肖懿，張桂賢，高瑞芳，李霞，沈洪昇，劉洪斌△

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）作為一種病死率極高的急性胰腺炎（AP），不僅具備AP的臨床表現和生化改變，還伴有持續(xù)（＞48 h）器官功能衰竭［1］。損傷相關分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）是指發(fā)生創(chuàng)傷或嚴重失血等情況時被釋放到細胞間隙或血液循環(huán)中的一類物質［2］。胞內來源的線粒體DAMPs分子包括線粒體N-甲酰肽（N-formyl peptides，NFPs）和線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）。研究發(fā)現SAP模型大鼠血漿mtDNA濃度顯著升高，并與多器官損傷程度密切相關［3］。MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-ND5和MT-ND6均屬于人線粒體基因組所編碼的人源線粒體NFPs的氨基酸序列。甲酰肽受體（formyl peptide receptors，FPRs）屬于7次跨膜G蛋白偶聯受體家族［4］，參與并調控多種炎癥性疾?。?］。人體內有3種FPRs，分別是FPR1、FPR2和FPR3［6］。線粒體NFPs作為主要的促炎介質，可被FPR1和FPR2所識別。已知NFPs可作用于中性粒細胞表面FPR1，激活中性粒細胞的免疫功能［7］。目前，探討FPR1和炎癥關系的研究頗多，但線粒體NFPs和FPR1與SAP的關系尚不明確。本研究以6種線粒體NFPs及FPR1為切入點，初步探究SAP進程中其相關表達情況，為拮抗SAP病程中的炎癥級聯反應尋找潛在治療靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 ?；悄懰徕c購自Sigma公司；全血總蛋白提取試劑盒（TF211148）購自北京百奧萊博科技有限公司；BCA蛋白質定量試劑盒（UE285903）購自Thermo Fisher Scientific公司；兔抗大鼠MT-ND1（GR3189552-7）、MT-ND3（GR3202807-11）、MT-ND5（GR3286204-5）購自Abcam公司；兔抗大鼠MT-ND2（AB2E05N）、MT-ND4（AB2E06N）抗體購自Invitrogen公司；兔抗大鼠MT-ND6（A3918）抗體和兔抗大鼠FPR1（W0838）抗體均購自biorbyt公司；ECL化學發(fā)光液（No.1722102）購自Millipore公司；辣根酶標記山羊抗兔IgG（H+L，127760）、兔SP試劑盒（2005E1124）、DAB顯色試劑盒（2040A1012）和抗體稀釋液（19082903）購自北京中杉金橋公司。Tanon-5200化學發(fā)光分析儀和PowerPac Basic、Mini-PRO TEAN?Tetra、Mini Trans-Blot垂直電泳系統均購自Bio-Rad公司；CX41微圖HTC1600正置顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 實驗動物 6周齡SPF級雄性SD大鼠30只，體質量180~200 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2020-0004。正常飼料喂養(yǎng)，自由進食飼料和水，室內通風良好，飼養(yǎng)環(huán)境12 h光照與12 h黑暗交替循環(huán)，溫度（22±3）℃，相對濕度（50±10）%。大鼠適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗。

1.3 分組與模型制備 將30只大鼠按隨機數字表法分為3組：假手術組、SAP模型3 h組和SAP模型6 h組，每組10只。假手術組僅在開腹并輕輕翻動胰腺后關閉腹腔。參照文獻［8］方法，模型制備前禁食12 h，不禁水。以10%水合氯醛（0.3 g/kg）腹腔注射麻醉，無菌條件下經腹壁正中切口入腹，于膽管出肝門端以無損傷小動脈夾暫時阻斷膽管，尋找到膽胰管十二指腸乳頭開口處，在其對應系膜緣處用4號注射針頭刺一小孔，用PE50導管經乳頭部逆行插入膽胰管0.5 cm，妥善固定，以5%牛磺膽酸鈉勻速注入（50 mg/kg，0.1 mL/min），注射完畢后拔管，5 min后去除小動脈夾，以無損傷縫線縫合十二指腸穿刺孔，縫合腹壁。實驗完畢后將各組大鼠放回鼠籠常規(guī)飼養(yǎng)，密切關注其生命體征。

1.4 樣本采集 SAP造模3 h后對SAP模型3 h組取材，SAP造模6 h后對假手術組和SAP模型6 h組取材。以10%水合氯醛（0.3 g/kg）腹腔注射麻醉，大鼠取仰臥位固定開腹，4%枸櫞酸鈉（1∶9）預潤洗處理一次性無菌注射器，抽取腹主動脈全血5 mL，將抗凝全血離心留取血漿，分裝儲存于-20℃?zhèn)溆茫蝗∫认俳M織于4%多聚甲醛中固定備用。

1.5 胰腺組織HE染色及病理評分 胰腺組織于4%多聚甲醛中固定48 h后取出，常規(guī)脫水包埋，行5μm厚切片，撈片后60℃烤片過夜，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蘇木素染色，流水沖洗片刻后伊紅染色，流水沖洗多余染料，脫水透明，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察胰腺組織形態(tài)學變化。依照Schmidt病理評分標準［9］對各組胰腺組織進行評分。

1.6 免疫組化法檢測胰腺組織FPR1表達 胰腺組織石蠟切片60℃烘片過夜后置于室溫30 min。切片置于新鮮二甲苯脫蠟及梯度乙醇脫水后，進行常規(guī)抗原熱修復，自然冷卻至室溫后用PBS漂洗3次，每次5 min，隨后置于濕盒內滴加內源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育15 min。經PBS漂洗3次，每次3 min，使用羊血清工作液于濕盒中封閉2 h，FPR1抗體（1∶200）4℃孵育過夜。次日復溫至室溫后PBS漂洗3次，每次3 min，生物素標記羊抗兔IgG濕盒常溫孵育15 min。PBS漂洗3次，每次3 min，用辣根酶標記鏈霉卵白素工作液于濕盒中常溫孵育15 min。PBS漂洗3次，每次3 min，滴加DAB顯色液顯色2~3 min，自來水中止顯色。蘇木素復染、脫水、透明，中性樹膠封片，鏡下觀察表達情況。采用Image J軟件測量典型圖像中陽性信號區(qū)域占比3次，FPR1陽性表達率（%）=強陽性占比+陽性占比+弱陽性占比。

1.7 免疫印跡法檢測血漿中6種線粒體NFPs表達 按照蛋白提取試劑盒說明書指示提取凍存血漿蛋白，BCA蛋白質定量試劑盒進行蛋白定量，用loading buffer配平蛋白提取液并在100℃金屬浴中加熱10 min。根據蛋白不同情況取最佳上樣量，其中MT-ND1、MT-ND3和MT-ND6上樣量均為60μg，MT-ND2和MT-ND4上樣量均為30μg，MT-ND5上樣量為10μg。SDS-PAGE分離，轉膜，室溫下用5%脫脂牛奶封閉，4℃孵育兔抗大鼠一抗MT-ND1（1∶1 000）、MT-ND2（1∶500）、MT-ND3（1∶1 000）、MT-ND4（1∶1 000）、MT-ND5（1∶500）、MT-ND6（1∶1 000）過夜，洗膜，室溫下孵育羊抗兔二抗（1∶5 000）1 h，洗膜，加入ECL發(fā)光液于化學發(fā)光分析儀中曝光。用Image J軟件重復測量各條帶灰度值3次。各組MTND1水平為各組MT-ND1蛋白灰度值與假手術組MT-ND1蛋白灰度值均值的比值，MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MTND5和MT-ND6依此類推。

1.8 統計學方法 采用SPSS 22.0進行數據分析，正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。胰腺組織FPR1陽性表達率數據通過取平方根變換后滿足正態(tài)性和方差齊性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

Fig.1 HE staining of the pancreatic tissues(first row×100;second row×200)圖1 各組胰腺組織的HE染色情況（第一排×100；第二排×200）

2.1 各組胰腺組織HE染色以及病理評分結果 假手術組胰腺組織無水腫、充血和胰腺壞死，鏡下無明顯病理變化，胰腺腺泡排列規(guī)則，腺管形態(tài)正常，無明顯充血、壞死和炎性浸潤，且胰島結構完整。與假手術組比較，SAP模型3 h組和SAP模型6 h組的胰腺組織病變明顯，表現為胰腺組織出血，腺泡細胞明顯腫脹、壞死，小葉結構紊亂，葉間隙增寬，間質內有明顯炎性細胞浸潤等病理改變。其中SAP模型6 h組可見腺泡細胞壞死更甚，中性粒細胞、單核細胞等炎性細胞浸潤面積更大，出血更加明顯，胰島周圍尤甚，見圖1。假手術組、SAP模型3 h組和SAP模型6 h組病理評分分別為（4.20±1.64）、（9.40±1.39）和（13.50±1.41）分，差異有統計學意義（F=98.576，P＜0.05）。與假手術組比較，SAP模型3 h組和SAP模型6 h組的病理評分明顯升高，SAP模型6 h組病理評分明顯高于SAP模型3 h組（均P＜0.05）。

2.2 各組胰腺組織FPR1表達水平 假手術組中胰腺腺泡細胞未見明顯FPR1表達，僅胰島出現弱陽性表達；相較于假手術組，SAP模型3 h組和SAP模型6 h組的胰腺組織FPR1主要定位表達于炎性浸潤區(qū)域和胰腺組織壞死區(qū)域，且SAP模型6 h組因壞死區(qū)域面積更大，炎性細胞浸潤更甚，而出現明顯黃棕染色情況，見圖2。假手術組、SAP模型3 h組和SAP模型6 h組的FPR1陽性表達率分別為（11.00±1.34）%、（31.80±2.12）%和（56.90±1.37）%，差異有統計學意義（F=4 636.458，P＜0.05），SAP模型3 h組和SAP模型6 h組的胰腺組織FPR1表達水平均較假手術組升高，SAP模型6 h組的FPR1陽性表達率較SAP模型3 h組明顯增加（P＜0.05）。

Fig.2 Expression of FPR1 in pancreatic tissue(IHC,first row×100;second row×200)圖2 胰腺組織中FPR1的表達（免疫組化法，第一排×100；第二排×200）

2.3 血漿中6種線粒體NFPs的表達水平 與假手術組相比，SAP模型3 h組和SAP模型6 h組的MTND1、MT-ND3和MT-ND6蛋白表達水平均顯著增高（P＜0.05），且呈現遞增趨勢。SAP模型3 h組和SAP模型6 h組MT-ND2表達水平相較于假手術組表達均升高，但SAP模型6 h組表達低于SAP模型3 h組（P＜0.05）。MT-ND4表達水平在3組中呈現遞減趨勢（P＜0.05）。3組MT-ND5表達水平差異無統計學意義。見圖3、表1。

Fig.3 Expression levels of 6 kinds of mitochondrial N-formyl peptides in plasma圖3 血漿中6種線粒體NFPs的表達

Tab.1 Comparison of expression levels of 6 mitochondrial NFPs in plasma of rats between the three groups表1 各組大鼠血漿中6種線粒體NFPs的表達比較（n=10，±s）

Tab.1 Comparison of expression levels of 6 mitochondrial NFPs in plasma of rats between the three groups表1 各組大鼠血漿中6種線粒體NFPs的表達比較（n=10，±s）

＊P＜0.05；a與假手術組相比，b與SAP模型3 h組相比，P＜0.05。

組別假手術組SAP模型3 h組SAP模型6 h組F MT-ND1 1.05±0.39 11.38±6.04a 18.54±6.83ab 20.040＊MT-ND2 0.82±0.16 1.93±0.20a 1.52±0.44ab 22.233＊MT-ND3 0.80±0.25 1.93±0.86a 4.87±0.63ab 100.387＊組別假手術組SAP模型3 h組SAP模型6 h組F MT-ND4 1.00±0.26 0.75±0.28a 0.40±0.10ab 18.126＊MT-ND5 1.00±0.17 1.01±0.07 1.12±0.20 1.249 MT-ND6 0.80±0.18 1.38±0.41a 4.38±0.40ab 291.374＊

3 討論

早期SAP患者死亡的重要原因是伴有全身炎癥反應綜合征（SIRS）的暴發(fā)性器官衰竭［10］。在急性創(chuàng)傷過程中，NFPs釋放到外周循環(huán)系統，和對線粒體DAMPs有反應的免疫細胞一起參與SIRS的形成［11］。已知NFPs的公認經典配體FPRs［12］所介導的疾病包括炎癥性肺部疾?。?3］、結腸炎、單核苷酸多態(tài)性相關牙周炎等［14］。FPR1在眾多免疫細胞均有表達，且作為體內炎癥環(huán)境的關鍵調節(jié)器已成為研究的熱點［15］。研究發(fā)現，經典的核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3炎性體可通過FPR1通路調控閉塞性細支氣管炎綜合征［16］。早期AP出現的并發(fā)癥均與血管功能紊亂有關，包括內皮激活和損傷，血管通透性增加，白細胞向組織遷移增加等［17］；而FPR1的激活可以刺激眾多下游信號通路，這些信號通路與血管收縮和中性粒細胞的黏附、趨化、吞噬、分泌顆粒的胞吐等作用有關［18］。通過調控中性粒細胞的功能，FPR1在炎癥和許多疾病的病理過程中均扮演重要角色［19-20］。但是，炎癥反應為自身免疫的重要一環(huán)，其作用對人體是“有利”還是“有害”，取決于FPR1所介導的炎癥反應的方向與程度。FPRs本身還可作為藥物作用靶點，用于許多炎癥性疾病的針對性治療［21］，如競爭性FPR1拮抗劑二肽HCH6-1可能作為一種治療FPR1相關炎癥性肺部疾病的新藥物［22］。

本研究顯示，?；悄懰徕c誘導大鼠SAP模型后胰腺組織出現明顯出血壞死以及炎性浸潤。隨著SAP造模時間延長，胰腺組織FPR1表達逐漸增加，表明SAP大鼠胰腺病變程度與FPR1相關；而FPR1與炎癥密不可分，推測其與SAP的過度炎癥反應和炎癥級聯放大有關。值得注意的是，Gabl等［23］發(fā)現MT-ND3和MT-ND6對FPR1有受體偏好，MT-ND4和MT-ND5傾向于FPR2，MT-ND2是較弱的中性粒細胞激活劑，MT-ND1不發(fā)揮激動或拮抗FPR作用。本研究發(fā)現，MT-ND5的表達與SAP病情無明顯關系，MT-ND1、MT-ND3和MT-ND6隨病情進展而表達升高，推測其可能參與SAP的炎癥反應過程，且其表達水平與炎癥程度有關。3組MT-ND2的表達結果則呈“類鐘形”曲線，可能表明其確實參與炎癥反應，但受到其他調控或蛋白的影響。隨著SAP造模時間延長，MT-ND4可能出現了負反饋式表達遞減，具體調節(jié)機制有待進一步探究。

綜上所述，SAP進程中，包括胰腺腺泡細胞在內的受損細胞會釋放線粒體NFPs進入血循環(huán)，激活FPR信號通路，而趨化受體FPR1的活化將進一步激活包括中性粒細胞在內的免疫細胞，這與?；悄懰徕c誘導的SAP失控的過度炎癥反應密切相關。本研究為線粒體NFPs在內的DAMPs參與SAP病程提供了理論基礎，具體機制有待進一步研究論證。