賈永霞, 楊秋霞, 曾雷，徐巧林*，劉少博，徐信蘭，譚建文

三葉木通藤莖的三萜成分及其抗菌活性研究

賈永霞1, 楊秋霞1, 曾雷2，徐巧林2*，劉少博3，徐信蘭1，譚建文3

(1.中國(guó)科學(xué)院華南植物園，廣州 510650；2.廣東省林業(yè)科學(xué)研究院廣東省森林培育與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510520；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣州 510642)

為闡明三葉木通()藤莖的化學(xué)成分及其抗菌物質(zhì)基礎(chǔ)，采用正、反相硅膠柱色譜、凝膠柱色譜及半制備液相色譜等方法對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行研究，從其乙醇提取物中得到9個(gè)三萜類化合物，根據(jù)理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)，其結(jié)構(gòu)分別鑒定為stachlic acid A (1)，齊墩果酸(2)、烏蘇酸(3)、2,3-dihydroxyolean-13(18)-en-28-oic acid (4)、serratagenic acid (5)、gypsogenic acid (6)、20-hydroxyl-29-noroleanolic acid (7)、mesembryanthemoidigenic acid (8)和12-hydroxy--lactone (9)?？咕钚苑治霰砻鳎衔?和3對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌和枯草芽胞桿菌有顯著的抗菌活性，但對(duì)革蘭氏陰性菌鼠傷寒沙門氏菌無(wú)明顯抑制作用?；衔?和7為首次從木通屬中分離得到，化合物1、4、6和9為首次從該植物中分離獲得。

三葉木通；藤莖；三萜；抗菌活性

三葉木通()為木通科(Ladizaba- lacene)木通屬多年生落葉木質(zhì)藤本，根、莖、果實(shí)均可入藥，在我國(guó)已有上千年的應(yīng)用歷史，有利尿、通乳、舒筋活絡(luò)之功效，用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛等癥[1]。三葉木通在我國(guó)主產(chǎn)于貴州、重慶、湖北、湖南西部、陜西南部、甘肅東南部至長(zhǎng)江流域各省區(qū)，生于山谷疏林或丘陵灌叢中，在日本也有零星分布。三葉木通干燥藤莖是我國(guó)傳統(tǒng)重要的中藥材，被《中國(guó)藥典》等收錄，具有利尿通淋、清心除煩、通經(jīng)下乳的功效，用于治療淋證、水腫、心煩尿赤、口舌生瘡、經(jīng)閉乳少、濕熱痹痛等癥[2]。

迄今為止，已從三葉木通的愈傷組織、莖和果皮中分離報(bào)道了約80余種化學(xué)成分，其中有近70種為三萜或三萜皂苷類化合物[3-9]，顯示三萜類成分為三葉木通重要的功效成分。另外，有研究表明三葉木通中含有苯丙素和咖啡酰奎尼酸類成分[10-11]。為深入研究三葉木通藤莖中的化學(xué)成分組成，進(jìn)一步闡明三葉木通三萜類化學(xué)成分，為深入開發(fā)利用奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究從三葉木通藤莖的乙醇提取物中分離得到9個(gè)三萜化學(xué)成分，分別鑒定為stachlic acid A (1)，齊墩果酸(2)、烏蘇酸(3)、2,3-dihy- droxyolean-13(18)-en-28-oic acid (4)、serratagenic acid (5)、gypsogenic acid (6)、20-hydroxyl-29-norolea- nolic acid (7)、mesembryanthemoidigenic acid (8)和12-hydroxy--lactone (9)，其中，化合物3和7為首次從木通屬植物中分離獲得，化合物1、4、6和9為首次從三葉木通藤莖中分離得到。采用刃天青顯色法進(jìn)行抗菌活性分析，結(jié)果表明，化合物2和3對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌()、蠟樣芽孢桿菌()和枯草芽胞桿菌()具有顯著的抗菌活性，但對(duì)革蘭氏陰性菌鼠傷寒沙門氏菌()無(wú)明顯抑制作用。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

LC-20AT型高效液相色譜儀(日本島津公司), 中壓反相柱層析HPLC半制備系統(tǒng)(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)，超導(dǎo)核磁共振儀(Bruker DRX-400、Bruker Advance-600，瑞士Bruker公司)，N-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化EYELA公司)，粉碎儀(RT- 04，屹立工具有限公司)；電噴霧質(zhì)譜(MDS SCIEX API，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

柱層析色譜正相硅膠(80～100、100～200和200～300目, 青島海洋化工廠); 薄層色譜正相硅膠板

HFGF254(山東煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司)、GF254(青島海洋化工廠)；YMC ODS-A (50m，日本YMC公司)；Sephadex LH-20(瑞典Amersham Biosciences公司)；氘代試劑(CDCl3、CD3OD、DMSO-6，Sigma公司)；實(shí)驗(yàn)中所用分析純?cè)噭┦兔?、乙酸乙酯、甲醇、氯?天津市富宇試劑公司)，色譜級(jí)甲醇、乙腈(默克股份兩合公司)。紫外熒光(254 nm)、碘蒸氣以及噴灑硫酸-乙醇溶液(20∶80，/)加熱顯色。

1.2 材料

實(shí)驗(yàn)用三葉木通藤莖材料于2009年9月采自湖南省桑植縣，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院華南植物園羅世孝研究員鑒定為木通科木通屬三葉木通()，標(biāo)本存放于中國(guó)科學(xué)院華南植物園生物有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室(No.20090921)。

供測(cè)試篩選的細(xì)菌菌株來(lái)自廣東省微生物研究所，包括革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌(, CMCC26003)、蠟樣芽孢桿菌(, CMCC63302)、枯草芽胞桿菌(,CMCC63501)和革蘭氏陰性菌鼠傷寒沙門氏菌(,CMCC51252)。

1.3 提取和分離

三葉木通藤莖干品2.0 kg粉碎，經(jīng)95%乙醇浸泡室溫提取3×24 h，合并提取液；減壓濃縮后加水成混懸液再萃取濃縮，得石油醚萃取部(16.6 g)和乙酸乙酯萃取部(67.8 g)。石油醚萃取部經(jīng)正相硅膠柱層析(200～300目)，以石油醚-丙酮(100∶1→0∶1,/, 下同)梯度洗脫，檢測(cè)合并主點(diǎn)相同的流分, 得到E1～E9共9個(gè)組分。組分E3經(jīng)正相硅膠柱層析(200～ 300目), 以石油醚-丙酮(100∶1→0∶1)梯度洗脫, 檢測(cè)合并主點(diǎn)相同的流分，得到E3-1～E3-4共4個(gè)組分。E3-3為石油醚-丙酮2∶1洗脫得到的組分，經(jīng)Sepha- dex LH-20柱層析(流動(dòng)相為丙酮)，得到亞組分E3-3-1～ E3-3-7，E3-3-6繼續(xù)經(jīng)Sephadex LH-20柱層析(流動(dòng)相為氯仿-甲醇=1∶4)，得到化合物9 (2 mg) (圖1)。E4經(jīng)MCI柱脫色，甲醇洗脫物再經(jīng)正相硅膠柱層析(200～300目)，以石油醚-丙酮(100∶0→10∶1→8∶1→6∶1→4∶1→2∶1→0∶100)梯度洗脫，TLC薄層檢測(cè)合并主點(diǎn)相同的流分，得到E4-1～E4-7共7個(gè)組分。E4-5經(jīng)正相硅膠層析柱(200～300目)分離純化,以石油醚-丙酮(10∶1→8∶1→6∶1→0∶100)為流動(dòng)相梯度洗脫，根據(jù)薄層板檢測(cè)，收集洗脫液得到5個(gè)組分E4-5-1～E4-5-5。E4-5-5經(jīng)Sephadex LH-20柱(acetone)分離純化，再經(jīng)反相中壓柱層析以甲醇-水=70∶30→85∶15 (0～60 min), 85∶15→100∶0 (61～220 min)為流動(dòng)相梯度洗脫, 流速為10 mL/min, 根據(jù)薄層板檢測(cè)，收集含主點(diǎn)的洗脫液組分，再經(jīng)Sephadex LH-20柱(氯仿∶甲醇=1∶4)純化，得到化合物2 (3.5 mg)和3 (4.6 mg)。E6經(jīng)正相硅膠層析柱(200～300目)分離，以氯仿-甲醇= 100∶0、100∶1、100∶3、20∶1、10∶1、0∶100為流動(dòng)相梯度洗脫，根據(jù)薄層板檢測(cè)，收集洗脫液，得到6個(gè)組份E6-1～ E6-6；E6-6經(jīng)反相中壓柱層析以甲醇-水=60∶40→ 75∶25 (0～100 min), 75∶25→90∶10 (100～250 min), 90∶10→100∶0 (250～300 min)為流動(dòng)相梯度洗脫，流速為10 mL/min，根據(jù)薄層板檢測(cè), 收集洗脫液，得到的主點(diǎn)組分再經(jīng)Sepha- dex LH-20柱(流動(dòng)相：丙酮)分離純化，得到化合物4 (3 mg)。E8經(jīng)MCI柱，甲醇洗脫后以石油醚-丙酮(100∶1～0∶100)梯度洗脫，根據(jù)薄層板檢測(cè)，收集洗脫液合并相同主點(diǎn)部分得到8個(gè)流份。流份E8-4再經(jīng)Sephadex LH- 20柱(氯仿-甲醇=1∶4)分離純化, 得到4個(gè)組分。組分E8-4-3繼續(xù)經(jīng)反相(C-18)中壓柱層析以甲醇-水= 50∶50→75∶75 (0～100 min), 75∶25→100∶0 (100～ 400 min)為流動(dòng)相梯度洗脫，流速為10 mL/min，根據(jù)薄層板檢測(cè), 洗脫液合并得到10個(gè)亞組份。組分E8-4-3-3經(jīng)凝膠Sephadex LH-20柱(流動(dòng)相：甲醇)分離純化得到2個(gè)主點(diǎn)組分，主點(diǎn)組分2經(jīng)快速正相硅膠層析柱(200～300目)分離純化，以氯仿-甲醇= 100∶0、99∶1、98∶2、97∶3為流動(dòng)相梯度洗脫，收集氯仿-甲醇=98∶2洗脫部分經(jīng)Sephadex LH-20柱(氯仿-甲醇=1∶4分離純化，得到化合物7 (2 mg)。E8-4-3-5經(jīng)Sephadex LH-20柱(流動(dòng)相：甲醇)分離得到2個(gè)主點(diǎn)組分，主點(diǎn)組分1經(jīng)Sephadex LH-20柱(流動(dòng)相：氯仿-甲醇=1∶4)分離純化，得到化合物8 (2.7 mg)；主點(diǎn)組分2經(jīng)正相硅膠層析柱(200～ 300目)分離純化，以氯仿-甲醇= 100∶0，99∶1，98∶2，97∶3為流動(dòng)相梯度洗脫，收集氯仿-甲醇= 98∶2洗脫部分，再經(jīng)Sephadex LH-20柱(氯仿-甲醇=1∶4)分離純化得到化合物5 (2.1 mg)。乙酸乙酯部分(800.0 g)經(jīng)硅膠柱層析(200～300目)，以氯仿-甲醇(97∶3、90∶10、85∶15、70∶30、60∶40、0∶100)梯度洗脫，經(jīng)TLC薄層層析檢測(cè)合并主點(diǎn)相同的流分，得到F1～F10共10個(gè)組分。F5經(jīng)正相硅膠層析柱(200～300目)分離純化，以氯仿-甲醇(98∶2、95∶5、9∶1, 0∶100)梯度洗脫，TLC薄層檢測(cè)合并主點(diǎn)相同的流分，得到7個(gè)組分。F5-5經(jīng)反相中壓柱層析分離, 甲醇-水(50∶50、60∶40、70∶30、80∶20、90∶10、100∶0)為流動(dòng)相梯度洗脫, 收集70%甲醇-水洗脫流份, 經(jīng)Sephadex LH-20柱(氯仿-甲醇=1∶4)純化，得到化合物6 (2.2 mg)。F7經(jīng)反相中壓柱層析分離，甲醇-水為流動(dòng)相梯度洗脫(20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、55∶45、60∶40、65∶35、70∶30、75∶25、80∶20、85∶15、90∶10、100∶0)，根據(jù)薄層板檢測(cè), 洗脫液合并得到組分F7-1～ F7-7。F7-7再經(jīng)Sephadex LH-20柱(甲醇)分離純化，得到化合物1 (6.6 mg)。

圖1 化合物1～9的結(jié)構(gòu)

1.4 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 白色無(wú)定形粉末，ESI-MS:527 [M + Na]+, 503 [M - H]-, 分子量為504。分子式為C30H48O6。1H NMR (600 MHz, C5D5N):5.49 (1H, m, H-12), 1.21 (3H, s, H-30), 1.20 (3H, s, H-27), 1.06 (3H×3, s, H-24, H-25, H-26);13C NMR (150 MHz, C5D5N):47.5 (CH2, C-1), 68.7 (CH, C-2), 78.0 (CH, C-3), 43.4 (C, C-4), 47.8 (CH, C-5), 18.3(CH2, C-6), 32.7 (CH2, C-7), 39.6 (C, C-8), 48.0 (CH, C-9), 38.2 (C, C-10), 23.6 (CH2, C-11), 122.3 (CH, C-12), 144.8(C, C-13), 42.0 (C, C-14), 28.1 (CH2, C-15), 23.8 (CH2, C-16), 46.9 (C, C-17), 41.2 (CH, C-18), 41.1 (CH2, C-19), 36.4 (C, C-20), 28.9 (CH2, C-21), 32.5 (CH2, C-22), 66.3 (CH3, C-23), 14.1 (CH3, C-24), 17.2 (CH3, C-25), 17.3 (CH3, C-26), 26.0 (CH3, C-27), 180.1 (C, C-28), 73.6 (CH2, C-29), 19.5 (CH3, C-30)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致，故確定該化合物為stachlic acid A。

化合物2 白色無(wú)定形粉末；ESI-MS: 479 [M + Na]+, 455 [M ? H]?, 分子式為C30H48O3;1H NMR (600 MHz, C5D5N):5.50 (1H, t,= 3.0 Hz, H-12), 3.31 (1H, dd,= 13.9, 4 .2 Hz, H-18), 3.43 (1H, m, H-3), 1.29 (3H, s), 1.24 (3H, s), 1.01 (3H, s), 1.02 (3H, s), 1.00 (3H, s), 0.95 (3H, s), 0.91 (3H, s);13C NMR (150 MHz, C5D5N):38.9 (CH2, C-1), 28.2 (CH2, C-2), 78.1 (CH, C-3), 39.3 (C, C-4), 55.9 (CH, C-5), 18.8 (CH2, C-6), 33.1 (CH2, C-7), 39.8 (C, C-8), 47.9 (CH, C-9), 37.3 (C, C-10), 23.7 (CH2, C-11), 122.3 (CH, C-12), 144.6 (C, C-13), 42.1 (C, C-14), 28.2 (CH2, C-15), 23.7 (CH2, C-16), 46.6 (C, C-17), 41.9 (CH, C-18), 46.5 (CH2, C-19), 30.9 (C, C-20), 34.2 (CH2, C-21), 33.2 (CH2, C-22), 28.7 (CH3, C-23), 16.4 (CH3, C-24), 15.4 (CH3, C-25), 17.4 (CH3, C-26), 26.1 (CH3, C-27), 180.0 (C, C-28), 33.2 (CH3, C-29), 23.6 (CH3, C-30)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，故確定該化合物為齊墩果酸。

化合物3 白色粉末；ESI-MS: 479 [M + Na]+, 455 [M ? H]?, 分子式為C30H48O3;1H NMR (600 MHz, C5D5N):1.24 (3H, s), 1.23 (3H, s), 1.06 (3H, s), 1.03 (3H, d,= 5.5 Hz), 1.01 (3H, s), 0.96 (3H, d,= 6.3 Hz), 0.89 (3H, s), 2.64(1H, d,= 11.4 Hz, H-18), 3.46(1H, m, H-3), 5.48(1H, t,= 3.0 Hz, H-12);13C NMR (150 MHz, C5D5N):39.1 (CH2, C-1), 28.0 (CH2, C-2), 78.1 (CH, C-3), 39.2 (C, C-4), 55.9 (CH, C-5), 18.8 (CH2, C-6), 33.6 (CH2, C-7), 39.9 (C, C-8), 47.9 (CH, C-9), 37.4 (C, C-10), 23.6 (CH2, C-11), 125.6 (CH, C-12), 139.3 (C, C-13), 42.5 (C, C-14), 28.6 (CH2, C-15), 24.8 (CH2, C-16), 48.1 (C, C-17), 53.5 (CH, C-18), 39.5 (CH, C-19), 39.3 (CH, C-20), 31.0 (CH2, C-21), 37.3 (CH2, C-22), 28.7 (CH3, C-23), 16.4 (CH3, C-24), 15.7 (CH3, C-25), 17.3 (CH3, C-26), 23.6 (CH3, C-27), 179.9 (C, C-28), 21.4 (CH3, C-29), 17.4 (CH3, C-30)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，故確定該化合物為烏蘇酸。

化合物4 白色無(wú)定形粉末；ESI-MS: 495[M + Na]+, 471[M ? H]-, 943[2M ? H]-, 967[2M +Na]+, 分子式為C30H48O4;1H NMR (600 MHz, C5D5N):1.30 (3H, s, H-23), 1.25 (3H, s, H-27), 1.17 (3H, s, H-26), 1.09 (3H, s, H-24), 1.01 (3H, s, H-25), 0.97 (3H,s, H-29), 0.86 (3H, s, H-30);13C NMR (150 MHz, C5D5N):48.0 (CH2, C-1), 68.7 (CH, C-2), 83.7 (CH, C-3), 39.7(C, C-4), 55.9 (CH, C-5), 19.7 (CH2, C-6), 35.3 (CH2, C-7), 42.6 (C, C-8), 51.1 (CH, C-9), 38.7 (C, C- 10), 22.1 (CH2, C-11), 25.4 (CH2, C-12), 137.7 (C, C- 13), 44.7 (C, C-14), 27.6 (CH2, C-15), 33.5 (CH2, C- 16), 48.7 (C, C-17), 129.2 (C, C-18), 41.4 (CH2, C-19), 32.8 (C, C-20), 37.3 (CH2, C-21), 36.4 (CH2, C-22), 29.2 (CH3, C-23), 17.5 (CH3, C-24), 17.8 (CH3, C-25), 18.1 (CH3, C-26), 21.1 (CH3, C-27), 178.9 (C, C-28), 32.2 (C, C-29), 24.3 (CH3, C-30)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致, 故確定該化合物為2,3-di- hydroxyolean-13(18)-en-28-oic acid。

化合物5 白色無(wú)定形粉末；ESI-MS: 509 [M + Na]+, 485 [M ? H]-, 分子式為C30H46O5;1H NMR (600 MHz, CD3OD):5.29 (1H, m, H-12), 3.16 (1H, m), 1.25 (3H, s), 1.17 (3H, s), 1.16 (3H, s), 0.98 (3H, s), 0.95 (3H, s), 0.82 (3H, s), 0.78 (3H, s);13C NMR (150 MHz, CD3OD):38.1 (CH2, C-1), 27.8 (CH2, C-2), 79.7 (CH, C-3), 39.8 (C, C-4), 56.7 (CH, C-5), 19.5 (CH2, C-6), 32.7 (CH2, C-7), 39.8 (C, C-8), 47.4 (CH, C-9), 38.1 (C, C-10), 24.1 (CH2, C-11), 124.4 (CH, C-12), 144.5 (C, C-13), 41.6 (C, C-14), 28.7 (CH2, C-15), 24.5 (CH2, C-16), 46.8 (C, C-17), 41.2 (CH, C-18), 40.5 (CH2, C-19), 42.8 (C, C-20), 29.5 (CH2, C-21), 34.0 (CH2, C-22), 28.7 (CH3, C-23), 16.3 (CH3, C-24), 15.9 (CH3, C-25), 17.7 (CH3, C-26), 26.3 (CH3, C-27), 181.3 (C, C-28), 181.9 (C, C-29), 19.7 (CH3, C-30)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，故確定該化合物為serratagenic acid。

化合物6 白色無(wú)定形粉末；ESI-MS: 509 [M + Na]+, 485 [M ? H]?, 分子式為C30H46O5;1H NMR (600 MHz, C5D5N):5.49 (1H, m, H-12), 3.42 (1H, m), 1.44 (3H, s), 1.29 (3H, s), 1.04 (3H, s), 1.02 (3H, s), 0.95 (3H, s), 1.01 (3H, s), 0.96 (3H, s);13C NMR (150 MHz, C5D5N):37.6 (CH2, C-1), 26.2 (CH2, C-2), 74.0 (CH, C-3), 53.0 (C, C-4), 50.5 (CH, C-5), 20.2 (CH2, C-6), 31.6 (CH2, C-7), 38.6 (C, C-8), 46.0 (CH, C-9), 35.3 (C, C-10), 22.3 (CH2, C-11), 122.4 (CH, C-12), 143.3 (C, C-13), 40.7 (C, C-14), 26.8 (CH2, C-15), 22.2 (CH2, C-16), 45.1 (C, C-17), 40.5 (CH, C-18), 45.0 (CH2, C-19), 29.5 (C, C-20), 32.7 (CH2, C-21), 31.5 (CH2, C-22), 179.5 (C, C-23), 10.7 (CH3, C-24), 14.5 (CH3, C-25), 15.9 (CH3, C-26), 24.7 (CH3, C-27), 178.7 (C, C-28), 31.8 (CH3, C-29), 22.3 (CH3, C-30)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道基本一致，故確定該化合物為gypsogenic acid。

化合物7 白色粉末；ESI-MS: 481 [M + Na]+, 457 [M ? H]-, 分子式為C29H46O4；1H NMR (600 MHz, C5D5N):5.57 (1H, br.s), 3.37 (1H, dd,= 14.0, 3.8 Hz), 1.59 (3H, s),1.27 (3H, s), 1.25 (3H, s), 1.04 (3H, s), 1.03 (3H, s), 0.90 (3H, s);13C NMR (150 MHz, C5D5N):38.8 (CH2, C-1), 28.7 (CH2, C-2), 78.0 (CH, C-3), 39.6 (C, C-4), 55.7 (CH, C-5), 18.7 (CH2, C-6), 33.2 (CH3, C-7), 39.3 (C, C-8), 48.0 (CH, C-9), 37.2 (C, C-10), 23.6 (CH2, C-11), 122.6 (CH, C-12), 144.2 (C, C-13), 42.0 (C, C-14), 28.2 (CH2, C-15), 23.7 (CH2, C-16), 46.6 (C, C-17), 48.0 (CH, C-18), 49.6 (CH2, C-19), 69.8 (C, C-20), 36.1 (CH2, C-21), 35.0 (CH2, C-22), 28.0 (CH3, C-23), 16.4 (CH3, C-24), 15.4 (CH3, C-25), 17.3 (CH3, C-26), 25.9 (CH3, C-27), 179.9 (C, C-28), 25.5 (CH3, C-29)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，故確定該化合物為20-hydroxyl-29-noroleanolic acid。

化合物8 白色無(wú)定形粉末；ESI-MS: 495 [M + Na]+, 471 [M ? H]?, 分子式為C30H48O4;1H NMR (600 MHz, CD3OD):5.25 (1H, m, H-12), 0.77 (3H, s), 0.81 (3H, s), 0.92 (3H, s), 0.94 (3H, s), 0.96 (3H, s), 1.17 (3H, s);13C NMR (150 MHz, CD3OD):38.2 (CH2, C-1), 27.9 (CH2, C-2), 79.7 (CH, C-3), 39.8 (C, C-4), 56.7 (CH, C-5), 19.5 (CH2, C-6), 34.0 (CH2, C-7), 39.8 (C, C-8), 49.0 (CH, C-9), 36.9 (C, C-10), 24.0 (CH2, C-11), 123.7 (CH, C-12), 145.2 (C, C-13), 41.9 (C, C-14), 28.7 (CH2, C-15), 24.5 (CH2, C-16), 47.9 (C, C-17), 41.4 (CH, C-18), 40.6 (CH2, C-19), 36.8 (C, C-20), 29.3 (CH2, C-21), 33.1 (CH3, C-22), 28.8 (CH2, C-23), 16.3 (CH3, C-24), 15.9 (CH3, C-25), 17.7 (CH3, C-26), 26.4 (CH3, C-27), 181.7 (C, C-28), 74.4 (CH2, C-29), 19.5 (CH3, C-30)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致，故確定該化合物為mesembryanthemoidigenic acid。

化合物9 白色無(wú)定形粉末；ESI-MS/: 537 [M + Na]+, 513 [M ? H]?, 分子式為C32H50O5;1H NMR (600 MHz, CDCl3):0.86 (3H, s, H-25), 0.88 (3H, s, H-23), 0.91 (3H, s,H-30), 0.91 (3H, s, H-24), 0.99 (3H, s, H-29), 1.15 (3H, s, H-26), 1.31 (3H, s,H-27), 2.06(3H, s, CH3COO), 3.89 (1H, m, H-12), 4.50 (1H, dd,= 11.5, 5.5 Hz, H-3);13C NMR (150 MHz, CDCl3):38.8 (CH2, C-1), 23.8 (CH2, C-2), 81.0 (CH, C-3), 38.1 (C, C-4), 55.5 (CH,C-5), 17.9 (CH2, C-6), 34.2 (CH2, C-7), 42.6 (C, C-8), 44.7 (CH, C-9), 36.6 (C, C-10), 29.1 (CH2, C-11), 76.3 (CH, C-12), 90.8 (C, C-13), 42.3 (C, C-14), 28.2 (CH2, C-15), 21.5 (CH2, C-16), 44.9 (C, C-17), 51.4 (CH, C-18), 39.6 (CH2, C-19), 31.8 (C, C-20), 34.4 (CH2, C-21), 28.3 (CH2, C-22), 27.7 (CH2, C-23), 16.7 (CH3, C-24), 16.6 (CH3, C-25), 18.8 (CH3, C-26), 18.8 (CH3, C-27), 180.1 (C, C-28), 33.5 (CH3, C-29), 24.1 (CH3, C-30), 171.2 (C, C-1′), 21.4 (CH3, C-2′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道基本一致，故確定該化合物為12-hydroxy--lactone。

1.5 抗菌活性

采用刃天青顯色法[18]分析化合物1～9的抗菌活性，每處理重復(fù)3次，以硫酸卡那霉素作為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定化合物的最低抑菌濃度(MIC)。先將100L 100g/mL的指示劑溶液(刃天青)放置到無(wú)菌的96孔板上的第11列板孔，約7.5 mL的指示劑溶液與5 mL的待測(cè)菌溶液(106CFU/mL)混合，接著轉(zhuǎn)移100L到第1至第10列以及第12列所有測(cè)試孔中，待測(cè)樣品(0.8 mg/mL)溶液(100L)加入到第1列板孔中，再?gòu)牡?列取出100L的溶液轉(zhuǎn)移到第2列，用同樣的方法(倍增稀釋)轉(zhuǎn)移到第3～10列，再?gòu)牡?0列取出100L以保證每列孔中的溶液均為100L。最后，將加好樣品的孔板放入到恒溫培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)5～6 h，直到孔板的溶液變成粉紅色。若顏色無(wú)變化仍為藍(lán)色表示有活性，顏色從藍(lán)色變?yōu)榉奂t色，表示無(wú)抑菌活性；顏色變化的最低稀釋濃度則是待測(cè)化合物的最低抑菌濃度(MIC)。1個(gè)96孔板可同時(shí)測(cè)定6個(gè)樣品、1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和1個(gè)陰性對(duì)照。供測(cè)試篩選的細(xì)菌菌株包括革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌(CMCC26003)、蠟樣芽孢桿菌(CMCC63302)、枯草芽胞桿菌(CMCC63501)和革蘭氏陰性菌鼠傷寒沙門氏菌(CMCC51252)。

結(jié)果表明(表1)，化合物2和3具有與陽(yáng)性對(duì)照硫酸卡那霉素接近或相當(dāng)?shù)捏w外抑制3種革蘭氏陽(yáng)性菌的活性，化合物4僅有較弱的抑菌活性(MIC≥ 25g/mL)，而其他化合物則無(wú)明顯的抗菌活性(MIC>100g/mL)。

表1 化合物1～9對(duì)4種細(xì)菌的最小抑菌濃度(MIC, μg/mL)

2 結(jié)果和討論

本研究對(duì)三葉木通藤莖的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)分析，從其乙醇提取物中分離得到9個(gè)三萜類化合物，經(jīng)波譜數(shù)據(jù)分析和文獻(xiàn)比對(duì)，分別鑒定為: stachlic acid A (1)，齊墩果酸 (2)，烏蘇酸 (3)，2,3- dihydroxyolean-13(18)-en-28-oic acid (4)，serratagenic acid (5)，gypsogenic acid (6)，20-hydroxyl-29-norolea- nolic acid (7)，mesembryanthemoidigenic acid (8)和12- hydroxy--lactone (9)?；衔?和7為首次從木通屬中分離得到，化合物1、4、6和9為首次從三葉木通中分離獲得。

抗菌活性測(cè)試結(jié)果表明，化合物2和3對(duì)3種革蘭氏陽(yáng)性菌，即金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌和枯草芽胞桿菌，都有顯著的抑制作用，最低抑菌濃度(MIC)為3.125～6.25g/mL，與陽(yáng)性對(duì)照硫酸卡那霉素接近或相當(dāng)，化合物4對(duì)蠟樣芽孢桿菌有弱的抗菌活性(MIC=25.0g/mL)。所有化合物對(duì)革蘭氏陰性菌鼠傷寒沙門氏菌菌株均無(wú)顯著抑制作用。這表明化合物2和3是三葉木通藤莖中具有強(qiáng)抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的三萜化合物，對(duì)于促進(jìn)三葉木通植物的綜合開發(fā)利用具有積極意義，可望具有潛在重要的價(jià)值用途。

三葉木通具有較強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)能力，不僅在我國(guó)有廣闊的自然地域分布，并且還呈現(xiàn)出了豐富的品系形態(tài)多樣性和地域差異性特征[19]。目前雖然已從三葉木通植物中分離出幾十個(gè)化學(xué)成分[20]，但具體研究的還僅僅是少數(shù)品系，未來(lái)有必要推進(jìn)針對(duì)三葉木通不同地域具有差異性特征品系在成分和功能層面的比較分析研究。

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Triterpenes from Stems ofand Their Antibacterial Activities

JIA Yongxia1, YANG Qiuxia1, ZENG Lei2, XU Qiaolin2*, LIU Shaobo3, XU Xinlan1, TAN Jianwen3

(1.South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China; 2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Silviculture, Protection and Utilization, Guangdong Academy of Forestry, Guangzhou 510520, China; 3.College of Forestry and Landscape Architecture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

To study triterpenes fromand its antibacterial activities, nine triterpenes were isolated from the ethanol extract by various methods, such as silica gel, ODS, Sephadex LH-20 column chromatography and semi-preparative HPLC.Based on physical and chemical properties and spectral data, their structures were identified as stachlic acid A (1), oleanolic acid (2), ursolic acid (3), 2,3-dihydroxyolean-13(18)-en-28-oic acid (4), serratagenic acid (5), gypsogenic acid (6), 20-hydroxyl-29-noroleanolic acid (7), mesembryanthemoidigenic acid (8) and 12-hydroxy--lactone (9).The compounds 2 and 3 had strong antibacterial activity against three tested bacterial strains.Compounds 1, 4, 6 and 9 were isolated fromfor the first time,compounds 3 and 7were isolated from genusfor the first time.

; Stem;Triterpenoid; Antibacterial activity

10.11926/jtsb.4489

2021-07-29

2021-10-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31470422, 31500291), 廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2020KJCX013), 廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2019A1515011236)資助

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No.31470422, 31500291), the Project for Forestry Science and Technology Innovation in Guangdong (Grant No.2020KJCX013), and the Project for Natural Science in Guangdong (Grant No.2019A1515011236).

賈永霞，女，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)研究與質(zhì)譜技術(shù)方法開發(fā)。E-mail: jyx@scbg.ac.cn

通信作者Corresponding author.E-mail:qlxu@sinogaf.cn