張靜嫻，杜桂林,3，史吉平,3，馬治國，袁辰陽,3，劉相岑，張保國

(1中國科學(xué)院 上海高等研究院，上海 201210; 2中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049； 3上?？萍即髮W(xué) 生命學(xué)院，上海 201210)

隨著人口數(shù)量增加、人民生活水平逐漸提高，一系列社會(huì)問題日益凸顯，比如農(nóng)業(yè)和食品加工業(yè)的固體廢棄物驟增帶來的環(huán)保壓力，耕地面積銳減導(dǎo)致糧食和飼料用地競(jìng)爭(zhēng)、飼料成本上升[1-2]。水稻和蔬菜是維持人類營養(yǎng)需求的兩大類主要作物，據(jù)統(tǒng)計(jì)我國每年因生產(chǎn)和銷售產(chǎn)生的蔬菜廢棄物及水稻秸稈約8億和9億t[2-3]，蔬菜廢棄物通常含水率高,易腐爛，比如甘藍(lán)、花椰菜、莧菜；而水稻秸稈含水量低，降解速度慢。據(jù)報(bào)告我國每年約有20%作物秸稈和70%蔬菜廢棄物未被合理利用，而是采用焚燒或者掩埋方式處理，從而引起大氣和土壤污染、溫室氣體排放、病原體傳播等環(huán)境污染問題，所以這兩類農(nóng)業(yè)固體廢棄物的減量化和資源化利用方式亟待開發(fā)[2,4-6]。這兩類作物廢棄物的產(chǎn)生具有季節(jié)性、區(qū)域性的特點(diǎn)，利用兩者含水率互補(bǔ)的特點(diǎn)將其飼料化利用是一種被普遍認(rèn)可的資源化方式[1,3,7-9]。事實(shí)上，蔬菜廢棄物干物質(zhì)中富含維生素、粗脂肪，而作物秸稈富含反芻動(dòng)物能夠消化利用的多糖，所以蔬菜廢棄物和作物秸稈可作為廉價(jià)的飼料原料來應(yīng)對(duì)飼料短缺、成本高的問題；此外將二者混合貯存不僅可以有效延長飼料貯藏時(shí)間，而且還可以有效降低飼料原料附生的病原菌、改善感官品質(zhì)和營養(yǎng)成分[7,10]。因此，研究甘藍(lán)尾菜和干水稻秸稈混貯發(fā)酵方式，對(duì)于緩解農(nóng)業(yè)固廢帶來的環(huán)境壓力和飼料短缺問題具有重要意義。

混合青貯是一個(gè)厭氧固體發(fā)酵過程，通常伴隨著微生物群落演替、新陳代謝，從而改變飼料原料的理化特性。發(fā)酵良好的青貯飼料往往是以乳酸菌為優(yōu)勢(shì)和關(guān)鍵物種，通過同型乳酸發(fā)酵降低原料pH和病原菌含量，使干物質(zhì)含量不變[10]。據(jù)報(bào)道，新鮮青貯飼料原料中的乳酸菌數(shù)量達(dá)到105CFU/g，可有效保留飼料中的養(yǎng)分[2-11]。在青貯過程中，附生乳酸菌將水溶性碳水化合物代謝為有機(jī)酸(如乳酸、乙酸、丁酸)，以迅速降低pH值并抑制有害微生物以及青貯過程不需要的其他微生物。然而，還有一些附生病原體(如腸桿菌屬Enterobacter、曲霉菌屬Aspergillus)和產(chǎn)孢細(xì)菌(如梭狀芽孢桿菌Clostridium、芽孢桿菌屬Bacillus)可以存在于酸性和厭氧環(huán)境中，導(dǎo)致微生物毒素積累和乳酸發(fā)酵生產(chǎn)效率降低[10,12-13]。系統(tǒng)地研究青貯飼料發(fā)酵過程中的微生物群落演替、多樣性及其表型功能,可以促進(jìn)對(duì)青貯飼料生產(chǎn)過程的了解。前人在分析微生物多樣性時(shí)應(yīng)用了多種分子生物學(xué)的方法，如16S rRNA克隆建庫、變性梯度凝膠電泳技術(shù)(PCR-DGGE)、限制性片段長度多樣性(T-RFLP)等[14]。目前，新一代高通量測(cè)序技術(shù)在微生物多樣性分析中應(yīng)用較多，其直接根據(jù)樣品中提取的DNA，同時(shí)進(jìn)行幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定，不僅能夠分析樣品中的微生物種類以及相對(duì)豐度(RA)，而且能夠?qū)颖局械奈⑸飳?shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的分類，挖掘分析樣品中低豐度的菌群，最大限度地保留樣品中微生物的信息[14-15]。與此同時(shí)，新一代測(cè)序技術(shù)(如16S rRNA基因克隆文庫、宏基因組學(xué))和生物信息學(xué)注釋工具(如BugBase、FUNGuild)的開發(fā)使得環(huán)境微生物研究更加方便[16-20]，例如Du等[21]在甘藍(lán)尾菜厭氧發(fā)酵過程中，基于OTU測(cè)序數(shù)據(jù)首次利用BugBase和FUNGuild注釋工具預(yù)測(cè)微生物群落功能多樣性。研究報(bào)道，生態(tài)環(huán)境中微生物群落的演替以及環(huán)境因子的變化主要受到關(guān)鍵物種而非優(yōu)勢(shì)物種的影響[20,22]，而在青貯飼料領(lǐng)域很少有學(xué)者關(guān)注關(guān)鍵物種的作用機(jī)制。

本研究將蔬菜廢棄物甘藍(lán)尾菜與干水稻秸稈混合貯存厭氧發(fā)酵30 d，分析厭氧發(fā)酵過程中發(fā)酵指標(biāo)、營養(yǎng)成分、微生物群落演替和表型功能變化，同時(shí)探究影響微生物群落演替及其青貯性能的關(guān)鍵微生物物種，旨在為甘藍(lán)尾菜和干水稻秸稈飼料化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

干水稻秸稈購自長遠(yuǎn)秸稈加工廠(中國安徽)，均勻粉碎至長度為1～2 cm。甘藍(lán)(BrassicaoleraceaL.)尾菜收集于上海市浦東新區(qū)北蔡農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)，切碎至大小為2 cm×2 cm。玉米粉購自河北保定淶水縣金谷糧油食品有限公司。3種原材料的主要理化特性(以干物質(zhì)計(jì))見表1。

表1 3種原材料的主要理化特性Table 1 Physicochemical parameters of the three raw materials

EM菌劑(產(chǎn)品編號(hào)：OKH0601；糞腸球菌≥10億 CFU/g，枯草芽孢桿菌≥100億CFU/g)購自洛陽歐科拜克生物技術(shù)股份有限公司(中國河南)，主要包括泛菌屬Pantoea和腸球菌屬Enterococcus。

1.2 青貯試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將10.0 g EM菌劑和100 mL無菌8.0 g/L NaCl溶液于500 mL錐形瓶中混合，30 ℃恒溫條件下振蕩1 h，獲得液體接種劑。每袋混貯發(fā)酵樣品由180 g甘藍(lán)尾菜、40 g干水稻秸稈、40 g玉米粉和5 mL上述液體接種劑組成，自然pH值和含水率。將混合原料裝入青貯發(fā)酵袋(23 cm×30 cm，PET塑料)中，用真空封口機(jī)抽盡空氣并封口，共15個(gè)平行，將青貯發(fā)酵袋置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，避光厭氧發(fā)酵30 d。在發(fā)酵的第0，3，7，15，30天取樣，每次取樣3個(gè)平行，并于-20 ℃冰箱保存。

1.3 分析樣本的制備

第一份浸提液沉淀的收集：將20.0 g青貯樣品與180 mL無菌8.0 g/L NaCl溶液在500 mL錐形瓶中混合，30 ℃恒溫條件下振蕩1 h，之后將上述溶液用4層無菌醫(yī)用紗布抽濾，將濾液在4 ℃、10 000×g離心20 min，收集沉淀物用于微生物群落分析。

第二份浸提液的上清液收集：收集方法與第一份浸提液類似，只是用無菌水代替無菌8.0 g/L NaCl溶液，于4 ℃、10 000×g離心20 min后收集上清液，用于分析后續(xù)的理化指標(biāo)(水溶性碳水化合物(WSC)、pH、乙酸、丁酸、乳酸、乙醇、氨氮、總氮含量)[23]。

1.4 理化特性分析

1.4.1 發(fā)酵品質(zhì) 取100 g左右混貯發(fā)酵樣品于65 ℃下干燥72 h以測(cè)定干物質(zhì)(DM)含量。參考Gu等[24]的方法，使用島津20AVP液相色譜系統(tǒng)(日本京都島津公司)檢測(cè)有機(jī)酸(乳酸、乙酸、丁酸)和乙醇含量。使用數(shù)字pH計(jì)(美國Sartorius PB-10)測(cè)定pH值。使用納氏試劑(美國Hach公司)測(cè)定氨氮含量，使用元素分析儀(Perkinelmer系列Ⅱ 2400，英國)檢測(cè)總氮含量，銨態(tài)氮含量用氨氮與總氮含量之比計(jì)算。WSC含量采用蒽酮法[25]測(cè)定。

1.4.2 營養(yǎng)成分 取100 g左右混貯發(fā)酵樣品于65 ℃下干燥72 h，之后將樣品用小型粉碎機(jī)粉碎后過孔徑0.037 mm篩，并用自封袋保存于干燥避光處，用于測(cè)定營養(yǎng)成分(粗蛋白(CP)、粗脂肪(CF)、酸性洗滌纖維素(ADF)、中性洗滌纖維素(NDF))含量，具體檢測(cè)方法參考張麗英的《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》[26]進(jìn)行分析。

1.5 樣品DNA的提取和PCR擴(kuò)增

稱取0.25 g第一份浸提液沉淀，參考E.Z.N.A.?soil DNA Kit (Omega Bio-Tek,Norcro-ss,GA,USA)說明書提取基因組DNA，DNA樣品的純度和濃度用NanoDrop 2000 UV-vis spectrophotometer (Thermo Scientific,Wilmington,USA)檢測(cè)，所有DNA樣品均保存在-80 ℃冰箱。以上述基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增原核生物16S的V3-V4可變區(qū)域和真核生物的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1-ITS2,使用的引物分別為帶有條形碼融合引物的338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTC-TAAT-3′)以及ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGA-GGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的質(zhì)量，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)回收PCR產(chǎn)物，操作流程參考AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行。將回收的PCR產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行Illumina文庫構(gòu)建和Illumina MiSeq平臺(tái)(Illumina,San Diego,USA)測(cè)序，具體流程參考任海偉等[5]的方法進(jìn)行。本研究中的所有原始序列集已上傳到NCBI(BioProject ID：PRJNA686717，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)。

1.6 生物信息學(xué)分析

使用QIIME(版本1.9.1，http://qiime.org/)對(duì)原始Illumina fastq文件進(jìn)行解復(fù)用、質(zhì)量過濾和分析。使用UPARSE(版本7.1)將質(zhì)量過濾后的序列聚類作為操作分類單元(OTU)，按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列(不含單序列)進(jìn)行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列。將所有優(yōu)化序列map至OTU代表序列，選出與OTU代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。用UCHIME去除嵌合序列，使用RDP Classifier2.2將測(cè)序序列與數(shù)據(jù)庫silva138 (https://www.arb-silva.de/)和Unite 8.0(https://unite.ut.ee/)中的序列進(jìn)行比對(duì)和物種注釋，置信閾值為70%。質(zhì)控后的序列以O(shè)TU為最小分類單元進(jìn)行抽平，每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)序列數(shù)除以總序列數(shù)即為該OTU對(duì)應(yīng)的相對(duì)豐度(RA)。生物信息學(xué)分析均在Majorbio云平臺(tái)上(https://www.majorbio.com)進(jìn)行操作。青貯過程中細(xì)菌和真菌的Alpha多樣性指數(shù)(Coverage指數(shù)、Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù))使用Mothur 1.30.2分析。青貯過程中微生物物種的差異使用PCoA和Adonis檢驗(yàn)(OUT水平999個(gè)隨機(jī)排列，Bray-Curtis相異)進(jìn)行評(píng)估。用BugBase(https://bugbase.cs.umn.edu/)預(yù)測(cè)和分析細(xì)菌表型[17],利用FUNGuild(http://www.funguild.org/)對(duì)真菌的表型、營養(yǎng)模式和生態(tài)公會(huì)進(jìn)行注釋[18]?；谖锓N屬水平的相對(duì)豐度，分析物種之間Spearman相關(guān)性，并構(gòu)建共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)圖，使用Gephi 0.9.2繪制其共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)圖，紅色和綠色的點(diǎn)(nodes)分別代表細(xì)菌屬和真菌屬，紅色和綠色的邊(edges)分別代表相連的兩個(gè)屬的正相關(guān)和負(fù)相關(guān)關(guān)系，共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)圖僅展示RA>1%的屬之間的相關(guān)性(Spearman相關(guān)性系數(shù)>0.7，P<0.05)[27]。利用冗余分析(RDA，Canoco 5)評(píng)估甘藍(lán)尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中樣品理化指標(biāo)與微生物優(yōu)勢(shì)物種間相關(guān)性，并計(jì)算了理化指標(biāo)pH、CF、WSC等對(duì)微生物優(yōu)勢(shì)物種變化的解釋度[28]。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用SPSS 26.0軟件計(jì)算和分析數(shù)據(jù)，Origin 2021繪制圖形，Excel 2019繪制表格。數(shù)據(jù)之間的差異性用單因子ANOVO模型分析，并用Tukey事后檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍(lán)尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中發(fā)酵品質(zhì)的變化

甘藍(lán)尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中發(fā)酵品質(zhì)的變化如表2所示。

表2 甘藍(lán)尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵不同時(shí)間后發(fā)酵品質(zhì)的變化Table 2 Variation of fermentation characteristic indicators with different fermentation times in co-ensiling of cabbage waste and dry rice straw

表2顯示，與發(fā)酵前(第0天)相比，發(fā)酵結(jié)束時(shí)(30 d)pH、干物質(zhì)和水溶性碳水化合物含量顯著下降，乳酸、乙酸、丁酸和乙醇含量顯著積累(P<0.05)。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，干物質(zhì)含量逐漸降低，發(fā)酵結(jié)束時(shí)為270.4 g/kg，干物質(zhì)含量保留了87.5%。pH值由初始的弱酸性5.9迅速降低到4.6(第3天)，并于腐熟階段(第30天)降低至4.0。與發(fā)酵前相比，第3～15天銨態(tài)氮含量顯著增加，但在發(fā)酵結(jié)束時(shí)降低到5.9%。微生物發(fā)酵代謝產(chǎn)物有機(jī)酸和乙醇含量的變化趨勢(shì)與銨態(tài)氮相似，即發(fā)酵前期迅速增加而發(fā)酵結(jié)束時(shí)明顯降低。上述結(jié)果表明甘藍(lán)尾菜和干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中，發(fā)酵品質(zhì)明顯改善，但15 d之后發(fā)酵品質(zhì)會(huì)略有下降。

2.2 甘藍(lán)尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中營養(yǎng)成分的變化

甘藍(lán)尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中主要營養(yǎng)成分的變化如表3所示。表3顯示，與發(fā)酵前相比，發(fā)酵結(jié)束時(shí)粗脂肪、粗蛋白、酸性洗滌纖維素含量無顯著變化(P>0.05)，而中性洗滌纖維素含量顯著上升(P<0.05)。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，粗脂肪含量總體上先降低后增加，粗蛋白含量無明顯變化，酸性洗滌纖維素和中性洗滌纖維素含量總體上均先增加后降低。

表3 甘藍(lán)尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵不同時(shí)間后營養(yǎng)成分的變化Table 3 Variation of nutrition indicators with different fermentation times in co-ensiling of cabbage waste and dry rice straw g/kg

2.3 甘藍(lán)尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中微生物群落演替的變化

微生物Alpha多樣性指數(shù)(Coverage指數(shù)、Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù))可以反映物種的多樣性，其中Coverage指數(shù)表示測(cè)序和處理后的數(shù)據(jù)是否能代表樣本中微生物群落的真實(shí)情況；Shannon指數(shù)越大，說明群落多樣性越高；Chao1指數(shù)越大，說明群落豐富度越高。甘藍(lán)尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中微生物群落演替的變化見表4和表5。

表4 甘藍(lán)尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵不同時(shí)間后微生物群落Alpha多樣性指數(shù)的變化Table 4 Variation of Alpha diversity indicators of microbial community with different fermentation times in co-ensiling of cabbage waste and dry rice straw

表5 甘藍(lán)尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中微生物群落門水平上的物種相對(duì)豐度比較Table 5 Comparison of species RA differences of microbial communities at the phylum level in co-ensiling of cabbage waste and dry rice straw

由表4可知，細(xì)菌和真菌群落的Coverage指數(shù)為0.99～1.00，說明研究結(jié)果準(zhǔn)確地反映了貯存過程中的微生物群落的變化。細(xì)菌群落的Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)均于發(fā)酵第3天之后顯著下降(P<0.05)，真菌群落的Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)無顯著變化，可知與真菌群落相比，混貯發(fā)酵過程對(duì)細(xì)菌群落的影響更顯著。

表5顯示，發(fā)酵前(0 d)門水平上的優(yōu)勢(shì)物種(RA>5%)包括細(xì)菌界的厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteriota)、變形菌門(Proteobacteria)和真菌界的子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)。與發(fā)酵前(0 d)相比，發(fā)酵過程中(3～30 d)細(xì)菌界優(yōu)勢(shì)物種放線菌門和變形菌門相對(duì)豐度顯著下降(P<0.05)，厚壁菌門相對(duì)豐度顯著增加(P<0.05)；真菌界的優(yōu)勢(shì)物種子囊菌門和擔(dān)子菌門相對(duì)豐度無顯著變化(P>0.05)。

表6顯示，發(fā)酵前(0 d)屬水平上的優(yōu)勢(shì)物種(RA>5%)包括細(xì)菌界的泛菌屬(Pantoea，RA 33.42%)、芽孢菌屬(Bacillus,RA 18.98%)、腸桿菌屬(Enterobacter，RA 10.15%)和真菌界的節(jié)擔(dān)菌屬(Wallemia，RA 20.14%)、鐮孢菌屬(Fusarium，RA 44.28%)、曲霉屬(Aspergillus，RA 19.53%)、未分類的酵母目(unclassified_o__Saccharomycetales，RA 13.77%)。與發(fā)酵前(0 d)相比，發(fā)酵過程中(3～30 d)細(xì)菌界的片球菌屬(Pediococcus)、未分類的腸桿菌科(unclassified_f__Enterobacteriaceae)、腸球菌屬(Enterococcus)、魏斯氏菌屬(Weissella)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、未分類的乳桿菌科(unclassified_f__Lactobacillaceae)相對(duì)豐度均顯著增加(P<0.05)，泛菌屬、芽孢菌屬和葡萄球菌屬(Staphylococcus)相對(duì)豐度均顯著下降(P<0.05)；發(fā)酵過程中真菌界的unclassified_f__Dipodascaceae相對(duì)豐度顯著增加，鐮孢菌屬(Fusarium)、曲霉屬(Aspergillus)、未分類的酵母目(unclassified_o__Saccharomycetales)、帚枝霉屬(Sarocladium)相對(duì)豐度均顯著下降(P<0.05)。

表6 甘藍(lán)尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中微生物群落屬水平上的物種相對(duì)豐度比較Table 6 Comparison of species RA differences in microbial communities at the genus level in co-ensiling of cabbage waste and dry rice straw

2.4 甘藍(lán)尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中微生物群落功能多樣性的變化

微生物群落組成的變化可能引起其功能多樣性的變化?；诩?xì)菌16S的V3-V4可變區(qū)域和真核生物的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1-ITS2的測(cè)序結(jié)果，對(duì)甘藍(lán)尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中微生物群落的功能表型進(jìn)行注釋，結(jié)果見圖1。圖1顯示，9種細(xì)菌功能表型被注釋，包括耐氧性(需氧型、厭氧型、兼性厭氧型)，革蘭氏陽性/革蘭氏陰性，形成生物膜，包含移動(dòng)原件，潛在致病型，氧化脅迫耐受；同時(shí)12種真菌功能表型被注釋，包括未定義的腐生型、土壤腐生型、植物致病型、動(dòng)物致病型、未知型以及致病型1～7。初始階段(第0天)，原材料中細(xì)菌群落的主要類型包含兼性厭氧型(RA 81.1%)、需氧型(RA 18.8%)、厭氧型(RA 0.2%)、形成生物膜(RA 66.3%)、革蘭氏陰性(RA 59.5%)、潛在致病型(RA 74.5%)；發(fā)酵過程中，需氧型、形成生物膜、潛在致病型、革蘭氏陰性細(xì)菌相對(duì)豐度總體上均顯著降低(P<0.05)，并在第30天時(shí)相對(duì)豐度分別為8.0%，31.5%，31.8%，31.3%。發(fā)酵0 d時(shí)，原料中富集兩類真菌群落，分別為未定義的腐生型真菌(RA 54.60%)和動(dòng)物致病型-植物內(nèi)生型-地衣寄生型-植物病原型-土壤腐生型-木腐型(致病型4，RA 44.28%)，發(fā)酵過程中致病型真菌相對(duì)豐度顯著下降，未定義的腐生型真菌顯著富集(P<0.05)；青貯第30天時(shí)，真菌群落的表型主要包括動(dòng)物致病型(RA 15.64%)和未定義的腐生型真菌(RA 80.55%)。

2.5 甘藍(lán)尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中微生物群落間的互作關(guān)系

為了觀測(cè)微生物群落演替過程中物種間的互作關(guān)系，基于物種屬水平相對(duì)豐度的變化構(gòu)建了共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖2。圖2顯示，共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)由38個(gè)點(diǎn)(代表細(xì)菌屬或真菌屬)和91條無向的邊(代表相連細(xì)菌屬或真菌屬之間的相關(guān)性)組成，包含72個(gè)顯著較強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系和19個(gè)顯著較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)關(guān)系；網(wǎng)絡(luò)直徑為7.0，平均維度4.8，模塊性0.424，僅1個(gè)連接的組分。片球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、未分類的乳桿菌科4類乳酸菌與其他物種多呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；節(jié)擔(dān)菌屬Wallemia和unclassifi-ed_f__Dipodascaceae2類腐生型真菌與其他物種多呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。細(xì)菌屬的維度(單個(gè)屬具有的相關(guān)性)普遍高于真菌屬，尤其是鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas、類芽孢桿菌屬Paenibacillus、短桿菌屬Brevibacterium、芽孢桿菌屬Bacillus。優(yōu)勢(shì)物種片球菌屬與泛菌屬Pantoea、葡萄球菌屬Staphylococcus、曲霉菌屬Aspergillus呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與unclassified_f__Dipodascaceae呈正相關(guān)關(guān)系。乳桿菌屬Lactobacillus與未定義的酵母目unclassified_o__Saccharomycetales、假單胞菌屬Pseudomonas、曲霉屬Aspergillus呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與假絲酵母屬Candida呈正相關(guān)關(guān)系。腸球菌屬Enterococcus與短狀桿菌屬Brachybacterium、小單胞菌屬M(fèi)icromonospora、短桿菌屬呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與魏斯氏菌屬Weissella、未分類的乳桿菌目unclassified_o__Lactobacillales呈正相關(guān)關(guān)系。未分類的乳桿菌科unclassified_f__Lactobacillacea與泛菌屬、Lapillicoccus呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。優(yōu)勢(shì)真菌節(jié)擔(dān)菌屬Wallemia與類芽孢桿菌屬Paenibacillus、鞘氨醇單胞菌屬、短狀桿菌屬呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；優(yōu)勢(shì)真菌unclassified_f__Dipodascaceae與Methylobacterium-Methylorubrum、葡萄球菌屬、鐮孢菌屬Fusarium、曲霉屬呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與片球菌屬、假絲酵母屬Candida呈正相關(guān)關(guān)系。

2.6 甘藍(lán)尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中微生物優(yōu)勢(shì)物種與理化指標(biāo)的相關(guān)性

利用冗余分析(RDA)研究混貯發(fā)酵過程中優(yōu)勢(shì)微生物物種相對(duì)豐度與理化指標(biāo)的相關(guān)性，以及理化指標(biāo)對(duì)優(yōu)勢(shì)物種變化的解釋度,結(jié)果見圖3。圖3顯示，RDA前兩個(gè)軸共解釋了86.76%的優(yōu)勢(shì)物種的變化，此外pH、WSC、CF是影響微生物優(yōu)勢(shì)物種演替的關(guān)鍵理化因子，分別解釋了微生物優(yōu)勢(shì)物種演替的73.7%，10.2%，4.7%。pH、CF、WSC、DM之間呈正相關(guān)，其與微生物代謝產(chǎn)物有機(jī)酸(乳酸、乙酸、丁酸)以及乙醇和銨態(tài)氮含量之間呈負(fù)相關(guān)。pH、WSC與優(yōu)勢(shì)物種鐮孢菌屬、曲霉屬、泛菌屬、腸桿菌屬相對(duì)豐度之間呈正相關(guān)關(guān)系，與片球菌屬、未分類的腸桿菌科unclassified_f__Enterobacteriaceae的相對(duì)豐度之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。CF與優(yōu)勢(shì)物種腸球菌屬、節(jié)擔(dān)菌屬相對(duì)豐度之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

3 討 論

3.1 混貯發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的變化

混貯發(fā)酵過程中充足的DM (>200 g/kg)和WSC (>50 g/kg)是反映青貯飼料品質(zhì)優(yōu)劣的基礎(chǔ)指標(biāo)[29]。本研究中，甘藍(lán)尾菜與干水稻秸稈發(fā)酵0 d時(shí)DM(309.0 g/kg)和WSC含量(71.9 g/kg)均達(dá)標(biāo)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)(30 d)DM、WSC含量以及pH均顯著下降，可能是因?yàn)槲⑸锝到饬嗽现械奶妓衔铮绕涫且捉到獾腤SC代謝產(chǎn)生了乙醇、銨態(tài)氮和有機(jī)酸(LA、AA和BA)。pH值是評(píng)價(jià)青貯飼料品質(zhì)優(yōu)良的重要指標(biāo)[5]。一般優(yōu)良青貯飼料的適宜pH為3.8～4.2。本試驗(yàn)中，pH值在發(fā)酵15 d時(shí)為4.1，發(fā)酵結(jié)束時(shí)為4.0，在適宜pH范圍內(nèi)。Cao等[11]發(fā)現(xiàn)，蔬菜廢棄物貯存過程中，有機(jī)酸的積累會(huì)導(dǎo)致pH迅速下降，并且抑制霉菌、腸桿菌、芽孢桿菌的富集，這與本研究結(jié)果一致。此外，研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)良品質(zhì)的青貯飼料中銨態(tài)氮含量應(yīng)低于10%，而青貯飼料中銨態(tài)氮是由粗蛋白和多肽降解產(chǎn)生的，過高的銨態(tài)氮含量可能表征青貯飼料中蛋白質(zhì)和多肽水解反應(yīng)迅速，營養(yǎng)流失過快[7]。本試驗(yàn)中，銨態(tài)氮含量在青貯3～15 d過程中較高，表示青貯前半階段飼料中蛋白質(zhì)和多肽流失較快;青貯結(jié)束時(shí)銨態(tài)氮含量保持在5.9%，達(dá)到適宜銨態(tài)氮含量范圍。本試驗(yàn)中，與發(fā)酵15 d相比，發(fā)酵結(jié)束(30 d)時(shí)乳酸含量顯著下降，可能是酵母菌與乳酸菌存在共生機(jī)理作用，酵母菌可以分泌水解酶代謝脂肪、蛋白質(zhì)和乳酸鹽，產(chǎn)生乳酸，為乳酸菌代謝提供了更多的底物[30-31]。本研究中，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，CF含量總體上先降低后增加，CP含量無明顯變化，ADF和DNF含量總體上均先增加后降低?？赡苁且?yàn)槲⑸飪?yōu)先代謝易降解的營養(yǎng)成分，如CP、CF、WSC，而ADF和NDF在厭氧條件下難以分解，所以在混貯發(fā)酵過程中ADF和DNF含量會(huì)略有上升。

3.2 混貯發(fā)酵過程中微生物群落的演替

微生物群落的演替及其代謝作用在青貯過程中起到至關(guān)重要的作用，尤其是關(guān)鍵乳酸菌可以將底物中的碳水化合物代謝為乳酸，并抑制病原菌在發(fā)酵過程中的富集。Alpha多樣性指數(shù)可以反映微生物物種的多樣性。本試驗(yàn)中，真菌和細(xì)菌群落Coverage指數(shù)均大于0.99，表示測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確地反映了貯存過程中的微生物群落變化；細(xì)菌Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)在混貯發(fā)酵過程中均顯著下降(P<0.05)，真菌Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)在整個(gè)混貯發(fā)酵過程中無顯著變化(P>0.05)，說明本試驗(yàn)中發(fā)酵過程對(duì)細(xì)菌群落影響較大，對(duì)真菌群落影響較小。

混貯發(fā)酵樣品的品質(zhì)與微生物菌群結(jié)構(gòu)有密切聯(lián)系。本試驗(yàn)中，發(fā)酵結(jié)束時(shí)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌(RA>5%)由初始的泛菌屬、芽孢菌屬、腸桿菌屬轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗峋?片球菌屬、腸球菌屬、魏斯氏菌屬、未分類的乳桿菌科)和腸桿菌類(未分類的腸桿菌科、腸桿菌屬)。據(jù)報(bào)道，乳桿菌屬、片球菌屬、腸球菌屬和魏斯氏菌屬是青貯飼料中常見的乳酸菌，與發(fā)酵過程中有機(jī)酸的積累密切關(guān)聯(lián)[2,32]；而腸桿菌類細(xì)菌由于其具有較低的產(chǎn)有機(jī)酸效率和蛋白質(zhì)水解產(chǎn)銨態(tài)氮能力，通常被認(rèn)為是非理想菌群。在本試驗(yàn)中，主要的乳酸菌和腸桿菌類細(xì)菌平均相對(duì)豐度分別是72.3%和22.2%，而相對(duì)豐度較高的腸桿菌類細(xì)菌可能造成干物質(zhì)損失和銨態(tài)氮積累，所以為了提高青貯品質(zhì)，建議選用更適用的接種物，比如植物乳桿菌Lactobacillusplantarum[2]。本研究中，發(fā)酵結(jié)束時(shí)真菌群落的優(yōu)勢(shì)物種由腐生型的節(jié)擔(dān)菌屬、曲霉屬、未分類的酵母目以及致病型的鐮孢菌屬轉(zhuǎn)變?yōu)楦偷墓?jié)擔(dān)菌屬、致病型的鐮孢菌屬，其中致病型的鐮孢菌屬和腐生型的曲霉屬相對(duì)豐度在發(fā)酵過程中顯著下降，可能是因?yàn)檩^低的pH不利于其生長。Keshri等[16]發(fā)現(xiàn)，在小麥秸稈青貯曝氣過程中乳酸的降解和pH上升會(huì)導(dǎo)致鐮孢菌屬、曲霉屬2類霉菌顯著富集，造成混貯發(fā)酵樣品養(yǎng)分流失[16]。本試驗(yàn)中，青貯厭氧條件良好，混貯發(fā)酵樣品發(fā)酵特征指標(biāo)良好，發(fā)酵結(jié)束時(shí)鐮孢菌屬、曲霉屬的相對(duì)豐度也明顯下降。unclassified_f__Dipodascaceae屬于酵母目，在混貯發(fā)酵過程中相對(duì)豐度顯著增加，而原材料中的未分類的酵母目unclassified_o__Saccharomycetales相對(duì)豐度顯著下降，這2個(gè)屬都是腐生型真菌，不具備致病性。

3.3 混貯發(fā)酵過程中微生物群落功能的變化

在以往研究中，由于微生物群落較為復(fù)雜，故研究優(yōu)勢(shì)物種的功能表型效率很低，而BugBase、FUNGuild、PICRUSt2等生物信息學(xué)工具的開發(fā)，使預(yù)測(cè)微生物群落功能表型的效率得到明顯提高，且準(zhǔn)確性更高。本試驗(yàn)中，與發(fā)酵前(第0天)相比，發(fā)酵結(jié)束(30 d)時(shí)需氧型、形成生物膜、革蘭氏陰性、潛在致病型細(xì)菌相對(duì)豐度均顯著下降(P<0.05)，同時(shí)動(dòng)物致病型的真菌群落的相對(duì)豐度也顯著下降(P<0.05)。據(jù)前人報(bào)道，如果新鮮蔬菜廢棄物中乳酸菌的含量低于105CFU/g 新鮮原料，或者新鮮原料需氧型細(xì)菌含量大于106CFU/g ，可能會(huì)造成發(fā)酵過程中低效率的乳酸發(fā)酵和好氣性敗壞[2,10-11]，其中能形成生物膜的細(xì)菌可以緊密吸附到材料表面并且抵抗惡劣的外界環(huán)境，比如高溫、低pH和抗生素環(huán)境，這類細(xì)菌本身不一定具有致病性，但會(huì)給一些致病菌提供適宜的生長和傳播環(huán)境，從而引起寄主的一系列侵襲性疾病[33]。革蘭氏陰性細(xì)菌往往是潛在致病菌，由于其外膜上帶有的內(nèi)毒素會(huì)在細(xì)胞裂解后釋放出來，對(duì)于反芻動(dòng)物以外的動(dòng)物來說，飼料中富集這類細(xì)菌可能會(huì)造成動(dòng)物的食物中毒反應(yīng)[10]。而對(duì)于動(dòng)物致病性真菌，例如鐮孢菌屬在青貯過程中通常會(huì)產(chǎn)生鐮刀霉毒素，會(huì)嚴(yán)重影響畜牧行業(yè)動(dòng)物的生長性能和產(chǎn)品品質(zhì)[12]。本試驗(yàn)中，上述幾類非理想微生物的相對(duì)豐度明顯下降，推測(cè)可能與混貯發(fā)酵過程中產(chǎn)有機(jī)酸的乳酸菌和產(chǎn)乙醇的酵母菌的富集有關(guān)[10]。

3.4 微生物優(yōu)勢(shì)物種與理化指標(biāo)間的互作關(guān)系

微生物群落的演替不僅受到生物物種間的相互作用，同時(shí)發(fā)酵底物理化指標(biāo)的變化也會(huì)影響微生物菌群結(jié)構(gòu)。Banerjee 等[20]認(rèn)為，微生物共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)中，物種間顯著的相關(guān)性可能代表了物種間的協(xié)助共生作用,或物種間具有共同的捕食者、負(fù)相關(guān)的底物競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。本試驗(yàn)中，正相關(guān)普遍存在于相對(duì)豐度較低的微生物之間，比如芽孢桿菌、泛菌屬，推測(cè)可能是這些物種在混貯發(fā)酵過程中被優(yōu)勢(shì)物種顯著抑制從而具備正相關(guān)關(guān)系；一些乳酸菌和腐生型真菌與其他物種之間存在明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系，推測(cè)這些物種在混貯發(fā)酵過程中改善了青貯飼料品質(zhì)并抑制病原菌的富集。然而很少有學(xué)者同時(shí)研究青貯飼料中細(xì)菌、真菌群落的互作關(guān)系以及關(guān)鍵物種的作用。研究表明，在環(huán)境微生物群落中關(guān)鍵物種不一定是優(yōu)勢(shì)物種[18-19]，有些優(yōu)勢(shì)物種與微生物群落演替和發(fā)酵品質(zhì)改善沒有明顯的相關(guān)性。本研究中，節(jié)擔(dān)菌屬真菌在混貯發(fā)酵過程中一直保持較高的相對(duì)豐度(11.5%～95.9%)，但其對(duì)于有機(jī)酸、乙醇的積累和木質(zhì)纖維素的降解等未起到明顯作用，反而降低了粗脂肪含量；此外，片球菌屬和未分類的腸桿菌科可能促進(jìn)了WSC轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸(LA、AA、BA)，同時(shí)降低了pH值和鐮孢菌屬、曲霉屬、泛菌屬、腸桿菌屬的相對(duì)豐度，但一般認(rèn)為腸桿菌類產(chǎn)LA效率較低，實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)該降低該物種的豐度[10]。本研究中，unclassified_f__Dipodascaceae抑制了鐮孢菌屬、曲霉屬富集，與片球菌屬相互促進(jìn)，該結(jié)果與共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)圖中的結(jié)果一致。綜上所述，片球菌屬、unclassified_f__Dipodascaceae是甘藍(lán)尾菜和干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中改善青貯品質(zhì)的關(guān)鍵物種。

4 結(jié) 論

與發(fā)酵前相比，甘藍(lán)尾菜與干水稻秸稈混貯發(fā)酵后發(fā)酵品質(zhì)明顯改善，營養(yǎng)成分無明顯改善，干物質(zhì)含量被有效保存。貯存過程中細(xì)菌群落的多樣性和豐富度顯著下降，乳酸菌群和腐生型真菌作為優(yōu)勢(shì)物種顯著富集，并有效抑制非理想菌群(尤其是需氧型和潛在致病微生物)的積累。此外，片球菌屬、unclassified_f__Dipodascaceae是甘藍(lán)尾菜和干水稻秸稈混貯發(fā)酵過程中改善青貯品質(zhì)的關(guān)鍵物種?；熨A發(fā)酵是資源化處理甘藍(lán)尾菜與干水稻秸稈的有效方式。