何顯運，徐勇軍，原波

(廣東工貿(mào)職業(yè)技術(shù)學院，廣州 510510)

可降解聚氨酯(PUR)材料一般由軟段和硬段構(gòu)成，可以通過改變軟硬段的構(gòu)成和比例，對PUR分子進行設(shè)計，從而實現(xiàn)對材料性能、降解方式和降解速率的調(diào)控[1–2]。PUR材料己經(jīng)被應(yīng)用到血管、神經(jīng)、軟骨等組織修復中[3–5]。但和其他合成高分子材料一樣，PUR材料由于親水性，細胞黏附性較差，缺乏細胞識別信號位點，即生物相容性不是很好，所以其在生物醫(yī)用方面的應(yīng)用受到較大的限制。為了改善其生物相容性，通常的方法是對材料的表面進行仿生修飾，在材料表面接枝或者沉積細胞外基質(zhì)成分，在保留PUR優(yōu)異力學性能的同時，又能提高其生物相容性[6–13]。Hsieh等[14]開發(fā)了一種可生物降解的水性PUR/透明質(zhì)酸3D打印墨水，且3D打印制備了復合軟骨組織工程支架，與大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)共培養(yǎng)，結(jié)果表明該成分能誘導MSCs成軟骨分化，將該支架植入兔膝蓋軟骨缺損模型可誘導兔軟骨再生。Lukas等[15]采用聚碳酸酯二醇制備了PUR，并用等離子體技術(shù)進行表面處理，接枝上肝素，纖連蛋白、多肽等生物大分子，能明顯改善內(nèi)皮細胞的黏附與增殖，同時能夠抑制血栓的形成。Kawamoto等[16]利用等離子體技術(shù)處理PUR材料管的內(nèi)表面，將牛內(nèi)皮細胞種植在PUR管的內(nèi)表面，改善了材料的血液相容性，且促進了內(nèi)皮細胞的黏附和增殖。Fang等[17]制備了可生物降解PUR彈性體，通過用馬來酰亞胺修飾的多肽成功接枝在靜電紡絲的PUR材料上，改善了內(nèi)皮細胞的黏附。Duy等[18]在靜電PUR納米纖維上通過自組裝氧化石墨烯(R-GO)，制備了可拉伸化學響應(yīng)性的納米復合物PUR/R-GO，該復合物對NO2具有出色的靈敏度，為可穿戴化學傳感的應(yīng)用提供了良好的基礎(chǔ)。筆者以自制的功能性PUR為基體，該PUR是以賴氨酸二異氰酸乙酯為硬段，聚己內(nèi)酯為軟段，具有藥理活性的異山梨醇為擴鏈劑，利用二步逐步合成的一種脂肪族可生物降解的聚合物，且降解產(chǎn)物呈弱堿性，沒有毒性或者毒性很小，支持細胞的生長和增殖[19]。通過胺解作用，在PUR材料表面接枝上氨基(—NH2)，再利用帶負電的透明質(zhì)酸(HA)和帶正電的膠原(Col)，通過靜電作用，層層自組裝(LBL)沉積到材料表面，既盡量保留了HA和Col的生物活性，又達到了對PUR材料表面的生物活性修飾，期望制得的表面修飾化PUR材料能夠應(yīng)用于組織工程支架。用自組裝方法在PUR材料表面沉積上透明質(zhì)酸和膠原的研究，國內(nèi)尚未見報道。

1 實驗部分

1.1 主要原料及試劑

PUR：自制；

1，3-二氨基丙烷：生物試劑級，阿拉丁試劑(上海)有限公司；

Ⅰ型Col：生物試劑級，美國BD bioscience公司；

HA：生物試劑級，美國Sigma公司；

茚三酮：分析純，廣州齊云生物試劑有限公司。

1.2 主要設(shè)備及儀器

真空干燥箱：DZF-6050型，上海一恒科學儀器有限公司；

表面接觸角分析儀：OCA20型，德國DATAPHYSICS公司；

石英微晶天平(QCM)：Q-SenseE4型，瑞典Q-Sense公司；

原子力顯微鏡(AFM)：MFP-3D-S型，美國Asylum Research公司。

1.3 實驗過程

(1) PUR膜的制備。

將自制的PUR用少量的四氫呋喃溶劑進行溶解，倒入到聚四氟乙烯模具中，形成薄薄的一層溶液，然后轉(zhuǎn)到40℃的鼓風干燥箱中，靜置24 h，讓溶劑慢慢揮發(fā)，最后轉(zhuǎn)入溫度為30℃真空干燥箱中至恒重，制得PUR薄膜。

(2)氨基化PUR膜(PUR-NH2)的制備。

將上述制備的PUR膜在乙醇/水溶液(體積比1∶1)中浸泡一段時間，再用去離子水漂洗，完后用一定濃度的1，3-二氨基丙烷溶液進行處理，然后再用去離子水充分漂洗以去除未反應(yīng)的1，3-二氨基丙烷，最后轉(zhuǎn)到溫度為30℃的真空干燥箱至恒重，制得PUR-NH2膜。圖1是PUR膜與1，3-二氨基丙烷反應(yīng)的示意圖。

圖1 PUR膜與1，3-二氨基丙烷反應(yīng)示意圖

(3) PUR-NH2膜層層自組裝HA和Col。

將上述制得的PUR-NH2膜用0.012 mol/L的鹽酸溶液進行酸化處理，接著用大量去離子水沖洗以去除表面吸附的鹽酸，然后將其浸泡到HA溶液中，使其表面吸附一層HA，再浸泡到Col溶液中，使其吸附一層Col，如此反復，使其層層沉積上HA和Col，最后轉(zhuǎn)到溫度為30℃的真空干燥箱至恒重，制得PUR-NH2/HA/Col膜。圖2是PUR-NH2自組裝HA/Col的過程示意圖。

圖2 PUR-NH2自組裝HA/Col過程示意圖

1.4 性能測試

采用表面接觸角分析儀測試PUR膜的親水性情況。

采用茚三酮分析法定量測試PUR膜表面接枝—NH2的密度。

采用QCM檢測在PUR膜表面上自組裝HA/Col的情況。

采用AFM觀察PUR自組裝HA/Col后的表面形貌。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料表面水接觸角

為表征材料表面的親水性能，通過接觸角測量儀測試材料的親、疏水接觸角。表1是PUR，PURNH2和PUR-NH2/HA/Col三種膜測試得到的水接觸角。PUR膜接觸角為(86.5±1.1)°，接觸角較大，表示親水性能不夠好；PUR膜通過氨基化后得到的PUR-NH2的 接 觸 角 下 降 到(78.8±0.8)°，說 明PUR-NH2的親水性能變好；而通過在PUR-NH2表面自組裝得到的PUR-NH2/HA/Col的接觸角降到(65.5±1.1)°，材料的表面親水性能得到明顯改善。其原因是在PUR-NH2表面沉積上HA和Col，使得該膜表面富集了大量的極性基團，從而使材料的親水性能變好。而材料的親水性能變好，有利于細胞的黏附，改善細胞跟材料的親和力，提高材料的生物相容性。

表1 PUR、PUR-NH2和PUR/HA/Col膜的水接觸角 (°)

2.2 茚三酮分析法測試PUR-NH2膜表面的—NH2密度

采用茚三酮分析法對PUR-NH2膜表面—NH2密度進行定量分析。圖3是用1，3-二氨基丙烷水溶液(9%)浸泡PUR膜，PUR膜表面—NH2密度與浸泡時間的關(guān)系曲線。PUR-NH2膜表面—NH2密度開始隨浸泡時間增加而增大，當接近2 h時，PUR膜表面—NH2密度達到最大值，而隨著浸泡時間繼續(xù)延長，PUR膜表面—NH2的密度有所下降。其原因是PUR膜浸泡在1，3-二氨基丙烷中，發(fā)生胺解反應(yīng)，隨著時間的增加，接枝在PUR膜表面的—NH2量增，相應(yīng)的—NH2密度也增大，但隨著處理的時間繼續(xù)增加，胺解反應(yīng)會使材料的表層脫離，從而使接枝上的—NH2從材料表面脫落，相應(yīng)的—NH2密度也就下降。

圖3 PUR膜表面—NH2密度與浸泡時間的關(guān)系曲線

圖4是PUR-NH2膜表面的—NH2密度隨浸泡的1，3-二氨基丙烷水溶液濃度不同而變化的曲線。由圖4可以看到，浸泡時間同為1 h，1，3-二氨基丙烷濃度為12%時，PUR膜的—NH2密度最大，為11.4×10-7mol/cm2。假設(shè)—NH2只接枝在PUR膜表面，由此計算得到含一個—NH2的分子鏈所占的面積約為0.00014 nm2。這個計算結(jié)果顯然是不合理的，說明PUR膜的胺解反應(yīng)不是單純發(fā)生在PUR膜的表面一層，而深入到膜的里層。

圖4 PUR膜表面—NH2密度與浸泡水溶液濃度的關(guān)系曲線

2.3 QCM檢測PUR—NH2膜表面上LBL自組裝HA/Col

為了監(jiān)測PUR—NH2膜表面層層自組裝HA/Col的過程，采用QCM進行檢測。圖5是PURNH2膜表面自組裝HA/Col時金片振動頻率(F)和耗散因子(D)隨時間的變化曲線圖。

圖5 金片F(xiàn)和D的變化曲線圖

從圖5可以看到，隨著HA溶液和Col溶液的通入，F(xiàn)不斷降低，而D則不斷增大。其原因就是由于HA和Col通過靜電作用吸附在金片上，從而使金片的質(zhì)量增大，相應(yīng)的振蕩頻率也就減小，而耗散因子則相應(yīng)地增大。由此說明HA和Col沉積在PUR-NH2膜上。

2.4 AFM觀察PUR膜和PUR自組裝HA/Col膜的表面形貌

圖6是采用AFM掃描得到的PUR膜和PURNH2膜自組裝HA/Col的表面形貌圖。從圖6可以看到，單純的PUR膜表面相對比較光滑；而沉積了HA和Col的PUR-NH2膜，表面覆蓋了一層物質(zhì)，表面看起來比較粗燥，有比較多的小突起，大小在納米級，而這樣的一個表面納米結(jié)構(gòu)應(yīng)該有利于細胞的粘附，從而改善材料的生物相容性。文獻[20]報道了用濃NaOH溶液處理PLGA工程支架，使支架表面形成粗糙的納米結(jié)構(gòu)，用這樣的支架培養(yǎng)細胞，能夠明顯促進細胞的增殖和分化。因此，通過在PUR材料表面自組裝上HA和Col，從表面形貌上可以得到這樣的一個納米表面結(jié)構(gòu)，從而達到改善材料的生物相容性。

圖6 PUR膜和PUR-NH2膜自組裝HA/Col表面形貌圖

3 結(jié)論

以功能PUR為基體，在1，3-二氨基丙烷的作用下，在PUR材料的表面引入—NH2，然后在材料的表面通過靜電作用機制層層自組裝上HA和Col。茚三酮分析法測試結(jié)果表面PUR膜成功接枝上了—NH2。QCM和AFM測試結(jié)果表明HA和Col組裝在PUR—NH2膜的表面。沉積在PUR—NH2膜上的HA和Col，使材料的親水性能得到改善，同時在材料表面形成一個粗糙的納米形貌結(jié)構(gòu)。通過這樣的表面仿生修飾，將有利于細胞的粘附及促進細胞的增殖和分化，為該PUR材料應(yīng)用于組織支架奠定基礎(chǔ)。