何曉梅， 陳存武， 宋 程， 喬德亮， 陳 杰， 陳乃富*

(1.皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院,安徽 六安 237012；2.植物細(xì)胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 六安 237012；3.安徽省中藥資源保護(hù)與持續(xù)利用工程實(shí)驗(yàn)室，安徽 六安 237012)

全世界白及屬植物現(xiàn)有9個(gè)種群，我國(guó)有4種，即白及Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.、華白及Bletillasinensis(Rolfe)Schltr.、黃花白及BletillaochraceaSchltr.和小白及Bletillaformosana(Hayata)Schltr.[1]。白及是我國(guó)民間的傳統(tǒng)中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為1995、2005年版《中國(guó)藥典》所收載，主要用于治療瘡瘍腫毒、外傷出血、肺傷咳血、吐血和手足皺裂等[2]。白及中含有多糖、酚類、黃酮類、氨基酸及少量的揮發(fā)油等[3]化學(xué)成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，白及具有止血、保護(hù)胃黏膜、抗胃潰瘍、促進(jìn)傷口愈合、抗病原微生物、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等[4-6]作用?？偡宇愇镔|(zhì)主要具有強(qiáng)抗氧化作用，還有抗病毒、抗腫瘤、防輻射、預(yù)防心血管疾病、預(yù)防老年性病變等作用[7-8]。白及的藥理作用和白及中的酚類化合物有關(guān)，包括聯(lián)芐類化合物、二氫菲類化合物、聯(lián)菲類化合物以及其它菲類衍生物，如丁香樹(shù)脂酚、谷甾醇、沒(méi)食子酸等[9]。目前人們對(duì)于白及的研究主要集中于白及的種植、加工以及白及生物活性物質(zhì)多糖的研究，對(duì)于白及總酚研究較少且缺乏系統(tǒng)性。由于人為的過(guò)度采挖，野生白及資源瀕臨滅絕，但近幾年人工栽培白及產(chǎn)量猛增，這就要求科研工作者加快對(duì)白及資源的研究。本研究以大別山栽培紫花三叉白及為實(shí)驗(yàn)材料，優(yōu)化總酚提取工藝，測(cè)定不同部位的總酚含量，并研究其抗氧化活性，為白及的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 白及于2018年采挖于大別山地區(qū)霍山縣與兒街鎮(zhèn)真龍地村，經(jīng)皖西學(xué)院中藥學(xué)教研室陳乃富教授鑒定為紫花三叉白及。進(jìn)一步與中國(guó)食品藥品檢定研究院白及對(duì)照品(編號(hào)121262)進(jìn)行對(duì)比，最終確定為2020年版《中國(guó)藥典》收錄的白及Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f。

1.2 試劑 沒(méi)食子酸、無(wú)水碳酸鈉、福林酚、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、維生素C、三氯化鐵、硫酸亞鐵、水楊酸、過(guò)氧化氫、抗壞血酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)等均為分析純。

1.3 儀器 HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)宇儀器制造有限公司)；UV-4802/4802S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(龍尼柯儀器有限公司)；DGT-G電熱鼓風(fēng)干燥箱(合肥華德利科學(xué)器材有限公司)；FA2204N電子分析天平(上海箐海儀器有限公司)；DXF-20C密封型粉碎機(jī)(1 000×g，西安寶正實(shí)業(yè)有限公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；GL21M高速冷凍離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法

2.1 藥材處理 新鮮植株采后洗凈，塊莖于沸水煮至無(wú)白心后切成片，須根、莖、葉切成段，50 ℃干燥，粉碎，過(guò)60目篩，常溫保藏。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)確定 參照文獻(xiàn)[10-11]，分別制備塊莖總酚供試品溶液、沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液(0.05 mg/mL)，加入Folin-酚試劑2.0 mL，黑暗中放置10 min后加入5.0 mL 0.5 mol/L Na2CO3溶液，加水至10.0 mL，50 ℃水浴20 min，以雙蒸水為對(duì)照確定最大吸收波長(zhǎng)。

2.3 單因素試驗(yàn) 以塊莖總酚含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度、提取時(shí)間和提取次數(shù)為影響因素。

2.4 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)。

2.5 總酚含量測(cè)定 取須根、塊莖、莖、葉各3份，每份1.000 g，在80 ℃下用40 mL 60%乙醇回流提取2 h，過(guò)濾，收集濾液，濾渣重復(fù)上述操作2次，合并濾液，測(cè)定總酚含量。

2.6 抗氧化活性研究

2.6.1 白及總酚清除DPPH·能力 參照白子凡、黃申等[12-13]報(bào)道改進(jìn)，以維生素C為對(duì)照品，配制0.025、0.050、0.075、0.100、0.125、0.150 mg/mL總酚溶液，各取1.0 mL，加入4.0 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液，混勻后避光反應(yīng)30 min，以無(wú)水乙醇為參比，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，重復(fù)3次，計(jì)算抑制率(I)，公式為I=[A0-(Ai-Bi)]/A0×100%，其中A0為4.0 mL DPPH乙醇溶液與1.0 mL蒸餾水混合后的吸光度，Ai為4.0 mL DPPH乙醇溶液與1.0 mL樣品溶液混合后的吸光度，Bi為4.0 mL乙醇溶液與1.0 mL樣品溶液混合后的吸光度。

2.6.2 白及總酚清除ABTS+·能力 參照高華山、趙康宏等[14-15]報(bào)道改進(jìn)，以維生素C為對(duì)照，配制0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL總酚溶液，各取0.5 mL，加入4.5 mL 6 mmol/L ABTS+·工作液，混勻后避光反應(yīng)30 min，以蒸餾水為參比，于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，重復(fù)3次，計(jì)算抑制率(I)，公式為I=[A0-(Ai-Bi)]/A0×100%，其中A0為4.5 mL ABTS+·工作液與0.5 mL蒸餾水混合后的吸光度，Ai為4.5 mL ABTS+·工作液與0.5 mL樣品溶液混合后的吸光度，Bi為4.5 mL蒸餾水與0.5 mL樣品溶液混合后的吸光度。

2.6.3 半抑制濃度(IC50)計(jì)算 根據(jù)抑制率(I)繪制一元回歸方程，計(jì)算樣品對(duì)DPPH·和ABTS+·的IC50[16]。

2.6.4 總還原力測(cè)定 采用普魯士藍(lán)法[17]。以維生素C為對(duì)照，配制0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL總酚溶液，各取2.5 mL，加入2.5 mL 0.2 mol/L PBS溶液(pH 6.6)、2.5 mL 1%K3[Fe(CN)6]溶液，混勻，50 ℃水浴20 min，加入2.5 mL 10%TCA混勻，吸取2.5 mL，加2.5 mL蒸餾水、0.5 mL 0.1%FeCl3溶液，混勻，于700 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度。

3 結(jié)果

3.1 總酚測(cè)定波長(zhǎng) 總酚類物質(zhì)在堿性溶液中可以將福林酚溶液中的鎢酸鈉還原生成藍(lán)色化合物，該化合物在770 nm附近有最大吸收峰[18]。沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液與白及塊莖總酚供試品溶液與福林酚溶液反應(yīng)的光譜掃描圖表明，兩者最大吸收波長(zhǎng)一致。

3.2 單因素試驗(yàn)

3.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 圖1顯示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，總酚含量先升高后下降，在70%后更明顯，這主要是因?yàn)榭偡訛槎嗔u基化合物，具有較強(qiáng)的極性，乙醇體積分?jǐn)?shù)升高會(huì)導(dǎo)致溶劑極性下降，從而總酚含量降低。因此，選取50%、60%、70%作為正交試驗(yàn)考察范圍。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)白及總酚含量的影響

3.2.2 液料比 圖2顯示，隨著液料比增加，總酚含量緩慢上升；隨著溶劑用量進(jìn)一步升高，增大了溶質(zhì)和溶劑的接觸面積，細(xì)胞內(nèi)外溶質(zhì)的濃度差增大，有利于總酚溶出，當(dāng)液料比高于35∶1時(shí)呈下降趨勢(shì)，可能是其他物質(zhì)的溶出也在變多，形成了競(jìng)爭(zhēng)抑制。因此，選取30∶1、35∶1、40∶1作為正交試驗(yàn)考察范圍。

圖2 液料比對(duì)白及總酚含量的影響

3.2.3 提取溫度 圖3顯示，隨著提取溫度升高，總酚含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在70 ℃時(shí)最高；隨著溫度進(jìn)一步升高，分子熱運(yùn)動(dòng)不斷增強(qiáng)，總酚溶出量增加，但高于70 ℃時(shí)反而降低，可能是總酚被氧化所致。因此，選取60、70、80 ℃作為正交試驗(yàn)考察范圍。

圖3 提取溫度對(duì)白及總酚含量的影響

3.2.4 提取時(shí)間 圖4顯示，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，總酚含量先上升后下降，其原因可能是該成分在溶劑中部分被氧化，同時(shí)一些雜質(zhì)也溶于溶劑中所致。因此，選取1、1.5、2 h作為正交試驗(yàn)考察范圍。

圖4 提取時(shí)間對(duì)白及總酚含量的影響

3.2.5 提取次數(shù) 圖5顯示，提取1次后即可得到總含量的80%以上的總酚，綜合考慮時(shí)間和成本，確定提取次數(shù)為1次。

3.3 正交試驗(yàn) 結(jié)果、方差分析表分別見(jiàn)表1～2。由此可知，各因素影響程度依次為提取溫度>乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取時(shí)間>液料比，但對(duì)總酚含量影響都不顯著(P>0.05)；最優(yōu)工藝為A2B3C3D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，液料比40∶1，提取溫度80 ℃，提取時(shí)間2 h。在此條件下進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得總酚含量為2 788 μg/g。

圖5 提取次數(shù)對(duì)白及總酚含量的影響

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表2 方差分析

3.4 總酚含量測(cè)定 表3顯示，不同部位總酚含量依次為葉>須根>莖>塊莖。

表3 白及不同部位總酚含量測(cè)定結(jié)果

3.5 抗氧化活性研究

3.5.1 DPPH·清除能力 圖6、表4顯示，莖、葉、塊莖、須根中總酚都具有清除DPPH·能力，并呈劑量依賴性；IC50依次減小，即抗氧化活性依次增強(qiáng)，并低于或接近相同質(zhì)量濃度維生素C。

圖6 白及總酚清除DPPH·能力

表4 白及不同部位總酚抗氧化活性比較(DPPH·法)

3.5.2 ABTS+·清除能力 圖7、表5顯示，莖、葉、塊莖、須根中總酚對(duì)ABTS+·都具有清除能力，并呈劑量依賴性；在質(zhì)量濃度低于60 μg/mL時(shí)，須根IC50最低、葉次之、莖最高，即抗氧化活性依次為須根>葉>塊莖>莖，而為60 μg/mL時(shí)抗氧化活性依次為須根>塊莖>維生素C>葉>莖。

圖7 白及總酚清除ABTS+·能力

表5 白及不同部位總酚抗氧化活性比較(ABTS+·法)

3.5.3 總酚還原能力 圖8顯示，隨著莖、葉、塊莖、須根總酚質(zhì)量濃度增加，吸光度逐漸增大，表明其還原能力(即抗氧化活性)逐漸增強(qiáng)，在相同質(zhì)量濃度下，抗氧化活性依次為須根>維生素C>塊莖>葉>莖。

圖8 白及總酚還原能力

4 討論

白及作為一味傳統(tǒng)的中藥，由于人為的過(guò)度采挖和天然生境的破壞，野生白及資源急劇減少，瀕臨滅絕。本實(shí)驗(yàn)以紫花三叉白及為材料，測(cè)定白及須根、塊莖、莖和葉中的總酚含量。通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化了白及總酚最優(yōu)提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，液料比40∶1，提取溫度80 ℃，提取時(shí)間2 h，提取1次，測(cè)得白及須根總酚含量為(1.34±0.023)%，白及塊莖總酚含量為(0.35±0.015)%，白及莖總酚含量為(0.86±0.021)%，白及葉總酚含量為(3.22±0.031)%。結(jié)果表明，白及不同部位總酚含量依次為葉>須根>莖>塊莖。

酚類物質(zhì)是植物中廣泛存在的抗氧化活性成分。本實(shí)驗(yàn)采用DPPH法、ABTS法和普魯士藍(lán)法測(cè)定白及須根、塊莖、葉和莖的總酚都具有較強(qiáng)的抗氧化活性，且同濃度的白及須根總酚抗氧化活性優(yōu)于塊莖、葉和莖。由于總酚是酚類化合物的總稱，同一濃度下酚類化合物不同組成在一定程度上影響總酚的生物活性。另外，白及不同部位可能存在具有較強(qiáng)的抗氧化活性未知成分，從而影響其抗氧化活性。目前《中國(guó)藥典》只收載白及塊莖，其須根、葉和莖則棄之不用。本研究結(jié)果為深度開(kāi)發(fā)和利用白及資源，提高白及的附加值及其天然抗氧化活性物質(zhì)研究提供科學(xué)基礎(chǔ)。