金偉嘉，盧利平，2*，劉曉瑩，李佳怡，楊揚(yáng)

(1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.生物醫(yī)學(xué)研究中心中國(guó)馬來(lái)西亞國(guó)家聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030)

花椒(Zanthoxylumbungeanum)屬蕓香科、花椒屬，是我國(guó)特有的具有悠久種植歷史的一種食物香料，尤其在我國(guó)北方是著名的香料及油料樹(shù)種[1]。花椒除了是我國(guó)食品工業(yè)中常用的香辛調(diào)味料[2]以外，還具有一定的藥用價(jià)值[3]?；ń啡~作為花椒的典型副產(chǎn)品，它的特點(diǎn)包括麻香味濃厚和營(yíng)養(yǎng)成分豐富?；ń啡~中富含黃酮類(lèi)化合物、糖苷、多酚、芳香油等多種活性成分[4-5]，其中黃酮類(lèi)化合物具有抑菌[6]、抗癌[7-8]、抗氧化[9]、降血脂[10]、降血壓、保護(hù)心臟、抗衰老、抗炎等藥理活性[11]，已被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、藥品等領(lǐng)域[12-13]，因而可知，對(duì)花椒葉中黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用具有較高的研究?jī)r(jià)值。

花椒栽植被甘肅作為貧困山區(qū)精準(zhǔn)扶貧富民產(chǎn)業(yè)的主要行業(yè)來(lái)培育，栽植面積逐漸擴(kuò)大[14]，品質(zhì)優(yōu)異，花椒產(chǎn)品遠(yuǎn)銷(xiāo)國(guó)內(nèi)外，受到一致好評(píng)。但對(duì)于花椒資源主要是果實(shí)的采收與加工，忽略了對(duì)花椒葉中各組成成份的開(kāi)發(fā)與綜合利用，極大地浪費(fèi)了花椒葉這一低值副產(chǎn)品。花椒葉中富含黃酮類(lèi)化合物，可作為良好的黃酮提取原材料，其中大紅袍因其色澤鮮艷，麻味更濃，是最具代表性的花椒優(yōu)良品種。因此，對(duì)花椒葉中黃酮類(lèi)化合物的提取進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)生物活性進(jìn)行研究可以提高花椒葉的附加值，延長(zhǎng)花椒產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)鏈，同時(shí)增加了山區(qū)椒農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收入，也對(duì)扶貧工作起到一定的輔助作用。本試驗(yàn)采用超聲波輔助法探討天水花椒葉中黃酮類(lèi)化合物的提取工藝，并通過(guò)Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面進(jìn)行優(yōu)化，以此確定最佳工藝參數(shù)，為花椒葉的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

花椒葉(大紅袍花椒葉，2020年5月采摘自甘肅甘谷縣大象山鎮(zhèn))；無(wú)水乙醇、丙酮、亞硝酸鈉、九水合硝酸鋁、氫氧化鈉(粒)、水楊酸、硫酸亞鐵、抗壞血酸、30%過(guò)氧化氫均為分析純(蘭州市奧科生物技術(shù)有限公司)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(Solarbio公司)；1，1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)(上海麥克林生化科技有限公司)。

AR224CN電子分析天平(奧豪斯儀器(常州)有限公司)；TD5Z離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)；SB-500DTY超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；WJX-200型高速多功能粉碎機(jī)(上海緣沃工貿(mào)有限公司)；HH-S4A電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；DHG-9420A電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；L3S可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 花椒葉黃酮提取工藝流程

大紅袍花椒葉干燥→粉碎過(guò)篩→脫色處理→超聲提取→離心→黃酮提取液。

1.2.2 原料處理

洗凈新鮮摘取的花椒葉，除去葉柄，自然晾干，在60 ℃烘箱中烘至恒重，即得干燥的花椒葉。粉碎花椒葉并過(guò)80目篩(孔徑0.177 mm)，丙酮浸泡過(guò)夜后，進(jìn)行抽濾，將抽濾過(guò)后的花椒葉粉放置30 ℃烘箱中烘干至恒重，完成脫色處理，將處理好的花椒葉粉放入封口袋，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 提取

向比色管中加入準(zhǔn)確稱(chēng)量好的1 g花椒葉粉，在超聲頻率40 kHz下，在一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液、液料比、浸提時(shí)間、浸提溫度下進(jìn)行超聲波輔助處理。過(guò)濾收集，在提取2次后合并上清液，于12 000 r·min-1離心15 min，最終提取液為定容至50 mL的上清液。

1.2.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱(chēng)量適量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用30%乙醇溶液配制得到0.2 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。通過(guò)吸取不同體積(0、0.5、1.0、1.5、2.0 mL)的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備液置于10 mL具塞試管中來(lái)設(shè)置不同濃度梯度，加入80%乙醇溶液補(bǔ)到5 mL，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻靜置6 min，加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL，反應(yīng)6 min，再加入4% NaOH溶液4 mL，混合均勻后用蒸餾水定容至刻度線，15 min后于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值[15]。

1.2.5 黃酮含量的測(cè)定

準(zhǔn)確移取0.5 mL花椒葉提取液放到10 mL具塞試管中，以80%乙醇溶液定容到5 mL，混合均勻后同1.2.4節(jié)操作方法進(jìn)行反應(yīng)，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)量其吸光值，花椒葉中黃酮濃度依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算，并計(jì)算黃酮的得率[16]。

1.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的影響

控制液料比為30∶1 mL·g-1，浸提溫度為50 ℃、浸提時(shí)間為50 min，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為45%、50%、55%、60%、65%、70%時(shí)對(duì)花椒葉黃酮得率的影響。

1.3.2 浸提時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響

控制液料比為30∶1 mL·g-1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，浸提溫度為50 ℃，研究浸提時(shí)間分別為25、30、35、40、45、50 min時(shí)對(duì)花椒葉黃酮得率的影響。

1.3.3 浸提溫度對(duì)黃酮得率的影響

控制液料比為30∶1 mL·g-1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，浸提時(shí)間為40 min，研究浸提溫度分別為40、45、50、55、60、65 ℃時(shí)對(duì)花椒葉黃酮得率的影響。

1.3.4 液料比對(duì)黃酮得率的影響

控制乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，浸提溫度為55 ℃，浸提時(shí)間為40 min，研究液料比分別為20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1 mL·g-1時(shí)對(duì)花椒葉黃酮得率的影響。

1.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按照Box-Behnken設(shè)計(jì)原理工藝優(yōu)化選取乙醇濃度(A)、浸提時(shí)間(B)、浸提溫度(C)、液料比(D)4個(gè)因素作為自變量，以花椒葉黃酮得率為響應(yīng)值，依據(jù)試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化黃酮的提取工藝。

-1、0、1水平：A分別為55%、60%和65%；B分別為35、40和45 min；C分別為50、55和60 ℃；D分別為30∶1、35∶1和40∶1 mL·g-1。

1.5 大紅袍花椒葉黃酮抗氧化能力的測(cè)定

許多研究發(fā)現(xiàn)自由基與人體的健康息息相關(guān)，自由基含量超過(guò)一定標(biāo)準(zhǔn)，會(huì)干擾人體正常的新陳代謝活動(dòng)，甚至?xí)T發(fā)心血管疾病、癌癥等[17-18]，因此，測(cè)定其抗氧化能力是具有一定意義的。

1.5.1 DPPH清除能力的測(cè)定

參照宋巖等[19]的方法測(cè)定。采用最優(yōu)工藝參數(shù)提取大紅袍花椒葉樣品中的黃酮，稀釋提取液得到質(zhì)量濃度為30、60、90、120、150 μg·mL-1的黃酮提取液，各取1.0 mL于10 mL具塞試管中，再分別加入精確吸取2 mL的0.2 mol·L-1DPPH溶液，充分混勻后，室溫靜置避光30 min，測(cè)定于517 nm處的吸光值；用無(wú)水乙醇替代樣品溶液測(cè)得吸光值，用無(wú)水乙醇替代DPPH溶液測(cè)得吸光值，配制同濃度VC溶液作為陽(yáng)性對(duì)比，計(jì)算自由基清除率。

1.5.2 OH自由基清除能力的測(cè)定

測(cè)定方法采用水楊酸比色法[20]進(jìn)行測(cè)定，配制相同濃度的VC溶液作為陽(yáng)性對(duì)比，計(jì)算羥基自由基的清除率。

1.6 數(shù)據(jù)處理

最終結(jié)果取3次平行試驗(yàn)的平均值，利用Office Excel數(shù)據(jù)分析軟件、Origin 8.0制圖軟件和Design-Expert 8.06響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，517 nm處吸光值為縱坐標(biāo)進(jìn)行繪制。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=8.687 1x+0.002 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3，且在0.01～0.05 mg·mL-1呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度與吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素影響

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的影響

由圖2可得，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，黃酮得率先逐漸上升，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，黃酮得率達(dá)到最高；繼續(xù)提高乙醇體積分?jǐn)?shù)，黃酮得率下降趨勢(shì)明顯。依據(jù)相似相溶規(guī)律可知，黃酮溶于乙醇的量與兩者極性密切相關(guān)，花椒葉中黃酮的極性與60%的乙醇溶液相近，故得率為最大值。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大，觀察到提取液的顏色開(kāi)始向綠色轉(zhuǎn)變，這可能是由于醇溶性雜質(zhì)、色素等其他成分溶出量的增加，這些會(huì)同黃酮類(lèi)化合物形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，導(dǎo)致黃酮得率下降[21]。根據(jù)花椒葉黃酮得率變化規(guī)律，選取55%～65%的乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的影響

2.2.2 浸提時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響

由圖3可得，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，大紅袍花椒葉黃酮得率呈現(xiàn)先增加后減少的變化規(guī)律，在浸提時(shí)間為40 min時(shí)，黃酮得率最高為13.85%；浸提時(shí)間超過(guò)40 min后，黃酮得率不增反而有緩慢下降趨勢(shì)。原因可能為隨著時(shí)間的增加，黃酮提取會(huì)越來(lái)越充分，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使得黃酮部分結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致得率降低[22]。根據(jù)花椒葉黃酮得率變化規(guī)律，浸提時(shí)間選取35～45 min進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖3 浸提時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響

2.2.3 浸提溫度對(duì)黃酮得率的影響

由圖4可得，在浸提溫度40～55 ℃黃酮得率，隨著浸提溫度的上升而增大，當(dāng)溫度超過(guò)55 ℃后，黃酮得率開(kāi)始下降。這是因?yàn)樵谝欢ǖ臏囟确秶軌虼龠M(jìn)黃酮分子的運(yùn)動(dòng)速率，從而提高黃酮的溶出，但是超過(guò)一定溫度界限，黃酮中熱穩(wěn)定性較低的結(jié)構(gòu)被破壞，其他雜質(zhì)的析出比例上升，因而黃酮的得率會(huì)有所降低[23]。根據(jù)花椒葉黃酮得率變化規(guī)律，浸提溫度選取50～60 ℃進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖4 浸提溫度對(duì)黃酮得率的影響

2.2.4 液料比對(duì)黃酮得率的影響

由圖5可得，在液料比為20∶1～35∶1 mL·g-1，黃酮得率隨著液料比的升高而升高，當(dāng)液料比超過(guò)35∶1 mL·g-1后，黃酮得率呈下降趨勢(shì)。這是由于當(dāng)浸提液含量占比較小時(shí)，花椒葉中黃酮不能完全溶出；隨著溶劑量增加，雜質(zhì)溶出量增加導(dǎo)致黃酮提出率降低，過(guò)量的乙醇導(dǎo)致黃酮損失[24]。根據(jù)花椒葉黃酮得率變化規(guī)律，液料比選取30∶1～40∶1 mL·g-1進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖5 液料比對(duì)黃酮得率的影響

2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

2.3.1 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)Design-Expert 8.06軟件設(shè)計(jì)，以A、B、C、D為自變量，以花椒葉黃酮得率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果如表1所示，其中25、26、27、28、29是中心試驗(yàn)，其余為析因試驗(yàn)。得到黃酮提取液的擬合回歸方程為：Y=15.25-0.11A+0.030B+0.32C-1.12D+0.038AB+0.084AC-0.17AD+0.24BC-0.18BD+0.16CD-2.01A2-2.19B2-2.33C2-1.60D2。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及黃酮得率

2.3.2 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析

RSM圖形可以直觀評(píng)估乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提溫度、浸提時(shí)間和液料比對(duì)黃酮得率的影響，如圖6～11所示。交互效應(yīng)的強(qiáng)弱趨向可以被響應(yīng)面坡度陡峭程度和等高線橢圓形狀反映，交互效應(yīng)強(qiáng)弱水平可以從投影面的等高線形狀中觀察，曲面傾斜度越大，則該因素對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著[25]。對(duì)比圖6～11，液料比對(duì)黃酮得率的影響最大，其次是浸提溫度和浸提時(shí)間，乙醇體積分?jǐn)?shù)影響較小。各因素等高線橢圓形狀不明顯，表明其交互作用不顯著，符合回歸方程的方差分析結(jié)果[26]。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)與浸提時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)與浸提溫度對(duì)黃酮得率的影響

圖8 乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比對(duì)黃酮得率的影響

圖9 浸提溫度與浸提時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響

圖10 浸提時(shí)間與液料比對(duì)黃酮得率的影響

圖11 浸提溫度與液料比對(duì)黃酮得率的影響

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)Design-Expert 8.06軟件設(shè)計(jì)分析結(jié)果，得到黃酮得率取得最大值時(shí)的工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)59.94%，浸提時(shí)間40.12 min，浸提溫度55.29 ℃，液料比33.26 mL·g-1，在此條件下，黃酮得率為15.45%。考慮實(shí)際情況，適當(dāng)調(diào)整工藝條件，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，浸提時(shí)間40 min，浸提溫度55 ℃，液料比33∶1 mL·g-1。為進(jìn)一步驗(yàn)證該工藝的準(zhǔn)確性，在此條件下進(jìn)行3組驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得的實(shí)際黃酮得率平均值為15.40%(表2)，接近理論預(yù)測(cè)值(相對(duì)誤差為0.32%)，說(shuō)明響應(yīng)面法優(yōu)化花椒葉黃酮的提取工藝條件具有可行性。

表2 驗(yàn)證試驗(yàn)的黃酮得率

2.4 大紅袍花椒葉黃酮提取液的抗氧化能力

2.4.1 DPPH自由基清除率

由圖12可得，質(zhì)量濃度在30～150 μg·mL-1內(nèi)隨樣品濃度的增加，清除率逐漸增加，在濃度范圍內(nèi)，黃酮提取液對(duì)DPPH的清除效果略高于VC溶液，當(dāng)濃度在150 μg·mL-1時(shí)，VC的清除能力開(kāi)始超過(guò)黃酮提取液。綜合來(lái)看，表明大紅袍花椒葉黃酮具有較好的DPPH清除能力。

圖12 大紅袍花椒葉黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力

2.4.2 OH自由基清除率

由圖13可得，黃酮提取液與VC溶液對(duì)OH自由基的清除能力隨著樣品濃度的升高逐漸增強(qiáng)，在濃度范圍內(nèi)，黃酮提取液對(duì)OH自由基的清除能力相較于VC溶液更優(yōu)，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為150 μg·mL-1時(shí)，對(duì)OH自由基的清除率達(dá)到72.50%，表明花椒葉黃酮的抗氧化性良好。

圖13 大紅袍花椒葉黃酮對(duì)OH自由基的清除能力

3 小結(jié)

采用響應(yīng)面法優(yōu)化了超聲輔助提取大紅袍花椒葉黃酮的工藝，建立了乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提溫度、浸提時(shí)間和液料比對(duì)大紅袍花椒葉黃酮浸提量影響的回歸模型。結(jié)果表明，各因素對(duì)黃酮得率的影響次序?yàn)橐毫媳?浸提溫度>浸提時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)，由此得到最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，浸提時(shí)間40 min，浸提溫度55 ℃，液料比33∶1 mL·g-1，在該條件下，大紅袍花椒葉中黃酮得率達(dá)到(15.40±0.05)%。從抗氧化活性試驗(yàn)得出大紅袍花椒葉黃酮對(duì)DPPH和OH自由基的清除效果良好，可作為提取天然抗氧化劑的原料，提高花椒葉的附加價(jià)值，為花椒副產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)利用提供理論參考。