李 瑾 曠龍昊 王 婷 黃 滔 閆曉河,*

1.暨南大學第二臨床醫(yī)學院 (廣東 深圳 518000)

2.暨南大學附屬深圳眼科醫(yī)院眼底病科 (廣東 深圳 518040)

顆粒狀角膜營養(yǎng)不良(granular corneal dystriphy，GCD)是常染色顯性角膜營養(yǎng)不良疾病，其臨床表型及遺傳學特征具有高度特異性。近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，基因鑒定技術得到更廣泛的推廣，對遺傳性疾病的診斷提供了確切可靠的依據(jù)。本研究旨在對兩例GCD患者的突變基因進行篩查鑒定，這對于患者診斷和分型具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料在暨南大學附屬深圳眼科醫(yī)院收集兩例顆粒狀角膜營養(yǎng)不良患者，兩名患者均為中青年女性，臨床表現(xiàn)為反復出現(xiàn)的角膜刺激癥狀伴視力下降。本研究經(jīng)過暨南大學深圳附屬眼科醫(yī)院倫理委員會批準，患者簽署基因檢測知情同意書。

1.2 方法抽取兩名患者的外周血各2mL，試管內用乙二胺四已酸抗凝。從受檢者外周血樣本中提取基因組DNA，采用韋翰斯生物定制的探針，基于探針雜交捕獲的方法，捕獲并富集目標基因的外顯子及毗鄰剪接區(qū)域(約20bp)。構建好的文庫經(jīng)質檢后，通過高通量測序儀(Illumina HiSeq X)進行雙端測序測序。下機的原始數(shù)據(jù)經(jīng)質控后獲得Clean data，使用BWA軟件通過與參考基因組比對分析，經(jīng)過GATK軟件call出其中的SNV和InDel變異，再用Clinvar、HGMD等專業(yè)數(shù)據(jù)庫和預測軟件進行注釋分析，篩選與受檢者表型一致的變異位點。

1.3 眼科學檢查對受檢者進行眼科檢查，包括視力、眼壓，眼前節(jié)裂隙燈及前置鏡檢查眼底；輔助檢查包括眼前段照相。

2 結 果

2.1 受檢者眼部臨床特征及治療患者1是一名38歲女性，主因“雙眼畏光、紅痛伴視力下降14d”來院。雙眼戴鏡矯正視力0.6。裂隙燈下檢查發(fā)現(xiàn)雙眼結膜充血(++)，角膜上皮糜爛，淺層基質可見灰白色點狀混濁，合成大小不等點片狀、雪花狀混濁(圖1A～圖1B)，前房軸深4CT，周邊前房深1/2CT，房水清，瞳孔圓，對光反射靈敏，晶狀體密度增高，玻璃體輕度混濁，眼底：視盤界清，色淡紅，C/D約0.3，視網(wǎng)膜動靜脈比約為2∶3，視網(wǎng)膜平伏，黃斑中心凹反光可見。臨床診斷為：角膜炎ou，角膜營養(yǎng)不良ou。治療上以營養(yǎng)角膜和保護角膜上皮滴眼液為主。

患者2是一名39歲女性，以相同的雙眼紅痛、畏光、流淚主訴來我院門診就診。眼科查體顯示：Vod 0.6++0.75DC×60矯正0.9；Vos 0.9矯正無助，裂隙燈下檢查發(fā)現(xiàn)角膜上皮糜爛，基質層可見白色混濁，呈大小不等環(huán)狀、雪花狀、線條樣混濁(圖1C～1D)。臨床診斷：角膜營養(yǎng)不良ou，予以小牛血去蛋白提取物滴眼液及玻璃酸鈉滴眼液保護營養(yǎng)角膜上皮對癥治療。

兩位患者均在近5年反復發(fā)生角膜上皮糜爛伴角膜刺激癥狀，角膜基質層出現(xiàn)白色點片狀混濁(圖1)，視力出現(xiàn)不同程度受損，臨床上以對癥治療為主。

圖1 顆粒狀角膜營養(yǎng)不良患者角膜臨床特征。患者1角膜淺層基質受累，可出現(xiàn)多個小而清晰圓形的灰白色顆粒，呈放射狀及旋渦狀，不累及角膜緣(圖1A～圖1B)。患者2 角膜基質層可見白色混濁，呈大小不等環(huán)狀、雪花狀、線條樣混濁，未累及角膜緣(圖1C～圖1D)。

2.2 GCD患者的基因突變篩查通過目標序列捕獲高通量測序技術篩選281個眼科疾病相關基因，經(jīng)PCR一代測序鑒定核實患者1TGFBI基因存在雜合錯義變異c.1663C>T:p.R555W(圖2A)，患者2發(fā)TGFBI基因存在雜合錯義變異c.371G>A:p.R124(圖2B)。

圖2 顆粒狀角膜營養(yǎng)不良患者基因檢測結果。TGFBI基因測序圖。圖2A：患者1雜合突變位點c.1663C>T:p.R555W;圖2B：患者2 雜合突變位點c.371G>A:p.R124。

3 討 論

角膜營養(yǎng)不良是遺傳性角膜疾病,是一組雙眼性、原發(fā)性的有病理組織特征改變的疾病[1-2]。其中顆粒狀角膜營養(yǎng)不良是一組常見的常染色體顯性遺傳性角膜營養(yǎng)不良，主要由TGFBI基因突變導致[3]。TGFBI基因，即轉化生長因子β誘導基因，位于染色體5q31.1，基因全長2804bp，包含17個外顯子，編碼683個氨基酸。TGFBI基因編碼角膜上皮素，又稱KE蛋白。KE蛋白的表達異常將導致各型GCD，但是在各個類型角膜營養(yǎng)不良中的發(fā)病機制至今仍不明確[4]。

根據(jù)解剖學分類，GCD屬于上皮-基質TGFBI相關營養(yǎng)不良[2]，GCD廣義上可分為四型，包括：典型顆粒狀角膜營養(yǎng)不良(granular corneal dystrophy type 1，GCD1)、 顆粒狀角膜營養(yǎng)不良2型(granular corneal dystrophy type2，GCD2)、Reis-Bücklers角膜營養(yǎng)不良(Reis-Bu?cklers corneal dystrophy，RBCD)和Thiel-Behnkes角膜營養(yǎng)不良(Thiel-Behnkes corneal dystrophy，TBCD)。在我國，GCD 4種類型中GCD1最多，GCD2其次[5]。

TGFBI基因上R555W突變常導致典型顆粒狀角膜營養(yǎng)不良即1型GCD(GCD1)，該型發(fā)病年齡最早可小于10歲，早期視力通常不會受到影響，角膜尚透明，表現(xiàn)為淺層基質受累，可出現(xiàn)多個小而清晰的灰白色顆?；鞚?，呈放射狀及旋渦狀，不累及角膜緣。一般無角膜上皮層糜爛，癥狀不明顯[6]。隨著年齡增長，基質層的混濁相互融合并向下累及深層基質，顆粒增大，呈現(xiàn)雪花樣外觀，晚期延伸至角膜緣，患者在此時會出現(xiàn)明顯的癥狀，從早期的眩光，畏光到晚期由于角膜上皮反復糜爛導致上皮凹凸不平進而導致散光及視力下降。電鏡顯示基質層蛋白沉積呈現(xiàn)“蟲蝕樣”外觀[6]。

TGFBI基因的R124H位點突變常導致顆粒狀角膜營養(yǎng)不良2型(GCD2)。該類型最開始于1992年由意大利的Avellino醫(yī)生所報道，又被稱為“ Avellino角膜營養(yǎng)不良(Avellinocornea ldytrophy，ACD)”[7]。后來發(fā)現(xiàn)在日本、韓國等亞洲地區(qū)更常見，故被ICD3更名為GCD2。該類型發(fā)病通常晚于其他GCD類型，癥狀輕，且疾病進展緩慢，通常不發(fā)生角膜上皮糜爛[8]。平均來說，GCD2患者的視力好于GCD1。早期表現(xiàn)為角膜中央少量混濁，后期裂隙燈下可見“中空的”環(huán)狀混濁及“毛玻璃樣”混濁，部分患者呈“手指狀排列”其混濁特征表現(xiàn)為范圍的擴大，而不是數(shù)量增多。病理學顯示角膜基質層透明質及淀粉樣蛋白沉積。此外，與雜合子患者相比，純合子患者發(fā)病更早，進展更快，角膜表面呈灰白色混濁，視力在幼年時經(jīng)常受損，需要及時行角膜移植手術治療[9]。

此外，GCD的其他兩種類型。包括在四種類型中病變最重的RBCD，可蔓延至角膜緣的地圖狀混濁，角膜上皮反復糜爛，多在5歲內起病，多與TGFBI基因的R124L位點突變相關。TBCD，又稱蜂窩狀角膜應營養(yǎng)不良，臨床表現(xiàn)與RBCD相似，角膜呈蜂窩狀混濁是其標志特征，可累計除角膜緣1mm～2mm內的所有角膜前彈力層及基質，通常為TGFBI基因的12號外顯子R555Q位點突變所致[6-10]。

本研究中兩名患者均表現(xiàn)為典型顆粒狀角膜營養(yǎng)不良，臨床上表現(xiàn)為反復出現(xiàn)的角膜上皮糜爛伴角膜刺激癥狀，針對患者臨床表現(xiàn)及眼科學檢查，對其進行了目標基因二代測序，發(fā)現(xiàn)其中患者1為TGFBI上雜合錯義變異c.1663C>T:p.R555W，具有典型GCD1以角膜淺層基質雪花狀混濁的特征表現(xiàn)。而患者2則被發(fā)現(xiàn)GCD2的罕見雜合錯義變異c.371G>A:p.R124，其角膜基質層具有環(huán)狀、雪花狀、線條樣混濁。本研究在基因水平上進一步證實TFGBI基因與GCD的相關性，對研究中國人GCD發(fā)病的分子致病機理有一定意義。另外，GCD致病基因位點很多，基因型與臨床表型之間缺乏明確的對應關系，采用第二代高通量測序大大簡化了基因檢測流程，現(xiàn)已在臨床逐步開展[11]。該測序通過目標序列捕獲測序技術利用基因探針的捕獲目標區(qū)域，再對目標基因外顯子及毗鄰剪接區(qū)域富集，最后用第二代測序技術進行測序。這種測序方法更高效，成本更低，在遺傳病研究和基因檢測中具有重要的作用。

目前臨床上針對反復發(fā)作角膜瘢痕化，散光大嚴重影響視力的患者，主要手術治療方式包括治療性準分子激光角膜切削術 (phototherapeutic keratectomy，PTK)、穿透性角膜移植術(penetrating keratoplasty，PK)、板層角膜移植術(lamellar keratoplasty，LK)、同種穿透性角膜中央-角膜緣成形術。其中，PTK是臨床上常用的治療GCD的方式，但其較易復發(fā)，PK復發(fā)率較低，但其排斥反應發(fā)生率高[1]。此外，角膜接觸鏡、局部滴眼液等作為輔助治療方式，但僅能解決角膜上皮糜爛引起的刺激癥狀，對視力的提高無明顯改善。對于此類基因所致的角膜上皮營養(yǎng)不良疾病，基因治療是其主要根治方法。未來基因治療及3D人工角膜打印等新技術的發(fā)展將會為遺傳性角膜致盲性疾病的治療帶來新的突破。

本研究分析了兩例顆粒狀角膜營養(yǎng)不良女性患者的臨床特征，利用高通量測序結合PCR測序鑒定其分別存在c.1663C>T:p.R555W及c.371G>A:p.R124雜合位點突變，并通過基因檢測結果對該疾病進行分型，對研究我國GCD分子遺傳學及其致病機制具有一定的意義。