鄒震宇 徐琦 朱張茜 劉澤政 陳玲

肝腎綜合征（hepatorenal syndrome,HRS）是終末期肝病患者常見的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，常表現(xiàn)為功能性、進(jìn)行性的腎功能不全，其進(jìn)展迅速，預(yù)后差[1-2]。有研究表明肝硬化失代償期患者1年內(nèi)HRS發(fā)生率為18%，5年內(nèi)發(fā)生率高達(dá)39%[3-4]。既往對(duì)于HRS的研究主要集中在內(nèi)臟血管擴(kuò)張、心功能障礙、相對(duì)腎上腺功能不全等方面，而近年的研究熱點(diǎn)趨向于全身性炎癥、腸道細(xì)菌易位和腎臟病理等方面[5]。但HRS患者病情復(fù)雜并且難以取得肝腎病理檢查結(jié)果，因此不少學(xué)者制作HRS動(dòng)物模型進(jìn)行研究。本研究采用皮下注射四氯化碳（CCl4）建立HRS大鼠模型，并分析模型建立過程中不同時(shí)段大鼠肝腎功能及肝腎病理變化情況，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 90只SD雄性大鼠[溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證 SYXK（浙）2020-0014]，初始體重（200±10）g，置于屏障環(huán)境內(nèi)，常規(guī)飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。全自動(dòng)生化分析儀（日本 Oplympus公司，AU5400）；100% CCl4注射液（上海泰坦化學(xué)有限公司，批號(hào)：01162305）；稱重器（杭州威衡科技有限公司，YK-15）。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模方法 將90只大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組（20只）、4周組（20只）、8周組（30只）、12周組（20只）。對(duì)照組皮下注射0.9%氯化鈉注射液0.3 ml/100 g，3次/周，共4周；4周組皮下注射 CCl40.3 ml/100 g，3次/周，共4周；8周組皮下注射 CCl40.3 ml/100 g，3次/周，共8周；12周組皮下注射CCl40.3 ml/100 g，3 次/周，共 12 周。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）到達(dá)預(yù)計(jì)造模時(shí)間后將大鼠放入代謝籠中取尿（禁食不禁水），24 h后測(cè)量尿量。（2）大鼠稱重后腹腔注射10%水合氯醛0.3 ml/100 g麻醉，仰臥位置于操作臺(tái)，身體保持自然狀態(tài)，胸口不扭曲。（3）左手示指確定心尖搏動(dòng)點(diǎn)后，右手持5 ml注射器，針頭緊貼于劍突下，以30°斜行向上進(jìn)針刺入皮下，邊進(jìn)針邊緩緩回抽針管，針尖穿過橫膈膜繼續(xù)斜行刺入2.5～3.0 cm，一旦感到針管有輕微搏動(dòng)即表示針尖已進(jìn)入心臟內(nèi)，取5 ml血后注入采血管。使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定肝腎功能指標(biāo)[包括白蛋白（ALB）、ALT、AST、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）]。（4）再次腹腔注射大劑量10%水合氯醛，刺破心臟放血處死大鼠，然后立刻取出大鼠完整的肝臟和腎臟用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈。肝臟取右外側(cè)葉、中葉及三角葉以10%甲醛溶液固定進(jìn)行光學(xué)顯微鏡檢查。取一條長(zhǎng)度約20 mm、直徑約1 mm的右腎組織用2.5%戊二醛固定進(jìn)行電子顯微鏡檢查，剩余腎臟組織用10%甲醛固定進(jìn)行光學(xué)顯微鏡檢查。

1.3 病理學(xué)檢查

1.3.1 肝臟組織 采用HE染色以及Masson染色，參照Ishak HAl評(píng)分系統(tǒng)，根據(jù)肝纖維化程度、肝臟細(xì)胞和血管結(jié)構(gòu)的改變程度，將CCl4所致肝硬化過程分為F0～F6期：F0期表示無肝纖維化，F(xiàn)1期表示纖維化擴(kuò)展到部分門管區(qū)，有或沒有短的纖維間隔，F(xiàn)2期表示纖維化擴(kuò)展到絕大部分門管區(qū)（圍繞肝小葉中門靜脈分支開口的區(qū)域），有或沒有短的纖維間隔，F(xiàn)3期表示纖維化擴(kuò)展到一些門管區(qū)，偶見門靜脈-門靜脈橋接（P-P橋接），F(xiàn)4期表示纖維化擴(kuò)展到一些門管區(qū)，有明顯的P-P橋接和門靜脈-中心靜脈（P-C橋接），F(xiàn)5期表示出現(xiàn)顯著的橋接（P-P橋接或P-C橋接），偶見結(jié)節(jié)形成（不完全肝硬化），F(xiàn)6期表示可疑或已確診的肝硬化。其中F1～F3期為肝纖維化，F(xiàn)4～F6期為肝硬化。

1.3.2 腎臟組織 各組大鼠隨機(jī)選取5只行腎臟組織病理檢查，采用HE染色、Masson染色、過碘酸雪夫染色（PAS染色）、過碘酸六胺銀染色（PASM染色）。腎纖維化評(píng)估參考Raij等[11]、陸敏等[12]的標(biāo)準(zhǔn)，腎小球硬化指數(shù)：0分為無腎小球硬化，1分為腎小球硬化≤25%，2分為25%＜腎小球硬化≤50%，3分為50%＜腎小球硬化≤75%，4分為75%＜腎小球硬化≤100%。腎間質(zhì)纖維化評(píng)分：以雙盲法應(yīng)用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)，每張切片至少觀察20個(gè)皮質(zhì)區(qū)視野，然后取視野的中央計(jì)算每個(gè)視野下藍(lán)染區(qū)域占總視野面積的百分比，最后取平均值。以2.5%戊二醛固定的腎臟組織使用透射電鏡觀察基底膜電子致密物的沉積情況。

2 結(jié)果

2.1 造模及實(shí)驗(yàn)過程中大鼠情況 對(duì)照組大鼠無意外死亡。4周組造模過程中死亡1只，實(shí)驗(yàn)過程中麻醉死亡1只。8周組造模過程中死亡1只。12周組造模過程中死亡1只，實(shí)驗(yàn)過程中麻醉死亡1只。

2.2 4組大鼠肝腎功能指標(biāo)及尿量的比較 4組大鼠肝腎功能指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與對(duì)照組比較，4 周組的 ALB、ALT，8 周組的 ALB、ALT、AST、Cr及尿量，12 周組的 ALB、ALT、AST、Cr、BUN 及尿量的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與4周組比較，8周組的 AST、Cr、BUN 及尿量，12周組的 ALT、AST、Cr、BUN及尿量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；8周組和12周組的ALT、AST及尿量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 4組大鼠肝腎功能指標(biāo)及尿量的比較

2.3 各組病理學(xué)檢查結(jié)果

2.3.1 肝臟病理學(xué)檢查結(jié)果 （1）對(duì)照組：肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝小葉輪廓清晰，肝索排列整齊有序，肝細(xì)胞未見壞死，均為F0期。中央靜脈周圍、匯管區(qū)周圍、肝血竇周圍可見微量藍(lán)染的膠原纖維（＜10%），見圖1（插頁）。（2）4周組：可見匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，小葉內(nèi)出現(xiàn)變形，部分樣本可見肝小葉點(diǎn)狀壞死，肝纖維化分期多為F1～F2期，少量樣本為F3期。中央靜脈周圍、匯管區(qū)周圍、肝血竇周圍可見少量藍(lán)染的膠原纖維（10%～30%），見圖2（插頁）。（3）8周組：可見肝小葉點(diǎn)狀壞死，纖維結(jié)締組織增生，部分樣本并可見假小葉形成，肝纖維化分期多為F4～F5期，少量樣本為F3和F6期。中央靜脈周圍、匯管區(qū)周圍、肝血竇周圍可見較多藍(lán)染的膠原纖維（20%～40%），見圖3（插頁）。（4）12周組：可見肝小灶狀、片狀壞死，肝細(xì)胞空泡樣變性，纖維結(jié)締組織大量增生，肝竇受壓，肝索紊亂，可見假小葉形成，肝纖維化分期多為F5～F6期，少量樣本為F4期。中央靜脈周圍、匯管區(qū)周圍、肝血竇周圍可見大量藍(lán)染的膠原纖維（40%～60%），見圖4（插頁）。

圖1 對(duì)照組肝臟纖維化F0期（HE染色，×200）

圖2 4周組肝臟纖維化F2期（HE染色，×200）

圖3 8周組肝臟纖維化F4期（HE染色，×200）

圖4 12周組肝臟纖維化F6期（HE染色，×200）

2.3.2 腎臟病理學(xué)檢查結(jié)果 4組大鼠腎臟組織標(biāo)本腎小球硬化指數(shù)結(jié)果如下，對(duì)照組：0、0、0、0、0；4 周組：0、0、0、0、0；8 周組：1、0、0、0、0；12 周組：0、0、0、0、0，各組間腎小球硬化指數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（H=3.00，P＞0.05）。各組腎間質(zhì)纖維面積結(jié)果如下，對(duì)照組：0%、0%、0%、0%、0%；4 周組：0%、0%、0%、1%、4.5%；8 周組：0%、0%、0.5%、2%、3%；12 周組：1%、1%、3%、5.15%、8.35%，各組間腎間質(zhì)纖維面積的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=9.78，P＜0.05）。電鏡檢查結(jié)果顯示：腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯空泡變性，管腔內(nèi)可見紅細(xì)胞聚集，毛細(xì)血管襻開放。腎小囊壁層無明顯增厚，壁層細(xì)胞空泡變性，無明顯增生?；啄o明顯病變。臟層上皮細(xì)胞腫脹，空泡變性。足突大部分融合。系膜細(xì)胞和基質(zhì)增生，未見確切電子致密物。腎小管上皮細(xì)胞空泡變性。腎間質(zhì)無特殊病變。腎間質(zhì)個(gè)別毛細(xì)血管管腔內(nèi)見紅細(xì)胞聚集。見圖5-8。

圖5 對(duì)照組腎臟電鏡圖像（×8 000倍）

圖6 4周組腎臟電鏡圖像（×8 000倍）

圖7 8周組腎臟電鏡圖像（×6 000倍）

圖8 12周組腎臟電鏡圖像（×6 000倍）

3 討論

HRS是失代償期肝硬化常見的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，是一組繼發(fā)于有效血容量下降、內(nèi)源性血管活性物質(zhì)失衡、腎血流量下降，以腎功能不全為主要表現(xiàn)的臨床綜合征，但腎臟常無顯著病理變化[10]。根據(jù)進(jìn)展速度可分為1型和2型。1型HRS多因感染、上消化道出血、過多過快放腹水等誘因引起，表現(xiàn)為短期內(nèi)迅速進(jìn)展的急性腎損傷，平均生存期約1個(gè)月。2型HRS為慢性進(jìn)行性腎損傷，多表現(xiàn)為難治性腹水，常在各種誘因下轉(zhuǎn)變?yōu)?型而死亡，平均生存期約6.7個(gè)月[7-8]。

由于大部分HRS患者病情較重，獲取肝臟及腎臟的病理結(jié)果較為困難，因此筆者選擇通過建立動(dòng)物模型以研究HRS。目前HRS動(dòng)物模型的研究較少[9]，謝永玉等[6]利用CCl4皮下注射12周建立HRS大鼠模型，但僅僅只有第12周末的血生化和病理檢查結(jié)果。因此筆者選擇在不同造模階段采集血液及肝臟、腎臟組織標(biāo)本，以研究CCl4建立HRS大鼠模型的可行性及合適的造模周期。

本研究結(jié)果顯示，CCl4對(duì)大鼠肝功能有損傷作用，造成ALB下降，ALT和AST升高。8周組和12周組的ALB、ALT和AST水平與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此CCl4對(duì)肝功能的影響程度與造模時(shí)間相關(guān)。CCl4對(duì)大鼠腎功能的損害同樣與造模時(shí)間相關(guān)，8周組大鼠的Cr和BUN升高，與對(duì)照組和4周組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而4周組的Cr和BUN水平與對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨著造模時(shí)間增加，大鼠尿量出現(xiàn)下降，8周組與對(duì)照組、4周組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且12周組大鼠的尿量出現(xiàn)進(jìn)一步下降。

肝臟和腎臟組織的病理學(xué)檢查結(jié)果顯示CCl4可以有效誘導(dǎo)肝纖維化從而造成肝硬化，腎臟電鏡病理檢查結(jié)果顯示腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮和臟層上皮細(xì)胞腫脹、空泡變性，足突大部分融合；系膜區(qū)可見系膜細(xì)胞和基質(zhì)增生，但未出現(xiàn)明顯腎小球硬化。

同時(shí)CCl4也是IgA腎病大鼠模型的造模藥物之一，劉劍剛等[13]用牛血清白蛋白（BSA）注射液聯(lián)合脂多糖（LPS）溶液及CCl4+蓖麻油混合液建立大鼠IgA腎病模型，發(fā)現(xiàn)大鼠腎臟病理改變明顯，主要表現(xiàn)為腎小球增生，基底系膜增生和系膜基質(zhì)增寬，出現(xiàn)了不同程度的系膜細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，且腎小管間質(zhì)纖維化明顯，腎小管萎縮。這與本研究中大鼠腎臟的病理改變不同，HRS模型大鼠腎臟病理改變主要包括腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮和臟層上皮細(xì)胞增生腫脹，系膜細(xì)胞和基質(zhì)增生，但腎間質(zhì)無明顯改變。而IgA腎病模型大鼠腎小管萎縮，間質(zhì)纖維化明顯。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)BSA可造成大鼠體內(nèi)免疫系統(tǒng)損傷，導(dǎo)致Th1與Th2比例失衡，引起IgA過量分泌，而LPS通過誘導(dǎo)IgA和補(bǔ)體3沉積于系膜區(qū)，引起大鼠蛋白尿，從而導(dǎo)致腎小管硬化和腎間質(zhì)纖維化。馬羅奇[14]研究發(fā)現(xiàn)CCl4具有高度的肝靶向性，因此可造成明顯的肝纖維化，對(duì)于腎臟的作用有限，僅引起結(jié)締組織增生和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，這也與本研究的病理檢查結(jié)果相符。CCl4雖然是IgA腎病模型的造模藥物之一，但對(duì)于腎臟損傷作用有限，因此建立IgA腎病模型仍需多因素造模法。

根據(jù)2017年《肝硬化腹水及相關(guān)并發(fā)癥的診療指南》[15]提出的HRS診斷標(biāo)準(zhǔn)：在肝硬化的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)進(jìn)行性少尿或無尿、氮質(zhì)血癥、Cr升高，而腎臟病理檢查無明顯器質(zhì)性改變。本研究結(jié)果顯示，8周組大部分大鼠肝臟病理檢查結(jié)果顯示出現(xiàn)肝硬化，并且Cr、BUN增高，尿量降低，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但腎臟組織病理檢查沒有明顯變化。

綜上所述，皮下注射CCl4是建立HRS大鼠模型具有可行性，在第8周末可獲得較為理想的模型。