá)到30 mg·L?1時(shí)，葉綠素含量反而有所降低。由此表明，干旱脅迫下，外源施加20 mg·L?1SA時(shí)可有效抑制葉綠素的降解。

圖1 不同處理下桔梗葉片的葉綠素含量Fig.1 Chlorophyll contents in Platycodon grandiflorus leaves of different treatments

2.2 水楊酸對(duì)干旱脅迫下桔梗葉片和根中MDA含量的影響

對(duì)不同處理葉片中MDA含量進(jìn)行分析，結(jié)果（圖2）表明，未添加SA時(shí)，葉片中MDA含量隨干旱脅迫程度的加劇逐漸增加，P5、P10、P15和P20處理的MDA含量分別為對(duì)照（P0處理）的1.45、1.76、1.87和1.99倍，表明干旱脅迫下葉片中膜脂過氧化物不斷積累，細(xì)胞氧化損傷增加。在5%、10%和15%PEG濃度下，S20處理的MDA含量較S0處理分別顯著降低了18.73%、25.76%和16.70%，表明外源添加水楊酸有效緩解了干旱脅迫下桔梗葉片的膜脂過氧化程度。在20%PEG濃度下，添加SA處理與S0處理間MDA含量無顯著差異。

圖2 不同處理下桔梗葉片和根中MDA含量Fig.2 MDA contents in Platycodon grandiflorus leaves and roots of different treatments

對(duì)不同處理下根中MDA含量進(jìn)行分析，結(jié)果（圖2）表明，未添加SA時(shí)，P20處理根中MDA含量為P0處理的1.24倍；添加SA后，S20處理的MDA含量在不同質(zhì)量濃度PEG（0、5%、10%、15%和20%）脅迫下均顯著低于S0處理，分別降低了12.88%（P0）、14.78%（P5）、20.17%（P10）、34.57%（P15）和23.95%（P20）。表明水楊酸質(zhì)量濃度為20 mg·L?1時(shí)，可有效緩解干旱脅迫下桔梗根細(xì)胞的膜脂過氧化程度。

2.3 水楊酸對(duì)干旱脅迫下桔梗葉片和根中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

如圖3所示，葉片可溶性糖含量隨干旱脅迫程度增加呈上升趨勢(shì)。在10%和15%PEG脅迫下，S10和S20處理均能顯著提高葉片中可溶性糖含量，表明外源添加水楊酸可通過提高葉片可溶性糖的含量從而緩解干旱脅迫對(duì)植株造成的損傷；而添加SA對(duì)不同干旱脅迫下根中可溶性糖含量均無顯著影響。在10%和15%PEG脅迫下，S10和S20處理均能顯著提高葉片和根中可溶性蛋白含量；在15%PEG處理下，S30處理顯著提高了葉片可溶性蛋白含量，而根中可溶性蛋白含量顯著降低。在10%和15%PEG脅迫下，S20處理能顯著提高葉片和根中脯氨酸含量；在15%和20%PEG脅迫下，S30處理葉片和根中脯氨酸含量顯著降低。上述結(jié)果表明，在干旱脅迫下高質(zhì)量濃度SA會(huì)抑制脯氨酸的累積。

圖3 不同處理下桔梗葉片和根的可溶性糖和蛋白及脯氨酸含量Fig.3 Contents of SS，SP and Pro in Platycodon grandiflorus leaves and roots of different treatments

2.4 水楊酸對(duì)干旱脅迫下桔梗葉片和根中抗氧化酶活性的影響

如圖4所示，SOD活性隨PEG質(zhì)量濃度的增加逐漸升高，POD和CAT活性隨PEG質(zhì)量濃度增加呈先升高后降低趨勢(shì)。不同PEG脅迫（5%、10%、15%和20%）下，S20處理葉片和根中SOD活性顯著提高，S10和S20處理均能顯著提高葉片和根中POD和CAT活性，而S30處理的POD和CAT活性顯著降低。綜上所述，適量施用SA能提高桔梗葉片和根中抗氧化酶活性，緩解干旱脅迫造成的損傷，而高質(zhì)量濃度SA可能引起POD活性降低，以SA 質(zhì)量濃度為20 mg·L?1時(shí)效果最佳。

圖4 不同處理下桔梗葉片和根中抗氧化酶活性的影響Fig.4 Activities of antioxidant enzymes in Platycodon grandiflorus leaves and roots of different treatments

2.5 水楊酸對(duì)干旱脅迫下桔梗葉片相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖5所示，S0處理葉片中CAO和CHLG基因的表達(dá)量隨干旱程度的加劇呈下降趨勢(shì)，與葉綠素含量變化規(guī)律一致。在10%、15%和20%PEG脅迫下，外源添加SA處理葉片中CAO和CHLG基因的表達(dá)量均顯著提高；PEG質(zhì)量濃度為0和5%時(shí)，S20和S30處理葉片中CHLG基因表達(dá)量顯著提高，而CAO基因表達(dá)量無顯著變化。由此表明，不同干旱脅迫程度下，SA能誘導(dǎo)不同葉綠素合成相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制葉綠素的降解。

圖5 不同處理下COA、CHLG、POD和P5CR基因在葉片中的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Related expression of COA，CHLG，POD and P5CR genes in Platycodon grandiflorus leaves

S0處理葉片中POD基因的表達(dá)量隨干旱脅迫程度的加劇呈先增加后降低的趨勢(shì)，與POD活性變化規(guī)律一致；而P5CR基因的表達(dá)量隨干旱脅迫程度的加劇呈上升趨勢(shì)（圖5）。在不同質(zhì)量濃度PEG脅迫下，S10和S20處理葉片中POD基因的表達(dá)量均顯著提高；在10%和15%PEG脅迫下，S30處理抑制了POD基因的表達(dá)，與POD活性測(cè)定結(jié)果一致。在10%和15%PEG脅迫下，S10和S20處理葉片中P5CR基因的表達(dá)量均顯著提高，與脯氨酸含量測(cè)定結(jié)果一致。

3 討論

干旱是自然界常見的逆境脅迫因素，對(duì)植物生長(zhǎng)具有嚴(yán)重影響。水楊酸是植物莽草酸代謝途徑中的一種酚類衍生物，對(duì)植物的種子萌發(fā)、生長(zhǎng)、開花等一系列生理生化過程［11］有影響。在非生物脅迫下，水楊酸能夠減輕植物光合色素含量的下降程度，從而使葉片保持較高的光合速率來保證植物正常生長(zhǎng)［17］。本研究結(jié)果表明，隨干旱脅迫程度的加劇葉綠素含量逐漸降低，在10%和15%PEG脅迫下，外源添加10和 20 mg·L?1SA可顯著提高葉片葉綠素含量，由此表明，適宜質(zhì)量濃度的水楊酸處理有利于植物保持較高的葉綠素含量。對(duì)葉綠素合成途徑中兩個(gè)關(guān)鍵酶基因CAO和CHLG的表達(dá)量進(jìn)行分析表明，外源添加SA顯著提高了葉片中CAO和CHLG基因的表達(dá)量，從分子水平驗(yàn)證了干旱脅迫下外源添加SA可減輕葉綠素含量的下降程度。葉綠素的生物合成是多種酶參與的過程，本文僅對(duì)其中兩種酶基因的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)，對(duì)于在干旱脅迫下，添加外源水楊酸對(duì)其他葉綠素合成途徑中酶基因表達(dá)量的影響仍有待于進(jìn)一步研究。

抗氧化酶類可有效清除自由基，保護(hù)膜系統(tǒng)，緩解植物受到的脅迫傷害。SA作為信號(hào)分子，可以激活多種與脅迫應(yīng)答有關(guān)的基因表達(dá)，并通過調(diào)節(jié)活性氧、抗氧化酶及非酶促抗氧化體系而提高植物的抗逆性［11］，本研究表明，在干旱脅迫下對(duì)桔梗進(jìn)行一定質(zhì)量濃度的水楊酸處理，可以提高桔梗幼苗葉片和根中抗氧化酶活性，減輕干旱脅迫對(duì)桔梗幼苗的危害?？扇苄蕴呛偷鞍准案彼岬葷B透調(diào)節(jié)物質(zhì)的累積對(duì)植物抵抗干旱脅迫具有重要意義，本研究表明，在干旱脅迫下，外源添加適宜質(zhì)量濃度的SA能夠增加桔梗葉片和根中可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖和脯氨酸含量。由此表明，適宜質(zhì)量濃度的SA可以有效促進(jìn)桔梗葉片和根中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的累積，從而提高植物的抗逆性，緩解逆境對(duì)植物造成的損傷。研究表明，脯氨酸不僅具有滲透調(diào)節(jié)作用，還對(duì)滲透保護(hù)動(dòng)能具有重要意義，其代謝和積累有利于維持干旱脅迫下細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和膜的穩(wěn)定性，同時(shí)具有清除超氧陰離子等自由基的作用［18-19］。OAT和P5CS分別是合成脯氨酸鳥氨酸途徑和谷氨酸途徑中的限速和調(diào)節(jié)酶［20］，而P5CR催化脯氨酸生物合成的最終反應(yīng)。本研究對(duì)PEG脅迫下桔梗幼苗葉片中P5CR基因的表達(dá)量進(jìn)行分析表明，在10%和15%PEG脅迫下，外源添加10或20 mg·L?1SA均能顯著提高葉片中P5CR基因的表達(dá)量，與脯氨酸含量測(cè)定結(jié)果相一致。綜上所述，外源添加適量SA可提高抗氧化酶活性，促進(jìn)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的累積，從而提高桔梗幼苗的抗干旱能力。