馮 群，田 忠，高嘉敏，李笑駒，夏 嬙

0 引 言

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是臨床當(dāng)前難以治愈的腫瘤之一，是全球公認(rèn)的第三大惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率隨著人類發(fā)展進(jìn)程的增加而增長[1]，在全球范圍內(nèi)其疾病負(fù)擔(dān)均持續(xù)加劇。目前，臨床針對該疾病尚無特效根治方法，主要是以靶向治療為主，目的是改善患者的病情，延緩腫瘤進(jìn)展，然而常規(guī)化療藥物嚴(yán)重的毒副作用對患者造成了極大的身心傷害，并且癌細(xì)胞也可能對常規(guī)化療藥物不敏感或產(chǎn)生耐藥性[2]。因此，如何提高CRC的治療效果且有效緩解化療耐藥的問題已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)[3]，現(xiàn)今，學(xué)者們已將抗腫瘤藥物的研發(fā)轉(zhuǎn)向天然產(chǎn)物領(lǐng)域，期望找到一種高選擇性、高理想治療指數(shù)的生物源性抗癌藥物，有望推動迫在眉睫的CRC治療現(xiàn)狀。

抗菌肽是一類小分子多肽，具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒等微生物感染和介導(dǎo)炎性介質(zhì)的釋放及殺傷癌細(xì)胞等多種生物學(xué)功能[4]。其天然來源非常廣泛，有細(xì)菌、植物、昆蟲和魚類等，昆蟲作為地球上最多的群體，昆蟲源抗菌肽無疑也是最豐富的[5]，并且其中超過55%的具備抑癌作用，結(jié)合抗癌肽獨(dú)特而復(fù)雜的作用機(jī)制，以致于它們不僅可以選擇性殺傷惡性細(xì)胞、還可避免產(chǎn)生對微生物和癌細(xì)胞耐藥性，因此備受科研工作者們的關(guān)注。黑水虻(Black soldier fly，HermetiaillucensL.)作為一種與家蠅和黃粉蟲齊名的雙翅目水虻科(Stratiomyidae)腐生昆蟲，全球范圍廣泛分布[6]，幼蟲因長期于高濃度的病原體環(huán)境中的生存，自身形成了強(qiáng)大的免疫防御功能，即在血淋巴產(chǎn)生了大量的抗菌肽[7]。首次針對黑水虻來源抗菌肽的研究是在2013年[8]，該報(bào)道成功引起了學(xué)者們對黑水虻源肽的注意[9]。近年來，通過學(xué)者們的努力，黑水虻抗菌肽已在大腸埃希菌及畢赤酵母X-33中得到成功表達(dá)，并證實(shí)了其對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌及真菌良好的抑菌活性[10]，與其他昆蟲來源肽如cecropins、Bmattacin2、Defensins和Melittin等報(bào)道相一致[11-14]。然而，目前關(guān)于黑水虻抗菌肽抑癌活性的研究鮮有報(bào)道。本課題結(jié)合前期黑水虻抗菌肽對鼻咽癌CNE2細(xì)胞和結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞均具有抑制作用，且對正常紅細(xì)胞不溶血的基礎(chǔ)上[15]，進(jìn)一步探討黑水虻抗菌肽活性組分對HCT-8細(xì)胞增殖抑制的作用機(jī)制，希望能為其后續(xù)在CRC藥物治療方面的應(yīng)用提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料黑水虻抗菌肽粗提物(課題組由黑水虻5齡幼蟲血淋巴提取獲得)；乙腈(北京化工廠)；三氟乙酸(北京化工廠)；LB培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱生物科技有限公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO 公司)；DMEM培養(yǎng)基(GIBCO 公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁公司)。

1.2供試細(xì)菌及細(xì)胞株大腸埃希菌(NCTC12900)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)購自南京興潤生物技術(shù)有限公司；結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-8)和正常人胚腎細(xì)胞(HEK293)標(biāo)準(zhǔn)株均購于中國科學(xué)院上海ATCC細(xì)胞庫。

1.3儀器高效液相色譜儀(RD-JY-030，日本島津公司)；超凈工作臺(SW-CJ-2FD，蘇凈集團(tuán)安泰公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(JC303，上海成順儀器儀表有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(HF90/HF240，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)；全波段酶標(biāo)儀(Multiskan Go，Thermo公司)；流式細(xì)胞儀(CyFlow Cube，德國Partec公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 黑水虻抗菌肽分離純化先將黑水虻抗菌肽粗提物通過相對分子量為10 000及3000超濾離心管，將離心后獲得的抗菌肽粗提物利用分析型RP-HPLC進(jìn)行分離純化，色譜柱型號 ODS-C18，規(guī)格：10 mm×150 mm,10 μm，色譜條件：先用0.1%TFA平衡色譜柱；流動相A: 超純水(含0.1%TFA)，流動相B: 80%乙腈(含0.1%TFA)，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長214 nm，流速1 mL/min，柱溫21 ℃。按照出峰時間收集各峰所對應(yīng)的組分。

1.4.2黑水虻抗菌肽活性組分篩選將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌配制成3.2×1012個/mL濃度的菌液，各吸取50 μL放于制備好的LB固體培養(yǎng)基中，用涂布棒均勻涂布，待菌液干后，向接好菌的培養(yǎng)皿中放入直徑為6 mm的無菌紙片，每組4個重復(fù)，每個培養(yǎng)皿設(shè)陽性對照組(硫酸慶大霉素)、陰性對照組(等滲鹽水)和實(shí)驗(yàn)組(組分HI-1、HI-2、HI-3)，實(shí)驗(yàn)組在紙片上加25 μL各組分，陰性對照組加等體積的等滲鹽水；將培養(yǎng)皿做好標(biāo)記,放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察并測量抑菌圈的大小。

1.4.3紅細(xì)胞溶血率檢測在96孔板中分別加入50 μL 2%以等滲鹽水配制的豚鼠紅細(xì)胞懸液，再分別向?qū)嶒?yàn)組加入50 μL以等滲鹽水配制濃度分別為62.5、125、250、500和1000 μg/mL的抗菌肽HI-3，陰性對照組加入等量等滲鹽水，陽性對照組加入等量純水，每組設(shè)4個重復(fù)。放入培養(yǎng)箱中孵育1 h，取出后1000×g離心5 min，吸60 μL上清至新的96孔板中，利用酶標(biāo)儀測定414 nm處吸光度(A)值，溶血率計(jì)算公式：

溶血率(%)=(A(實(shí)驗(yàn)孔)-A(陰性孔))/(A(陽性孔)-A(陰性孔))×100

1.4.4增殖抑制率檢測取對數(shù)期HCT-8和HEK293細(xì)胞，胰蛋白酶消化，制成濃度為7×104個/mL的細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液以100 μL/孔接種于96孔板，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)，待貼壁后吸出原培養(yǎng)基，向各實(shí)驗(yàn)孔中加入100 μL抗菌肽活性組分HI-3溶液，濃度分別是100、200、400 μg/mL，陰性對照組加入等量常規(guī)培養(yǎng)基，每組設(shè)4個重復(fù)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。干預(yù)24 h后，向每孔各加入10 μL CCK-8反應(yīng)試劑，放于培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育1.5 h，酶標(biāo)儀測定每孔細(xì)胞在波長490 nm處的A值，并分別計(jì)算HI-3對癌細(xì)胞及正常細(xì)胞的增殖抑制率，計(jì)算公式如下：

抑制率(%)=[A(陰性對照組)-A(實(shí)驗(yàn)組)]/A(陰性對照)×100

1.4.5細(xì)胞周期檢測按1.4.4 方法重懸細(xì)胞，將HCT-8細(xì)胞懸液以2 mL/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后棄去原培養(yǎng)基，向培養(yǎng)板中加入1.5 mL以5% FBS培養(yǎng)基配制的抗菌肽HI-3溶液，濃度同1.4.4，以不加HI-3的培養(yǎng)基為對照。繼續(xù)培養(yǎng)36 h，吸出原培養(yǎng)基至15 mL離心管中，PBS洗滌細(xì)胞。吸取300 μL不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，179×g離心3 min，棄上清。用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，離心并制備細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液加至有1 mL預(yù)冷的70%乙醇的試管中，固定細(xì)胞。將固定后細(xì)胞離心，去除乙醇，再加入500 μL預(yù)先配好的染色液，室溫避光反應(yīng)30 min，流式細(xì)胞儀檢測。

2 結(jié) 果

2.1 黑水虻抗菌肽粗提物分離純化將課題組提取所得抗菌肽粗提物用分析型RP-HPLC進(jìn)行分離純化，見圖1。色譜圖中有3個分離度較好的色譜峰，分別命名為HI-1、HI-2和HI-3，按照出峰時間，分離純化洗脫峰HI-1、HI-2、HI-3對應(yīng)組分，并真空冷凍干燥，于-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 黑水虻抗菌肽粗提物RP-HPLC分析結(jié)果

2.2黑水虻抗菌肽活性組分篩選利用藥敏紙片法篩選抗菌肽活性組分。組分HI-1、HI-2對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌均未表現(xiàn)出抑菌作用，與陰性對照比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。然而，組分HI-3對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌均表現(xiàn)出良好的抑菌活性,與HI-1、HI-2及陰性對照相比顯著增加(P<0.05)；但HI-3對金黃色葡萄球菌及大腸埃希菌的抑菌活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 組分HI-1、HI-2、HI-3的抑菌活性

2.3抗菌肽活性組分HI-3對紅細(xì)胞溶血性的影響由圖可以看出，抗菌肽 HI-3對豚鼠正常紅細(xì)胞幾乎不溶血，當(dāng)HI-3的濃度達(dá)500 μg/mL時，溶血率達(dá)最大，僅為(0.16±0.07)%，與其他濃度處理組和陰性對照組(等滲鹽水)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 抗菌肽HI-3對紅細(xì)胞影響

2.4抗菌肽活性組分HI-3對對HEK293和HCT-8細(xì)胞增殖的影響不同濃度的活性組分HI-3對HEK293細(xì)胞增殖的影響均較小，當(dāng)濃度為400 μg/mL時，抑制率達(dá)到最大僅為(11.24±0.05)%，與其他濃度處理組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。然而，HI-3對HCT-8細(xì)胞增殖的影響則比較顯著，其抑制率隨著HI-3處理濃度的增加而增大，當(dāng)HI-3濃度達(dá)50 μg/mL及以上時，與同濃度處理組HEK293細(xì)胞的抑制率相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；當(dāng)HI-3處理濃度達(dá)到400 μg/mL時抑制率達(dá)最大，為(60.11±0.75)%，明顯高于其他濃度處理組(P<0.01)。見圖3。

與相同濃度HI-3處理后的HEK293細(xì)胞比較，*P<0.05、**P<0.01

2.5抗菌肽活性組HI-3對HCT-8 細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞儀檢測抗菌肽HI-3對HCT-8 細(xì)胞周期的影響，結(jié)果見圖4和表2。隨著抗菌肽HI-3處理濃度的增加，HCT-8細(xì)胞在G0/G1期的比例明顯增加，在400 μg/mL濃度時達(dá)到最大，為(63.53±0.62)%；G2/M期的細(xì)胞比例隨處理濃度的增加明顯減小，變化呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性；S期細(xì)胞的比例在低濃度(0～200 μg/mL)增大，高濃度(400 μg/mL)時減小，呈現(xiàn)先增加后下降的變化趨勢。說明抗菌肽HI-3在低濃度時阻滯HCT-8細(xì)胞于G0/G1期和S期，高濃度僅阻滯HCT-8細(xì)胞于G0/G1期，提示抗菌肽HI-3可能是通過影響DNA 的復(fù)制和有絲分裂，進(jìn)而影響HCT-8細(xì)胞的增殖。

a: 0 μg/mL; b: 100 μg/mL; c: 200 μg/mL; d: 400 μg/mL

表2 抗菌肽HI-3對HCT-8 細(xì)胞周期的影響

3 討 論

近年來，隨著人們對天然AMP作為潛在新藥的興趣日益濃厚[16]，國內(nèi)外已有許多針對抗菌肽抗癌活性的研究，且這些抗癌肽大多具備細(xì)胞選擇性，對正常宿主紅細(xì)胞不溶血，無毒物蓄積等特性；如Wang等[17]報(bào)道temporin-1 CEa 對乳腺癌細(xì)胞具有不同程度的抑制作用，而對正常人紅細(xì)胞和人臍靜脈平滑肌細(xì)胞無明顯抑制作用；Abdel-Salam等[18]首次證實(shí)了陽離子α螺旋抗菌肽LyeTxI-B具有對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87-MG的毒性作用，但對人正常成纖維細(xì)胞無毒副作用；Abbas等[19]的研究也顯示陽離子嵌合肽cLFcHI-3mera對軟骨肉瘤和大腸癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷作用，但對正常細(xì)胞殺傷作用較弱。本研究結(jié)果亦表明，黑水虻抗菌肽活性組分HI-3對HCT-8細(xì)胞的抑制作用顯著，且對豚鼠紅細(xì)胞及正常HEK293細(xì)胞無明顯作用，與前面所列舉研究結(jié)果相一致，表明抗菌肽HI-3同樣具有良好的藥用開發(fā)潛力，也將會是臨床常規(guī)化療藥物不可比擬的。

研究表明，抗菌肽通過不同的機(jī)制發(fā)揮作用,如膠束化、納米結(jié)構(gòu)的自組裝和膜孔的形成以及細(xì)胞周期的阻滯等等，其中，細(xì)胞周期包括分裂期(M期)和間期(G1、S、G2期)，每個時期都與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切關(guān)聯(lián)，任何一個時期出錯，均可能影響腫瘤細(xì)胞的增殖與分化過程。迄今為止，已相繼有大量關(guān)于抗菌肽作用細(xì)胞周期的報(bào)道，如天蠶素cecropinXJ阻滯肝癌Huh-7細(xì)胞于S期，以劑量和時間依賴的方式抑制其生長[20]；抗菌肽17BIPHE2亦阻滯A549細(xì)胞于S期，誘導(dǎo)該細(xì)胞發(fā)生凋亡[21]；Cecropin則通過上調(diào)周期調(diào)控蛋白CHK1和CDK2的表達(dá)，聯(lián)合阻滯細(xì)胞周期于S期，進(jìn)而影響人乳腺癌MCF-7細(xì)胞DNA的合成，間接發(fā)揮抗腫瘤的效應(yīng)。家蠅抗菌肽MLL-2作用MCF-7細(xì)胞時，阻滯細(xì)胞周期于G2/M期[22]；而家蠅抗真菌肽-1A (MAF-1A)作用人肝癌HepG2細(xì)胞、家蠅胚胎細(xì)胞抗菌肽作用白血病K562細(xì)胞和抗菌肽Hymenochirin-1B作用肺腺癌A549細(xì)胞則均是通過停滯周期于G0/G1期發(fā)揮作用[23-25]。然而，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果則顯示：抗菌肽HI-3在低濃度(≤200 μg/mL)處理時，阻滯HCT-8細(xì)胞周期于G0/G1期和S期，在高濃度(400 μg/mL)處理時，僅阻滯HCT-8細(xì)胞周期于G0/G1期，提示抗菌肽HI-3可能在細(xì)胞分裂間期通過影響HCT-8細(xì)胞的DNA復(fù)制和相關(guān)蛋白合成，從而抑制其細(xì)胞增殖。但由于本研究僅是體外的初步研究，是否如此，具體機(jī)制如何，還需進(jìn)一步深入研究。

在這項(xiàng)研究中，盡管黑水虻抗菌肽表現(xiàn)出了良好的研究價值和應(yīng)用前景，但要將其轉(zhuǎn)化為臨床，前方仍然有一條慢長的路要走。原因主要有黑水虻抗菌肽天然提取難度極大，分離純化后抗菌肽活性不高及后續(xù)溶解度低等問題[26]，已嚴(yán)重阻礙了本抗菌肽的進(jìn)一步研究，以使得我們的研究至今還停留在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)階段。若要進(jìn)一步深入研究黑水虻抗菌肽的具體作用機(jī)制，首先第一步就是要保證活性的同時實(shí)現(xiàn)抗菌肽的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[27]，并解決溶解度低等問題。屆時，黑水虻抗菌將是抗腫瘤藥物的最佳且有效的替代品，繼而為人類的健康保駕護(hù)航。