賴瑞聯(lián), 陳瑾, 馮新, 韋曉霞, 陳義挺, 沈朝貴, 吳如健

橄欖ISSR和RAPD遺傳多樣性分析和核心種質構建

賴瑞聯(lián), 陳瑾, 馮新, 韋曉霞, 陳義挺, 沈朝貴, 吳如健*

(福建省農業(yè)科學院果樹研究所，福州 350013)

為揭示中國橄欖()種質資源的遺傳多樣性，采用ISSR和RAPD標記對橄欖主要分布區(qū)的86份種質資源進行遺傳多樣性分析并構建核心種質。結果表明，基于UPGMA遺傳相似系數(shù)，86份種質資源可分為3個大類；基于STRUCTURE模型聚類，可分為4個類群，這基本符合橄欖的地域性分布規(guī)律。采用ISSR和RAPD獲得的中國橄欖種質資源的整體遺傳多樣性水平分別為0.284±0.169和0.244±0.163，多態(tài)性位點百分率分別為92.56%和100%，總遺傳分化系數(shù)分別為0.127和0.142，基因流分別為3.423和3.025，群體間遺傳相似系數(shù)分別為0.930和0.939，個體間遺傳相似系數(shù)分別為0.736和0.732。因此，中國橄欖種質資源豐富的遺傳多樣性主要來源于個體間的遺傳分化或變異，且這種遺傳多樣性存在明顯的地域性差異。

橄欖；遺傳多樣性；核心種質；ISSR；RAPD

橄欖()又名青果，是國家衛(wèi)健委公布的藥食同源原料。作為《中國藥典》記載的傳統(tǒng)中藥材，橄欖各組織均有良好的藥用價值，其果實味甘澀酸、性平，具有生津、利咽、清肺、解毒等功效；根微苦性平，能夠清咽、祛濕、舒筋；核仁味甘性平，可潤燥、解毒。最近的研究表明，橄欖富含多酚、類黃酮、氨基酸、脂肪酸、維生素C和礦質元素等藥用成分，在抗氧化[1–2]、抗病毒[3]、抗菌消炎[4]以及緩解糖尿病[5]等方面均有很好的藥理活性。通常認為，中國是橄欖種質資源起源和遺傳多樣性中心[6]。作為我國重要的特色中藥資源，開展橄欖種質資源研究對其資源保護和開發(fā)利用具有重要意義。

單重復序列間隔區(qū)(inter-simple sequence repeats,ISSR)和隨機擴增DNA多態(tài)性(random amplified poly- morphic DNA, RAPD)是物種遺傳多樣性研究中常見方法[7–8]。在橄欖種質資源遺傳多樣性研究中, ISSR和RAPD反應體系已建立并進行了改良[9–14]。楊培奎等[15–16]采用ISSR技術認為廣東省粵東地區(qū)和潮汕地區(qū)橄欖遺傳多樣性水平較低，且與來源地和品種名關系不大；劉天亮[17]采用ISSR技術認為橄欖遺傳多樣性與地理環(huán)境存在相關性，且福建省內橄欖品種遺傳多樣性較為豐富；張明賢等[18]采用ISSR技術對福州市主栽橄欖品種和優(yōu)株進行了鑒定。聶珍素[19]采用RAPD技術認為福建省橄欖遺傳分化較大，遺傳背景較復雜。此外，SRAP (sequence- related amplified polymerphism)[19]和AFLP (amplified fragment length polymerphism)[20–21]等技術也在橄欖遺傳多樣性研究中應用。然而，目前橄欖種質資源遺傳多樣性研究多集中在較小地區(qū)范圍內，且受樣本數(shù)量限制，研究結果難以代表整個中國橄欖種質資源遺傳多樣性和親緣關系特征。此外，當前研究方法主要使用單一技術分析橄欖遺傳背景，缺乏彼此之間相互驗證，在一定程度上削弱了研究結果的準確性和可靠度。

核心種質構建一直是物種種質資源研究的熱點[22]。常用的核心種質取樣策略主要包括隨機取樣策略(completely random sampling strategy, R)和系統(tǒng)取樣策略，其中系統(tǒng)取樣策略又包括C (constand strategy)、P (proportional strategy)、L (logarithmic strategy)、S (square root strategy)、G (genetic diversity dependent strategy)和M (maximization strategy)等。Yonezawa等[23]提出遺傳冗余度(degree of genetic redundancy)為0.2～0.9，核心種質的最適取樣比例為20%～30%，同時認為G策略明顯優(yōu)于R、P、L、C策略。在橄欖核心種質構建方面，楊培奎[24]提出, 基于ISSR分析結果，依據(jù)Nei & Li計算遺傳距離和非加權配對法(UPGMA法)聚類，采用G策略按樣本量總數(shù)的25%取樣時能獲得具有較高代表性的橄欖核心種質庫。為進一步揭示中國橄欖種群的遺傳多樣性，本研究基于ISSR和RAPD對主要分布區(qū)和產區(qū)的86份橄欖種質資源進行研究，系統(tǒng)揭示中國橄欖種質資源的遺傳多樣性特征，并初步構建核心種質，以期為橄欖種質資源保存研究和開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗所用的86份橄欖種質資源采自農業(yè)農村部福州橄欖種質資源圃，涵蓋了福建、廣東、廣西、四川和浙江等中國橄欖主要分布區(qū)的種質資源(表1)。

1.2 方法

基因組DNA提取 采集生長健壯、無病蟲害的橄欖當年新抽嫩葉，清水洗凈后用濾紙吸干, 迅速去除葉脈，隨后采用改良CTAB法提取橄欖基因組DNA。采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測橄欖基因組DNA的純度，用超微量紫外光分光光度計測定A260和A280，計算A260/A280和基因組DNA濃度。質量和純度檢測合格后，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴增 采用混樣基因組DNA對26對ISSR引物[17,24]進一步篩選，選取12對擴增效率高、條帶清晰、重復性高、多態(tài)性好的引物進行ISSR-PCR擴增(表2)。ISSR-PCR擴增體系為DreamTaq Green PCR Master Mix (2×) 12.5L，DNA模板50 ng, 引物0.8mol/L，用高壓ddH2O補足至終體積25L。反應程序為95 ℃預變性5 min；然后95 ℃變性30 s,退火45 s，72 ℃延伸2 min，共35次循環(huán)；再72 ℃延伸10 min。從26對RAPD引物[19,25]中選取9對最適引物進行RAPD-PCR擴增(表2), 擴增體系為DreamTaq Green PCR Master Mix (2×) 12.5L, DNA模板50 ng，引物0.8mol/L，用高壓ddH2O補足至終體積25L。反應程序為94 ℃預變性4 min；然后94 ℃變性1 min，退火1.5 min, 72 ℃延伸2 min,共45次循環(huán)；再72 ℃延伸10 min。PCR擴增結束后采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶, 并拍照保存。

表1 橄欖種質資源信息

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計

根據(jù)ISSR和RAPD電泳圖譜，將任意位點條帶記為1，相應位點沒有條帶記為0，構建1、0二元數(shù)據(jù)矩陣。采用Popgene 32分析橄欖的遺傳多樣性指數(shù)，包括觀測等位基因數(shù)(observed number of alleles,)、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles,)、Nei’s基因多樣性參數(shù)(Nei’s genetic diversity,)、Shannon’s信息指數(shù)(Shannon’s information index,)、多態(tài)性位點數(shù)(number of polymorphism loci,)和多態(tài)性位點百分率(percentage of polymorphism loci,)等；采用NTSYS 2.10e分析遺傳相似系數(shù),基于遺傳距離采用UPGMA法制作聚類樹狀圖；參照Evanno等[26]的方法采用STRUCTURE 2.2構建橄欖種質資源模型聚類圖。

表2 試驗所用ISSR和RAPD引物

1.4 核心種質構建

利用ISSR和RAPD電泳圖譜二元矩陣，參照楊培奎等[24]的方法，依據(jù)Nei & Li計算遺傳距離,采用UPGMA法進行聚類。采用G策略確定各亞組的取樣比例，組內取樣利用多次聚類隨機取樣的方法逐步刪減達到總樣本量的25%，若組內只有1份樣本則直接選取構成核心種質。比較分析核心種質和初始種質的遺傳多樣性差異。

2 結果和分析

2.1 遺傳多態(tài)性分析

從圖1和表3可見，12條ISSR引物對86份橄欖種質資源共擴增出242條帶，其中231條多態(tài)性條帶，每條引物擴增20.17條帶和19.25多態(tài)性條帶, 多態(tài)性百分率為95.45%。其中UBC889擴增的多態(tài)性條帶最少，多態(tài)性條帶百分率僅為82.61%,而UBC818、UBC825、UBC826、UBC840、UBC841和UBC855擴增的多態(tài)性百分率均為100%。9條RAPD引物擴增出160條帶，其中156條為多態(tài)性條帶，每條引物擴增17.78條帶和17.33多態(tài)性條帶，多態(tài)性百分率為97.50%。其中S58擴增的多態(tài)性條帶最少，多態(tài)性條帶百分率僅為88.89%，而SBS- A5、SBS-A15、SBS-I1、SBS-Q4和SBS-Q9的多態(tài)性百分率均為100%。這說明中國橄欖種質資源具有較高水平的遺傳多態(tài)性，可能存在較高頻率的遺傳變異。

2.2 聚類分析

采用NTSYS 2.10e構建了86份橄欖種質資源的遺傳進化樹(圖2)?；贗SSR分析，福建南安的‘埔垱1號’ (28)與其他種質資源的親緣關系較遠，其他85份橄欖種質資源主要分為3大類(I-1、I-2、I-3)。I-1包含44份來自福建和3份來自廣東的種質資源，其中I-1中福建福安的‘葡萄’(1)與其他種質資源的遺傳距離較遠，其余46份種質資源又可分為2個亞類(I-1-1和I-1-2)。I-1-1包含23份種質資源，主要來自福建中部或北部的福安、閩侯、閩清等地區(qū)；I-1-2的23份種質資源主要來源于福建省緯度較低的莆田、上杭、永定、云霄、漳浦、詔安，少數(shù)來自廣東的電白和高州等。可見，中國橄欖種質資源親緣關系的地域性差異較為明顯。I-2包含21份種質資源，其中4份來源于福建，分別是‘閩侯自來圓’ (11)、‘上杭三棱欖’ (40)、‘云霄穗橄欖’ (47)和‘長泰野生欖’ (52)；8份來源于廣東的電白、高州、化州、揭西、饒平、信宜，其中還有2份與廣東較近的廣西浦北和大部分的四川種質資源，初步認為廣東、廣西和四川的橄欖種質資源遺傳距離較近；此外，福建的‘上杭三棱欖’可能引種自廣東，這對橄欖同物異名現(xiàn)象起到了一定的校正作用。I-3包含17份種質資源，其中大部分來自浙江瑞安和平陽,還有6份福建、1份廣東、1份廣西和1份四川的種質資源，說明浙江橄欖種群與福建橄欖種群的種質資源存在較多的遺傳交流，其遺傳相似性更高。整體上，基于ISSR的分類結果符合橄欖種質資源的地域性分布，與所屬生態(tài)類型存在較大的相關性，來源于同一地區(qū)或生態(tài)類型區(qū)的種質資源普遍存在較高的遺傳相似性。

圖1 ISSR和RAPD引物的擴增結果。A: 引物UBC855; B: 引物SBS-A5; A和B所用Marker分別為DL5000和DL2000 Marker。

表3 橄欖的ISSR和RAPD擴增結果

圖2 基于ISSR的橄欖聚類分析。1～86見表1。

基于RAPD分析(圖3)，來源于福建福安的‘葡萄’(1)、四川合江的‘合江二梭子’ (74)與其他種質資源的遺傳距離較遠，其余84份種質資源可分為3個大類(II-1、II-2和II-3)。其中II-1和II-2各包含23份種質資源，數(shù)量和樣本與基于ISSR聚類的I-1- 1和I-1-2完全一致。II-3包含38份樣本，涵蓋了基于ISSR聚類的I-2和I-3的絕大部分樣本，僅僅缺失四川合江的‘合江二梭子’ (74)，但增加了福建南安的‘埔垱1號’ (28)。從聚類的結果上看，基于ISSR和RAPD的分類具有極高的相似度，僅僅2份種質資源的歸屬存在差異。進一步分析表明，II-3又可分為3個亞類群(II-3-1、II-3-2和II-3-3)，其中II-3-1包含了I-3中的全部樣本，此外還增加了福建南安的‘埔垱1號’ (28)和福建上杭的‘小目欖’ (40); II-3-2包含了I-2的21份樣本中的15份，僅僅缺失福建閩清的‘甜欖35號’ (24)、福建上杭的‘上杭小目欖’ (40)、福建長泰的‘野生欖’ (52)、廣東電白的‘馬路香欖’ (58)、四川合江的‘合江二梭子’ (74)和浙江瑞安的‘瑞安5號’ (83)；此外，II-3-3特異性從I-2分離出2份種質資源，分別為福建閩清的‘甜欖35號’ (24)和浙江瑞安的‘瑞安5號’ (83)?？梢姡贗SSR和RAPD的聚類結果僅‘葡萄’(1)、‘埔垱1號’ (28)和‘合江二梭子’ (74)的歸屬在大分類上存在較大差異，整體相似度達到96.51%，二者分類結果得到了相互驗證，具有較高的準確性和可靠性。

假設86份橄欖種質資源群體數(shù)為2～12，重復計算7次，結果表明，基于ISSR和RAPD獲得的對數(shù)似然函數(shù)值隨群體數(shù)的增加呈先上升后趨于平緩，并未出現(xiàn)明顯的拐點(圖4: A-1, B-1)。對K變化趨勢的分析表明，值取4時，ISSR和RAPD試驗獲得的K值均達到峰值，分別為404.58和403.43 (圖4: A-2, B-2)。因此，基于ISSR和RAPD均將86份橄欖種質資源分為4個類群。

從各樣本歸屬相應群體的概率(值)上看，基于ISSR的橄欖種質資源后驗概率為0.547～0.996, 其中福建‘閩侯大粒黃’ (17)的分布概率值最低，僅為0.547，而福建詔安的‘新營2號’ (54)、廣東饒平的‘新塘1號’ (66)、廣西浦北的‘豬欖3號’ (70)和浙江平陽的‘平陽6號’ (77)分布概率均達到0.996。此外，57份樣本的分布概率均在0.9以上，占總體樣本的66.28%，說明本研究的聚類結果可信度較高。4個類群分布標注為i-1、i-2、i-3和i-4 (圖5: A)，i-1包含24份種質資源均來源于福建，所歸屬樣本也與基于ISSR的NTSYS聚類結果I-1-1一致；i-2中的18份樣本的組成成分較為復雜，其中7份來源于福建，8份來源于浙江，廣東、廣西和四川各1份，與I-3的樣本基本一致；i-3中共有23份樣本，其中20份來源于福建，3份來源于廣東，與I-1-2的結果一致；i-4包含的橄欖樣本中，4份來源于福建、8份來源于廣東、2份來源于廣西、5份來源于四川和2份來源于浙江，與I-1的結果一致。基于RAPD的橄欖種質資源后驗概率為0.336～ 0.995，其中福建閩侯的‘上灣檀香’ (8)、福建南安的‘埔垱2號’ (30)和浙江瑞安的‘瑞安3號’ (84)的概率值較低, 分別為0.342、0.397和0.336。從聚類的結果來看, 基于STRUCTURE的橄欖種質資源RAPD聚類與NTSYS聚類幾乎一致(圖5: B)，從而進一步驗證了上述結果的準確性。

圖4 ISSR (A)和RAPD (B)聚類對數(shù)似然函數(shù)值隨K變化趨勢及△K隨K變化趨勢

2.3 遺傳多樣性分析

UPGMA聚類和STRUCTURE聚類結果比較一致，采用Popgene 32對不同聚類群體間的遺傳多樣性指數(shù)進行分析(表4), 基于ISSR聚類的3個群體的觀測等位基因、有效等位基因、Nei’s基因多樣性指數(shù)、香農信息指數(shù)、多態(tài)性位點數(shù)和多態(tài)性位點百分率依次是I-1>I-2>I-3，但群體間的差異不大,尤其是Nei’s基因多樣性指數(shù)的差異非常小，從整體上看, 基于ISSR不同聚類群體的遺傳多樣性水平較為一致?；赗APD聚類的3個群體中，觀測等位基因、多態(tài)性位點數(shù)和多態(tài)性位點百分率依次是II-3>II-2>II-1，與有效等位基因和香農信息指數(shù)的變化趨勢不一致，而Nei’s基因多樣性指數(shù)依次是II-1>II-2>II-3，說明基于RAPD聚類的橄欖群體間存在遺傳多樣性差異。

2.4 遺傳分化與遺傳距離分析

從表5可見，基于ISSR分析，中國橄欖種質資源的總遺傳分化系數(shù)(G)為0.127，即87.3%的遺傳分化存在于群體內，12.7%的遺傳分化來源于群體間，說明群體內存在豐富的遺傳分化或遺傳變異。中國橄欖的基因流(N)為3.423，遠遠大于1.0，說明聚類獲得的不同群體間存在豐富的基因交流, 可能與不同地區(qū)頻繁的種質交流有關。群體內部個體間的遺傳多樣性(H)為0.244，總遺傳多樣性(H)為0.279，兩者之間的差異較小，說明橄欖遺傳多樣性主要來源于群體內個體間，但群體間也存在一定水平的遺傳多樣性。與ISSR相比，基于RAPD聚類結果的總遺傳分化系數(shù)較大，而H、H和N均小于ISSR。

圖5 基于STRUCTURE 2.2的橄欖ISSR (A)和RAPD (B)聚類。1～86見表1。

表4 橄欖群體的遺傳多樣性

: 觀測等位基因數(shù);: 有效等位基因數(shù);: Nei基因多樣性指數(shù);: Shannon’s信息指數(shù);: 多態(tài)性位點數(shù);:多態(tài)性位點百分率。

: Observed number of alleles;: Effective number of alleles;: Nei’s genetic diversity index;: Shannon’s information index;: Number of polymorphism loci;: Percentage of polymorphism loci.

表5 橄欖群體的遺傳分化系數(shù)

從橄欖群體間的遺傳距離和遺傳相似性來看,基于ISSR或RAPD的不同類群間遺傳相似性較高,遺傳距離較近，群體間的平均遺傳相似系數(shù)分別為0.930和0.939，說明整體上中國橄欖種質資源群體間的遺傳相似性較高。基于ISSR，86份橄欖種質資源的平均遺傳相似系數(shù)為0.736，遺傳相似性最高的是福建的‘詔安新營2號’和‘詔安材欖’，為0.897，而遺傳相似性最弱的是福建的‘上灣檀香’和四川的‘合江三白元’，僅為0.591?；赗APD，86份橄欖種質資源的平均遺傳相似系數(shù)為0.732，遺傳相似性最高的是浙江的‘平陽2號’和‘瑞安1號’, 為0.919，而遺傳相似性最弱的是福建的‘葡萄’和‘小個子’，僅為0.50。可見，中國橄欖種質資源的遺傳多樣性與分布地域存在一定的相關性，同一地區(qū)或生態(tài)類型區(qū)的橄欖種質資源具有較高的遺傳相似性。從整體上看，其遺傳多樣性可能主要來源于個體間的差異。

2.5 核心種質構建

采用G策略按25%取樣構建86份橄欖種質資源的核心種質，核心種質在ISSR的3個群體間的取樣量較為一致，RAPD中II-1和Ⅱ-2的取樣量也基本相同，但II-3的取樣量較少。依據(jù)Nei & Li計算遺傳距離并多次UPGMA聚類獲得基于ISSR構建的核心種質包括‘葡萄’、‘大目埕橄欖王’、‘上灣檀香’、‘清欖1號’、‘閩清2號’、‘福欖1號’、‘南安埔垱1號’、‘南靖南高3號’、‘三都島4號’、‘上杭三棱欖’、‘漳浦18號’、‘漳浦7號’、‘長泰野生欖’、‘鳳湖欖’、‘新塘1號’、‘豬欖2號’、‘合江二百圓’、‘合江大梭子’、‘合江丁香鼓’、‘瑞安2號’、‘瑞安5號’、‘瑞安3號’，其中福建13份，廣東2份，廣西1份，四川3份，浙江3份。這些樣本保留了初始種質25.58%的樣本量，核心種質的多態(tài)性位點保留率達到了94.20%，而觀測等位基因、有效等位基因、Nei’s基因多樣性指數(shù)、香農信息指數(shù)的保留率分別為97.29%、101.76%、103.52%和102.31% (表6)。此外，保留種質除樣本數(shù)量多于核心種質，其余多樣性指標均小于核心種質或與核心種質接近, 說明基于ISSR構建的中國橄欖核心種質基本保存了初始種質的絕大部分基因資源。

基于RAPD構建的橄欖核心種質包括‘葡萄’、‘四季橄欖3號’、‘大目埕橄欖王’、‘上灣檀香’、‘黃皮長營26號’、‘大粒黃’、‘檀頭’、‘梅溪鎮(zhèn)建新2號’、‘福欖1號’、‘池2號’、‘延平劍洲’、‘上杭三棱欖’、‘永定務田3號’、‘西濱劉坂3號’、‘云霄白欖’、‘漳浦18號’、‘漳浦7號’、‘電白二頭尖欖’、‘四和1號’、‘鳳湖欖’、‘合江二梭子’、‘瑞安2號’和‘瑞安5號’，其中福建17份、廣東3份、四川1份、浙江2份。核心種質保留了初始種質的26.74%樣本量，其多態(tài)性位點保留率為89.38%，觀測等位基因、有效等位基因、Nei’s基因多樣性指數(shù)和香農信息指數(shù)的保留率分別為94.70%、101.02%、101.24%和99.74%, 保留種質和核心種質的多樣性指數(shù)并無明顯差異但樣本數(shù)量遠遠多于核心種質(表6)。值得注意的是，基于ISSR和RAPD構建的核心種質均保留了‘葡萄’、‘大目埕橄欖王’、‘上灣檀香’、‘福欖1號’、‘上杭三棱欖’、‘漳浦18號’、‘漳浦7號’、‘鳳湖欖’、‘瑞安2號’和‘瑞安5號’，說明這些種質資源具有重要保存價值。

表6 橄欖核心種質和初始種質遺傳多樣性比較

: 觀測等位基因數(shù);: 有效等位基因數(shù);: Nei基因多樣性指數(shù);: Shannon’s信息指數(shù);: 多態(tài)性位點數(shù);:多態(tài)性位點百分率。

: Observed number of alleles;: Effective number of alleles;: Nei’s genetic diversity index;: Shannon’s information index;: Number of polymorphism loci;: Percentage of polymorphism loci.

3 結論和討論

3.1 中國橄欖種質資源遺傳多樣性存在明顯的地域性差異

本研究中，基于ISSR和RAPD標記技術，絕大部分橄欖種質資源的分類結果相似度較高，說明獲得的橄欖種質資源遺傳結構具有較高準確性和可靠度。其中，大部分福建的橄欖種質資源聚為一

類，廣東、廣西和四川的樣本聚為一類，浙江和少數(shù)幾個其他地區(qū)的種質聚為一類。可見，中國橄欖種質資源遺傳多樣性的地域性差異較為明顯，與所屬分布區(qū)生態(tài)類型存在較大相關性。該結果與前人的研究基本一致[17]。其中，廣東、廣西和四川的橄欖種群遺傳相似性較高，可能具有相同的起源，而整體上福建橄欖種群和浙江橄欖種群的親緣關系較近。通常，植物的遺傳多樣性主要來源于遺傳變異和基因交流，且受多個因素共同影響。首先由于地理位置關系，福建和浙江橄欖主栽區(qū)域的橄欖種質資源交流頻繁，造成2地間的種質資源存在豐富的基因交流，再加上浙江和福建同屬于中國橄欖凍害危險性區(qū)域，經(jīng)過長年累月環(huán)境適應性篩選，種質資源的進化方向和遺傳變異的方向較一致，2種群間又存在高頻率的基因交流，因此其遺傳距離更近。而廣東、廣西和四川橄欖種質資源親緣關系較近，很可能這些地區(qū)之間存在相同的橄欖起源。然而，值得注意的是，部分橄欖種質資源的歸屬并不完全按照地域性分布，如福建‘上杭三棱欖’和福建‘云霄穗橄欖’，與廣東橄欖種群的遺傳距離更近, 而這兩份橄欖種質資源均可能由廣東引種而來。結合已有研究結果表明，基于分子標記技術能夠在一定程度上對中國橄欖種質資源的同物異名現(xiàn)象進行校正，可作為橄欖品種鑒定的重要依據(jù)[21,27]。

3.2 中國橄欖種質資源個體間的遺傳分化或變異形成了相對豐富的整體遺傳多樣性

種質資源遺傳多樣性反映的是種群之間或種群內個體間基因組成的差異，對物種的起源、進化以及開發(fā)利用研究具有重要參考價值。其中，Nei’s遺傳多樣性指數(shù)是種質資源遺傳多樣性研究的關鍵指標，本研究中，基于ISSR的中國橄欖種質資源整體遺傳多樣性水平(0.284±0.169)高于Nybom[28]報道的多種植物的平均水平(0.22～0.23)，說明整體上，中國橄欖種質資源遺傳多樣性水平相對豐富。同時，也高于廣東潮汕橄欖和粵東地區(qū)橄欖的遺傳多樣性水平[24]。此外，中國橄欖種質資源存在高水平的遺傳多態(tài)性，可能存在高頻遺傳變異。而總遺傳分化系數(shù)較低，說明大部分遺傳分化來源于群體內部。群體間的平均遺傳相似系數(shù)遠高于個體間, 進一步說明個體間的遺傳變異是造成其高水平遺傳分化的主要原因。值得注意的是，中國橄欖種質資源總遺傳多樣性水平仍高于群體內遺傳多樣性, 說明群體間的遺傳分化或變異依然存在，也是導致其遺傳多樣性呈現(xiàn)地域性差異的原因?；贗SSR和RAPD獲得的基因流遠遠大于1.0，表明中國橄欖種質資源種群之間存在豐富的遺傳信息交流[29–30]。因此，中國橄欖種質資源個體間的遺傳分化或變異形成了相對豐富的遺傳多樣性，但群體間的遺傳多樣性差異依然存在，而群體間高頻率的遺傳信息交流導致其群體間遺傳距離不斷縮小。

3.3 橄欖核心種質庫構建策略

核心種質是評價和利用種質資源的重要切入點，是原始種質的一個核心子集，必須同時具備代表性、多樣性和異質性的特點。通過遺傳相似系數(shù)或遺傳距離篩除相同或相近的株系，重復聚類多次剔除構建核心種質是常用的技術手段之一[31]。本研究中，基于ISSR和RAPD構建的核心種質存在一定的差異，但均保留了‘葡萄’、‘大目埕橄欖王’、‘上灣檀香’、‘福欖1號’、‘上杭三棱欖’、‘漳浦18號’、‘漳浦7號’、‘鳳湖欖’、‘瑞安2號’和‘瑞安5號’等10份橄欖種質資源，說明這些種質資源具有重要保存價值。然而，雖然橄欖核心種質的構建最大限度保留了種質的基因庫，但并不意味著保留種質可以淘汰，一方面核心種質或多或少丟失了部分原始種質類型，另一方面所構建核心種質無法滿足某些性狀要求時依然要從保留種質中獲取。此外，采用基因型數(shù)據(jù)構建的核心種質忽略了表型性狀、農藝性狀等方面的特征，往往不夠全面，還需要結合葉[32]、花[33]、果[34]等數(shù)據(jù)精確構建核心種質。橄欖核心種質是種質資源保存和研究的重點，后續(xù)還應進一步對其開展全面的鑒定評價，并在橄欖育種中充分有效地利用。同時，應進一步加大現(xiàn)有資源圃的種質資源的收集保存工作，使其更加全面地覆蓋中國橄欖大部分種質資源，甚至越南、泰國、柬埔寨、老撾、緬甸、菲律賓和馬來西亞等世界其他分布區(qū)的橄欖種質資源。在全面收集橄欖種質資源的基礎上構建更具有代表性的橄欖核心種質，為橄欖研究、育種和生產提供重要基礎。

[1] CHANG Q, SU M H, CHEN Q X, et al.Physicochemical properties and antioxidant capacity of Chinese olive (L.) cultivars [J].J Food Sci, 2017, 82(6): 1369–1377.doi: 10.1111/1750-3841.13740.

[2] ZENG H L, MIAO S, ZHENG B D, et al.Molecular structural characteristics of polysaccharide fractions from(Lour.) Raeusch and their antioxidant activities [J].J Food Sci, 2015, 80(11): H2585–H2596.doi: 10.1111/1750-3841.13076.

[3] CHEN F Z, YANG L P, HUANG Y N, et al.Isocorilagin, isolated from(Lour.) Raeusch, as a potent neuraminidase inhibitor against influenza A virus [J].Biochem Biophys Res Commun, 2020, 523(1): 183–189.doi: 10.1016/j.bbrc.2019.12.043.

[4] KUO Y H, YEH Y T, PAN S Y, et al.Identification and structural elucidation of anti-inflammatory compounds from Chinese olive (L.) fruit extracts [J].Foods, 2019, 8(10): 441.doi: 10.3390/foods8100441.

[5] YEH Y T, CHIANG A N, HSIEH S C.Chinese olive (L.) fruit extract attenuates metabolic dysfunction in diabetic rats [J].Nutrients, 2017, 9(10): 1123.doi: 10.3390/nu9101123.

[6] LAI R L, CHEN J, FENG X, et al.Advances on germplasm resource evaluation and cold resistance research in Chinese olive of China [J].Chin J Trop Crop, 2017, 38(11): 2188–2194.doi: 10.3969/j.issn.1000- 2561.2017.11.031.

賴瑞聯(lián), 陳瑾, 馮新, 等.中國橄欖種質資源評價與抗寒性研究進展 [J].熱帶作物學報, 2017, 38(11): 2188–2194.doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.031.

[7] WANG M, PENG J Q, CAO J W, et al.Studies on genetic diversity of 48 wild species of magnoliaceae in Yunnan [J].J Trop Subtrop Bot, 2020, 28(3): 277–284.doi: 10.11926/jtsb.4161.

王猛, 彭繼慶, 曹基武, 等.云南木蘭科48種野生植物資源的遺傳多樣性研究 [J].熱帶亞熱帶植物學報, 2020, 28(3): 277–284.doi: 10.11926/jtsb.4161.

[8] PAN D R, ZENG H Y, CHEN G S, et al.Genetic diversity of chewing cane germplasms using RAPD and ISSR markers [J].J Trop Subtrop Bot, 2007, 15(3): 183–190.doi: 10.3969/j.issn.1005-3395.2007.03.001.

潘大仁, 曾惠陽, 陳觀水, 等.RAPD和ISSR分子標記對果蔗種質資源的遺傳多樣性研究 [J].熱帶亞熱帶植物學報, 2007, 15(3): 183–190.doi: 10.3969/j.issn.1005-3395.2007.03.001.

[9] YANG P K, ZHUANG D H, MA R J.Establishment of ISSR system forusing orthogonally designed experiments [J].S China Fruits, 2010, 39(2): 31–33.doi: 10.13938/j.issn.1007-1431.2010.02.020.

楊培奎, 莊東紅, 馬瑞君.利用正交試驗建立橄欖的ISSR-PCR反應體系[J].中國南方果樹, 2010, 39(2): 31–33.doi: 10.13938/j.issn.1007-1431.2010.02.020.

[10] LIU T L, PAN D M, XU C T, et al.Optimization of ISSR-PCR reaction system in olive [J].Biotechnol Bull, 2010(7): 137–141.doi: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2010.07.033.

劉天亮, 潘東明, 許長同, 等.橄欖ISSR-PCR反應體系的優(yōu)化 [J].生物技術通報, 2010(7): 137–141.doi: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2010.07.033.

[11] NIE Z S, LAI Z X, PAN D M, et al.Genomic DNA extraction and optimization of RAPD amplifying conditions ofreausch [J].Subtrop Agric Res, 2005, 1(2): 6–8.doi: 10.3969/j.issn.1673-0925.2005.02.002.

聶珍素, 賴鐘雄, 潘東明, 等.橄欖基因組DNA提取及RAPD擴增條件優(yōu)化 [J].亞熱帶農業(yè)研究, 2005, 1(2): 6–8.doi: 10.3969/j.issn.1673-0925.2005.02.002.

[12] MEI Z Q, YANG L Q, ZHANG T D, et al.Improved RAPD analysis of(Lour.) Raeusch from Sichuan Province along Yangtze Rriver in China [J].Annu Res Rev Biol, 2014, 4(1): 51–60.doi: 10.9734/ARRB/2014/5015.

[13] MEI Z L, ZHANG X Q, LIU X Y, et al.Genetic analysis ofin different areas of China by improved RAPD and ISSR [J].C R Biol, 2017, 340(11/12): 558–564.doi: 10.1016/j.crvi.2017.09.006.

[14] CHENG J L, YIN Z C, MEI Z Q, et al.Development and significance of SCAR marker QG12-5 for(Lour.) Raeusch by molecular cloning from improved RAPD amplification [J].Genet Mol Res, 2016, 15(3): 15038347.doi: 10.4238/gmr.15038347.

[15] YANG P K, ZHENG D X, MA R J, et al.Genetic diversity analysis ofL.landrances in Chaoshan area by ISSR [J].Guang- dong Agric Sci, 2013, 40(23): 129–132.doi: 10.3969/j.issn.1004-874X.2013.23.031.

楊培奎, 鄭道序, 馬瑞君, 等.潮汕橄欖地方品種(系)遺傳多樣性的ISSR分析 [J].廣東農業(yè)科學, 2013, 40(23): 129–132.doi: 10.3969/j.issn.1004-874X.2013.23.031.

[16] YANG P K, ZHUANG D H, MA R J, et al.The ISSR analysis of genetic diversity ofL.germplasm resources in eastern Guangdong [J].Chin Agric Sci Bull, 2011, 27(24): 86–92.

楊培奎, 莊東紅, 馬瑞君, 等.粵東地區(qū)橄欖種質資源遺傳多樣性的ISSR分析 [J].中國農學通報, 2011, 27(24): 86–92.

[17] LIU T L.ISSR analysis of germplasm resources of FujianRaeusch [D].Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University, 2010: 14–42.

劉天亮.福建省橄欖(Raeusch)種質資源的ISSR分析 [D].福州: 福建農林大學, 2010: 14–42.

[18] CHEN M X, ZHANG Q J, CHEN Q X, et al.ISSR analysis of main cultivated and fresh-eating(Lour.) Raeusch in Fuzhou City [J].Mod Agric Sci Technol, 2011(21): 129–130,133.doi: 10.3969/ j.issn.1007-5739.2011.21.078.

陳明賢, 張慶舉, 陳清西, 等.福州市主栽橄欖品種與若干鮮食橄欖優(yōu)株的ISSR分析 [J].現(xiàn)代農業(yè)科技, 2011(21): 129–130,133.doi: 10.3969/j.issn.1007-5739.2011.21.078.

[19] NIE Z S.RAPD analysis of album () genetic resources in Fujian Province [D].Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University, 2005: 24–48.

聶珍素.福建橄欖(L.)資源的RAPD分析 [D].福州: 福建農林大學, 2005: 24–48.

[20] WANG Y P, CHEN Q, ZHOU Z Q, et al.Optimization of AFLP reaction system in[J].J Fruit Sci, 2012, 29(3): 505–511.doi: 10.13925/j.cnki.gsxb.2012.03.033.

王燕平, 陳勤, 周志欽, 等.橄欖基因組AFLP擴增體系的優(yōu)化 [J].果樹學報, 2012, 29(3): 505–511.doi: 10.13925/j.cnki.gsxb.2012.03.033.

[21] ZHOU J H, WANG Y P, CHEN Q, et al.Genetic diversity analysis with AFLP on fresh Chinese olive cultivars resources in Guangdong Province [J].Guihaia, 2014, 34(1): 4–9.doi: 10.3969/j.issn.1000-3142.2014.01.002.

周俊輝, 王燕平, 陳勤, 等.用AFLP分析廣東省鮮食橄欖品種資源遺傳多樣性 [J].廣西植物, 2014, 34(1): 4–9.doi: 10.3969/j.issn.1000-3142.2014.01.002.

[22] ODONG T L, JANSEN J, VAN EEUWIJK F A, et al.Quality of core collections for effective utilization of genetic resources: Review, discussion and interpretation [J].Theor Appl Genet, 2013, 126(2): 289– 305.doi: 10.1007/s00122-012-1971-y.

[23] YONEZAWA K, NOMURA T, MORISHIMA H.Sampling strategies for use in stratified germplasm collections [M]// HODGKIN T, BROWN A H D, VAN HINTUM T J L, et al.Core Collections of Plant Genetic Resources.Chichester, UK: John Wiley & Sons, 1995: 35–53.

[24] YANG P K, ZHUANG D H, MA R J.Studies on sampling schemes of core collection ofL.in eastern Guangdong, China [J].J Trop Subtrop Bot, 2012, 20(3): 277–284.doi: 10.3969/j.issn.1005- 3395.2012.03.011.

楊培奎, 莊東紅, 馬瑞君.粵東橄欖資源核心種質取樣方案的研究 [J].熱帶亞熱帶植物學報, 2012, 20(3): 277–284.doi: 10.3969/j.issn.1005-3395.2012.03.011.

[25] CHEN R Q.Analysis of genetic diversity of Chinese white olive () in Fujian Province using 18S-26SrDNA-PCR-ITS [D].Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University, 2005: 12–24.

陳瑞慶.福建橄欖()遺傳多態(tài)性上的研究 [D].福州: 福建農林大學, 2005: 12–24.

[26] EVANNO G, REGNAUT S, GOUDET J.Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: A simulation study [J].Mol Ecol, 2005, 14(8): 2611–2620.doi: 10.1111/j.1365-294X.2005.02553.x.

[27] YANG P K, ZHUANG D H, MA R J.Application of ITS sequences in the identification of local variety resources of olive [J].S China Fruits, 2015, 44(2): 23–26.doi: 10.13938/j.issn.1007-1431.20140543.

楊培奎, 莊東紅, 馬瑞君.ITS序列在橄欖地方品種資源鑒定中的應用 [J].中國南方果樹, 2015, 44(2): 23–26.doi: 10.13938/j.issn.1007-1431.20140543.

[28] NYBOM H.Comparison of different nuclear DNA markers for esti- mating intraspecific genetic diversity in plants [J].Mol Ecol, 2004, 13 (5): 1143–1155.doi: 10.1111/j.1365-294X.2004.02141.x.

[29] WRIGHT S.Evolution and the Genetics of Populations.A Treatise in Four Volumes.Volume 4.Variability within and Among Natural Popu- lations [M].Chicago, London: University of Chicago Press, 1978.

[30] IRWIN E D, BENSCH S, IRWIN J H, et al.Speciation by distance in a ring species [J].Science, 2005, 307(5708): 414–416.doi: 10.1126/ science.1105201.

[31] JANSEN J, VAN HINTUM T.Genetic distance sampling: A novel sampling method for obtaining core collections using genetic distances with an application to cultivated lettuce [J].Theor Appl Genet, 2007, 114(3): 421–428.doi: 10.1007/s00122-006-0433-9.

[32] WAN J F, WU R J, WEI X X, et al.Diversity analysis of the leaf phenotypic characters of Chinese olive germplasm resources [J].Chin J Trop Crop, 2012, 33(6): 975–980.doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2012.06.002.

萬繼鋒, 吳如健, 韋曉霞, 等.橄欖種質資源葉片表型性狀多樣性分析 [J].熱帶作物學報, 2012, 33(6): 975–980.doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2012.06.002.

[33] WEI X X, LAI R L, CHEN J, et al.Studies on genetic diversity on inflorescence phenotypic characteristics ofgerm- plasm resource [J].J Trop Subtrop Bot, 2019, 27(1): 1–10.doi: 10.11926/jtsb.3940.

韋曉霞, 賴瑞聯(lián), 陳瑾, 等.橄欖種質資源花序表型性狀遺傳多樣性研究 [J].熱帶亞熱帶植物學報, 2019, 27(1): 1–10.doi: 10.11926/ jtsb.3940.

[34] WU R J, WAN J F, WEI X X, et al.Fruit character diversity analysis and numerical classification of Chinese olive germplasm resources [J].J Fruit Sci, 2015, 32(5): 797–805.doi: 10.13925/j.cnki.gsxb.20150129.

吳如健, 萬繼鋒, 韋曉霞, 等.橄欖種質資源果實表型性狀多樣性分析及其數(shù)量分類研究 [J].果樹學報, 2015, 32(5): 797–805.doi: 10.13925/j.cnki.gsxb.20150129.

ISSR and RAPD Genetic Diversity Analysis and Core Germplasms Construction of

LAI Ruilian, CHEN Jin, FENG Xin, WEI Xiaoxia, CHEN Yiting, SHEN Chaogui, WU Rujian*

(Fruit Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350013, China)

To reveal the genetic diversity of germplasm resources ofin China, the genetic diversity of 86 germplasms selected from the major distribution areas was studied by using ISSR and RAPD markers, and core germplasms were constructed.The results showed that 86 germplasms could be divided into 3 groups based on UPGMA genetic similarity, and 4 groups by using STRUCTURE cluster analysis, which basically conform to the regional distribution ofin China.The overall genetic diversity coefficient using ISSR and RAPD was 0.284±0.169 and 0.244±0.163, the percentage of polymorphism loci was 92.56% and 100%, the genetic differentiation coefficient was 0.127 and 0.142, the gene flow was 3.423 and 3.025, the average genetic similarity coefficient between populations was 0.930 and 0.939, and the average genetic similarity coefficient between individuals was 0.736 and 0.732.Therefore, it was suggested that the rich genetic diversity ofin China mainly caused by the genetic differentiation or variation among individuals, and there were obvious regional differences.

; Genetic diversity; Core germplasm; ISSR; RAPD

10.11926/jtsb.4437

2021-04-29

2021-06-02

福建省自然科學基金項目(2019J01110)；農業(yè)農村部物種品種資源保護(熱帶作物)項目(151821301354052701)；福建省農業(yè)種質資源創(chuàng)新專項([2021]53)資助

This work was supported by the Natural Science Foundation of Fujian Province (Grant No.2019J01110); the Project of Species and Varieties Protection (Tropical Crops) of Ministry of Agriculture and Rural Affairs (Grant No.151821301354052701); and the Project for Agricultural Germplasm Resources Innovation in Fujian (Grant No.[2021]53).

賴瑞聯(lián)(1990～ )，男，博士研究生，研究實習員，從事果樹生物技術與遺傳資源研究。E-mail: lairl0618@163.com

通信作者Corresponding author.E-mail:wurujian@126.com