何 穎，雷 梓，李 庚，喻 意，楊 園，劉 慧，潘國慶

0 引 言

研究表明胃癌發(fā)生與幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)感染密切相關(guān)[1]。流調(diào)資料顯示在不同的地域,胃癌發(fā)生率差異顯著,東亞地區(qū)人群胃癌發(fā)生率較高,而在非洲和南亞地區(qū),雖然Hp感染率很高,但胃癌發(fā)生率卻較低，西方人群Hp感染率為30%，Hp相關(guān)性胃炎患者中最終發(fā)生胃癌者僅占0.1%～1%[2-3]，提示不同遺傳背景的個體在相同的環(huán)境暴露下其胃癌的易感性不同。這種易感性目前被認(rèn)為是由個體的遺傳因素所決定，其中最常見莫過于單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphism，SNP)，SNP是個體間遺傳差異的主要形式。神經(jīng)軸突導(dǎo)向分子5A(Semaphorin 5A，SEMA5A)在多種病理生理過程中發(fā)揮重要作用[4]，我組前期研究已發(fā)現(xiàn)SEMA5A與Hp感染及胃癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)[5-8]。既往研究發(fā)現(xiàn)SEMA5A基因rs7702187位點(diǎn)的多態(tài)性是中國西部人群帕金森病的高風(fēng)險因素(P=0.20，OR=0.87，95%CI=0.79～0.96)[9]。但目前SEMA5A基因SNPs與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究較為有限，未有SEMA5ASNPs與胃癌易感性關(guān)系的報道。故本研究基于臨床病例對照研究方法，探討SEMA5A基因SNP位點(diǎn)在胃癌患者和健康者的分布特點(diǎn)，同時研究SEMA5A基因多態(tài)性和Hp感染在胃癌發(fā)生中的交互作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象選取2018年10月至2020年10月在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院確診為胃癌的230例患者病歷資料和血液，對照組為同期在我院體檢的健康體檢者250例。所有研究對象來自云南地區(qū)漢族人群，年齡 37～89歲，胃癌組平均年齡(60.03±1.52)歲，對照組平均年齡(61.43±0.79)歲，胃癌組Hp陽性134例(58.3%)，Hp陰性96例(41.7%)；對照組Hp陽性97例(38.8%)，Hp陰性153例(61.2%)。所有患者均經(jīng)胃鏡和病理診斷確診為胃癌，病例收集標(biāo)準(zhǔn)：為原發(fā)性胃癌，且既往均無腫瘤遺傳病史，均未進(jìn)行過放療和化療，排除繼發(fā)性或復(fù)發(fā)性腫瘤及其他惡性腫瘤；對照組與胃癌組患者的年齡、性別情況相匹配，2組對象無血緣關(guān)系。所有研究對象均了解所有研究內(nèi)容并簽訂知情同意書，并經(jīng)過昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)[批準(zhǔn)號(201809-25)]。

1.2 試劑和儀器ELISA試劑盒(福建三強(qiáng)公司試劑盒)；DNA 提取試劑盒(南京諾唯贊生物)；9700 型PCR 擴(kuò)增儀(美國ABI公司)；3730XL基因測序儀(美國Applied Biosystems公司)。

1.3 采集和保存每位研究對象抽取約4 mL空腹外周靜脈血于EDTA-K2抗凝管中，室溫靜置20 min，400 × g離心5 min分離血清血漿，分裝后置-20 ℃冰箱保存。

1.4 Hp感染檢測應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測血清中Hp-IgG抗體，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書方法進(jìn)行。如果Hp-IgG濃度>20 U/mL為陽性，判定為Hp感染。

1.5 樣本基因組 DNA 的提取嚴(yán)格按照DNA提取試劑盒試劑說明書提取基因組 DNA，將DNA產(chǎn)物保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 SNPs位點(diǎn)的選擇通過查詢HapMap國際人類基因組數(shù)據(jù)庫和dbSNP數(shù)據(jù)庫，以及查詢SEMA5A基因多態(tài)性相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，共獲取了該基因30個多態(tài)性位點(diǎn)，通過單核苷酸多態(tài)性選擇的一般原則，篩選了能夠代表SEMA5A基因大部分SNPs的6個標(biāo)簽SNPs(rs693487、rs6896702、rs788469、rs805153、rs1024489、rs2696371)。

1.7 TaqMan探針法進(jìn)行基因分型

1.7.1 TaqMan探針的設(shè)計與合成根據(jù)NCBI網(wǎng)站上的SEMA5A基因相關(guān)信息，使用引物探針設(shè)計軟件Primer Premier v6.0，設(shè)計TaqMan-MGB的探針和引物，引物序列信息見表1。

表1 設(shè)計和合成的TaqMan探針及引物序列

1.7.2 PCR(polymerase chain reaction)檢測分型反應(yīng)體系：DNA模板1.0 μL，PCR Premix Taq(2x)5.0 μL，上、下游引物(上海生工生物工程技術(shù)公司合成)及MGB探針各0.2 μL，最后用雙蒸水補(bǔ)足至總反應(yīng)體積為10.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性5 mim，95 ℃ 變性10 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。為了質(zhì)量控制，隨機(jī)抽取5%的樣品進(jìn)行檢測，分型符合率達(dá)到100%，以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.8 SNaPshot法進(jìn)行基因分型為了驗(yàn)證TaqMan-MGB探針SNP基因分型方法的準(zhǔn)確性，我們隨機(jī)抽取兩組各100個樣本，使用SNaPshot方法對SEMA5A基因進(jìn)行了基因分型。

1.8.1 引物設(shè)計合成根據(jù)SNaPshot引物設(shè)計原理設(shè)計了用于單堿基延伸的6條緊鄰各個SNP位點(diǎn)的延伸引物。見表2、表3。

表2 PCR擴(kuò)增引物序列

表3 PCR延伸引物序列

1.8.2 PCR檢測分析PCR反應(yīng)總體積為15 μL：模板DNA 1.0 μL，上下游引物各0.15 μL,10×Taq Plus Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 2 μL，Taq Plus DNA聚合酶0.25 μL，加入 ddH2O補(bǔ)足至15 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 3 min，變性94 ℃ 15 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s, 30個循環(huán)后，最后72 ℃延伸3 min，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳提純后放入PCR擴(kuò)增儀，進(jìn)行延伸反應(yīng)。延伸后產(chǎn)物于3730XL基因測序儀測序。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS Statistics軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。用t檢驗(yàn)比較胃癌組和對照組的年齡。采用χ2檢驗(yàn)檢測胃癌組與對照組之間吸煙狀況、飲酒史和Hp感染之間存在的差異。用卡方檢驗(yàn)分析胃癌組和對照組的多態(tài)性分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。使用logistic回歸分析計算OR和95% CI，根據(jù)年齡、性別、吸煙狀況、飲酒史和Hp感染進(jìn)行了調(diào)整，對其進(jìn)行分層。以P≤0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料比較胃癌組及健康對照組的性別、年齡、飲酒、吸煙等方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，胃癌組的Hp感染率與對照組相比明顯偏高(P=0.023)，見表4。

表4 胃癌組和對照組間的一般特征

2.2 各基因型在胃癌組及對照組中的分布及與胃癌發(fā)生關(guān)系

2.2.1 Hardy-Weinberg 平衡定律檢驗(yàn)經(jīng)檢驗(yàn)SEMA5A基因的6個SNP位點(diǎn)各組基因型統(tǒng)計結(jié)果均P>0.05，則認(rèn)定6個SNP位點(diǎn)胃癌組和對照組的等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律，研究對象來自于同一人群。

2.2.2 各位點(diǎn)基因多態(tài)性分布分析rs805153位點(diǎn)的3種基因型在胃癌組與對照組分布有顯著差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.01)。TT基因型在經(jīng)年齡、性別、Hp感染調(diào)整后OR值為2.74(95%CI:0.35-3.83,P<0.01)。而在隱性模型中，與CC基因型相比，TT+TC基因型也與患癌風(fēng)險有關(guān)(P<0.01，OR=2.40，95% CI:1.28-2.96)。而rs693487、 rs6896702、rs788469、rs1024489、rs2696371這5個SNP位點(diǎn)的基因型在2組間分布均差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)，見表5。

表5 SEMA5A基因多態(tài)性與胃癌風(fēng)險的關(guān)系[n(%)]

2.2.3 rs805153位點(diǎn)的分層分析rs805153位點(diǎn)進(jìn)一步分層進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析顯示：TT+TC基因型與CC基因型相比，與男性胃癌的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)，經(jīng)多因素校正后OR值為1.33(95%CI:0.81-2.23)。而在感染Hp時，TT+TC基因型也與胃癌的風(fēng)險有關(guān)，經(jīng)多因素調(diào)整后OR值為1.97(95%CI: 0.28-1.40)。其余因素年齡、吸煙史、飲酒史與胃癌發(fā)生風(fēng)險無關(guān)聯(lián)。見表6。

表6 胃癌組與對照組SEMA5A rs805153多態(tài)性及Logistic回歸分析

3 討 論

SEMA5A屬于神經(jīng)軸突導(dǎo)向分子SEMAs家族成員之一，位于人染色體5p15.2，全長51.8 kb，可作為血管生成，轉(zhuǎn)移過程中細(xì)胞遷移和癌細(xì)胞器官特異性歸巢所必需的分子[10]。多項(xiàng)研究表明，SEMA5A作為一種胃癌相關(guān)基因，在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)并且可以上調(diào)癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移生物學(xué)活性[6]。Hp感染可引起一系列癌前病變，是已知胃癌最大的危險因素。大量國內(nèi)外研究證明，發(fā)生胃癌的風(fēng)險取決于Hp菌株特異性毒力因子、宿主基因型、環(huán)境因素(如飲食)以及免疫反應(yīng)等，這些因素之間相互作用將影響Hp長期定植的結(jié)果[11-12]。我組進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)SEMA5A在Hp陽性的胃癌組織中表達(dá)明顯高于Hp陰性的胃癌組織，且Hp感染后在不同分子水平可以上調(diào)胃癌細(xì)胞株SEMA5A的表達(dá)，并且存在劑量-時間依賴性[13]，這表明SEMA5A可能參與Hp相關(guān)性胃癌。據(jù)統(tǒng)計，有20%的胃癌患者有胃癌家族史，根據(jù)種族或族裔群體，有胃癌家族史胃癌發(fā)生的風(fēng)險增加了2～3倍[14]，這表明有胃癌家族史是一個重要的胃癌危險因素。胃癌病例有家族性聚集現(xiàn)象，這也說明了遺傳多態(tài)性的重要性。

我們通過對SEMA5A基因6個SNP位點(diǎn)的基因型進(jìn)行檢測，分析了Hp感染與SEMA5A基因多態(tài)性在胃癌發(fā)生過程中的交互作用。SEMA5A基因存在較多的多態(tài)性位點(diǎn)，多項(xiàng)臨床研究已證實(shí)SEMA5A基因的多態(tài)性位點(diǎn)與多種神經(jīng)疾病有關(guān)，如rs7702187與帕金森病、rs194085與自閉癥等[15-17]。全基因組關(guān)聯(lián)分析也發(fā)現(xiàn)人染色體上SEMA5A附近的基因間SNP與自閉癥譜系障礙顯著關(guān)聯(lián)。我們的研究結(jié)果顯示SEMA5A基因的rs693487、rs2696371 SNP位點(diǎn)與胃癌發(fā)生及Hp感染無關(guān)聯(lián)；SEMA5A基因的rs6896702、rs788469、rs1024489 SNP位點(diǎn)雖與胃癌發(fā)生及Hp感染無關(guān)系，但在性別方面與胃癌風(fēng)險相關(guān)；SEMA5A基因rs805153位點(diǎn)與胃癌發(fā)生風(fēng)險及Hp感染相關(guān)，TT基因型明顯增加患胃癌風(fēng)險，且與Hp感染關(guān)聯(lián)。近年來，在對Hp相關(guān)性胃癌分子水平多態(tài)性研究更是熱點(diǎn)，Jia等[18]發(fā)現(xiàn)Hp感染與基因多態(tài)性在胃癌發(fā)生中的相互作用，Hp感染增加了遺傳基因易感性，導(dǎo)致DNA損傷和基因異常甲基化促進(jìn)胃癌發(fā)生。Hong等[19]認(rèn)為攜帶IL-1β基因多態(tài)性的人群在Hp感染后更易發(fā)生胃癌。研究報道遺傳基因多態(tài)性與Hp感染發(fā)生交互作用致胃癌的過程中，依據(jù)Hp感染的狀態(tài)不同胃癌易感性有所不同[20-22]。這些研究都表明胃癌發(fā)生過程中存在基因-環(huán)境交互作用模式。然而，關(guān)于SEMA5A基因多態(tài)性與胃癌間關(guān)系的還未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。本研究存在一些不足：首先，樣本量相對較小，這可能會限制統(tǒng)計效果，尤其是在多重分層分析；其次，一些潛在的因素，如飲食、體育鍛煉和胃病史，未納入本研究的分析，這可能影響胃癌的發(fā)生風(fēng)險；最后，僅對其在癌癥發(fā)生中的潛在功能作用的進(jìn)行推測，但缺少功能驗(yàn)證。本研究結(jié)論需要大量的實(shí)驗(yàn)研究來驗(yàn)證。

綜上所述，SEMA5Ars805153位點(diǎn)與Hp感染以及胃癌發(fā)生風(fēng)險具有相關(guān)性，且在男性人群較為顯著，這為胃癌高危人群的發(fā)現(xiàn)、胃癌的預(yù)防和早期診斷提供候選分子，為進(jìn)一步研究胃癌發(fā)生機(jī)制提供新的理論依據(jù)。