盛華棟 張水峰 崔海容 葉明立，3

(1.浙江方圓檢測(cè)集團(tuán)股份有限公司， 杭州 310018；2.武昌理工大學(xué)， 武漢 430223；3.浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院， 杭州 310015)

喹諾酮類藥物作為一類廣譜性抗生素被用于預(yù)防和治療傳染性疾病，并在畜牧業(yè)中大量使用。然而，禽畜、水產(chǎn)與蛋制品中殘留的痕量喹諾酮類藥物潛在的促使了耐藥細(xì)菌甚至是超級(jí)耐多藥細(xì)菌的形成，進(jìn)而對(duì)人類內(nèi)分泌系統(tǒng)帶來危害。近年來，發(fā)現(xiàn)抗生素在蔬菜中違法使用的現(xiàn)象，如在豆芽中使用甲硝唑、恩諾沙星、諾氟沙星等，其主要目的是用于殺菌消毒和防止根部腐爛。2019年，浙江省衛(wèi)健委和浙江省市場(chǎng)監(jiān)督管理局分別組織開展了針對(duì)豆芽中抗生素殘留的專項(xiàng)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)結(jié)果表明豆芽中存在違規(guī)使用喹諾酮類、硝基咪唑類獸用抗生素藥物的情況。因此開展蔬菜中喹諾酮類藥物殘留的分離純化與檢測(cè)技術(shù)研究，對(duì)于蔬菜中喹諾酮類藥物殘留分析具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[1,2]。

目前，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因其高選擇性與高靈敏度而被應(yīng)用于喹諾酮類藥物殘留的檢測(cè)[3-9]。然而，在采用固相萃取(SPE)技術(shù)對(duì)蔬菜樣品進(jìn)行分離凈化過程中，仍有極少的共流出組分對(duì)喹諾酮類藥物的離子化效率產(chǎn)生抑制，進(jìn)而對(duì)喹諾酮類藥物的定性與定量分析產(chǎn)生不同程度的影響[10]。除此之外，采用SPE小柱處理蔬菜樣品時(shí)，尚需要對(duì)SPE小柱進(jìn)行活化、淋洗和洗脫等諸多操作步驟，耗時(shí)較長(zhǎng)，不利于大批量樣品的快速分析。

本實(shí)驗(yàn)利用分散固相萃取(dSPE)技術(shù)，采用自制的納米TiO2修飾COFs材料為dSPE吸附劑，將均質(zhì)后的蔬菜樣品與納米TiO2修飾COFs材料一起研磨后經(jīng)萃取溶劑提取，一步實(shí)現(xiàn)蔬菜樣品中喹諾酮類藥物殘留的萃取與凈化，極大提高了樣品前處理效率。在此基礎(chǔ)上，利用液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式在10.0 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)了對(duì)蔬菜樣品中包括恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星、氟甲喹、惡喹酸、馬波沙星、沙拉沙星、達(dá)氟沙星、雙氟沙星、氟羅沙星、西諾沙星、伊諾沙星、萘啶酸、奧比沙星與吡哌酸等17種喹諾酮類藥物的高靈敏同時(shí)測(cè)定。實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)優(yōu)化了萃取溶劑與納米TiO2修飾COFs材料用量等實(shí)驗(yàn)條件，所建立的dSPE -LC-MS/MS 方法操作簡(jiǎn)單、省時(shí)高效、靈敏度高，適用于蔬菜樣品中喹諾酮類藥物殘留的快速分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Prominence UFLC XR型超快速高分離液相色譜儀配有LC-20AD輸液泵、SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20AC柱溫箱和DGU-20A3脫氣機(jī)；API 5500型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀和 Analyst 1.6.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。Legend RT型離心機(jī)；全玻璃溶劑過濾器。

甲酸、乙酸銨、甲醇、乙腈均為HPLC級(jí)；超純水(18.2 MΩ·cm)；恩諾沙星(含量大于98.0%)、環(huán)丙沙星(含量大于98.0%)、氧氟沙星(含量大于98.0%)、培氟沙星(含量大于98.0%)、諾氟沙星(含量大于98.0%)、洛美沙星(含量大于98.0%)、氟甲喹(含量大于98.0%)、惡喹酸(含量大于98.0%)、馬波沙星(含量大于98.0%)、沙拉沙星(含量大于98.0%)、達(dá)氟沙星(含量大于98.0%)、雙氟沙星(含量大于98.0%)、氟羅沙星(含量大于98.0%)、西諾沙星(含量大于98.0%)、伊諾沙星(含量大于98.0%)、萘啶酸(含量大于98.0%)與奧比沙星(含量大于98.0%)等17種標(biāo)準(zhǔn)品外購(gòu)。

納米TiO2修飾COFs材料為實(shí)驗(yàn)室自制，制備方法見文獻(xiàn)[11]。

1.2 色譜條件

色譜柱：Shim-pack XR-ODS II (150 mm×2.0 mm i.d., 2.2 μm)；流動(dòng)相：A相：水相(0.1%甲酸的水溶液)；B相：乙腈。梯度洗脫程序：0→2.00 min，10→60.0% B；2.00→5.00 min，60→90.0% B；5.00→7.50 min，90.0% B；7.50→8.00 min，90.0→10% B；8.00→10.00 min，10%B；流速：0.3 mL/mim；進(jìn)樣量2.0 μL。

1.3 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；定量檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)；電噴霧電壓(IS)：5500 V(正離子模式)；霧化氣壓力(GS1)：50.0 psi；輔助氣流速(GS2)：50.0 psi；氣簾氣壓力(CUR)：40.0 psi；碰撞氣(CAD)：7.0 psi；離子源溫度(TEM)：500℃；掃描時(shí)間：30 ms；碰撞室出口電壓(CXP)：11.0 V；碰撞室入口電壓(EP)：10.0 V；定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碰撞氣能量(CE)及去簇電壓(DP)見表1。外標(biāo)法定量。

表1 目標(biāo)物的定性定量離子對(duì)及錐孔電壓、碰撞能量、離子掃描模式

1.4 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分別準(zhǔn)確稱取一定量的恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星、氟甲喹、惡喹酸、馬波沙星、沙拉沙星、達(dá)氟沙星、雙氟沙星、氟羅沙星、西諾沙星、伊諾沙星、萘啶酸與奧比沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)至5.0 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，得到混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，其中恩諾沙星、氧氟沙星、洛美沙星、氟甲喹、惡喹酸、馬波沙星、達(dá)氟沙星、雙氟沙星、氟羅沙星、西諾沙星、伊諾沙星、萘啶酸與奧比沙星的濃度為100.0 mg/L；環(huán)丙沙星、培氟沙星、諾氟沙星與沙拉沙星的濃度為500.0 mg/L。

1.5 樣品制備與凈化

稱取2.0 g 均質(zhì)后的蔬菜樣品于10 mL 離心管中，加入50 mg 納米TiO2修飾COFs材料，隨后加入8.0 mL 0.1%甲酸乙腈溶液，渦旋1.0 min；10000 r/min離心5.0 min，上清液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶，并以0.1%甲酸乙腈溶液定容至刻度，用0.22 μm聚四氟乙烯微孔濾膜過濾，供LC-MS/MS分析。

1.6 空白基質(zhì)加標(biāo)系列的配制

稱取一組均質(zhì)后的空白基質(zhì)樣品各2.0 g，向其中分別添加17種喹諾酮混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，配制不同濃度的基質(zhì)加標(biāo)系列工作溶液，其中：恩諾沙星、氧氟沙星、洛美沙星、氟甲喹、惡喹酸、馬波沙星、達(dá)氟沙星、雙氟沙星、氟羅沙星、西諾沙星、伊諾沙星、萘啶酸與奧比沙星的濃度為0.2-20 μg/kg；環(huán)丙沙星、培氟沙星、諾氟沙星與沙拉沙星的濃度為1.0～100 μg/kg。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取溶劑的優(yōu)化

鑒于本實(shí)驗(yàn)dSPE方法所用的吸附劑為納米TiO2修飾COFs材料，在其表面富含羥基功能基團(tuán)，在一定條件下，易于含有氮、氧等活性基團(tuán)的喹諾酮類藥物發(fā)生氫鍵相互作用而吸附在納米TiO2修飾COFs材料表面，進(jìn)而導(dǎo)致其在去除蔬菜樣品中色素與糖類等雜質(zhì)的同時(shí)，有可能吸附喹諾酮類藥物，從而使得待測(cè)喹諾酮類藥物的回收率偏低。因此，本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)考察了含有不同濃度甲酸的乙腈溶液對(duì)喹諾酮類藥物回收率的影響，結(jié)果如圖1所示。隨著乙腈溶液中甲酸濃度的增加，17種喹諾酮類藥物的回收率逐漸增大。當(dāng)其含量增加至0.1% (v/v)時(shí)，17種喹諾酮類藥物的回收率增至最大值(>76.0%)。這一現(xiàn)象可以解釋為：在采用乙腈作為萃取溶劑時(shí)，喹諾酮類藥物中的部分含氮基團(tuán)與納米TiO2修飾COFs材料表面的羥基之間產(chǎn)生氫鍵相互作用，部分喹諾酮類藥物被吸附在納米TiO2修飾COFs材料表面，致使其回收率降低；當(dāng)在乙腈中加入一定量的甲酸時(shí)，喹諾酮類藥物中的含氮基團(tuán)被質(zhì)子化，形成-NH3+陽離子，抑制了其與納米TiO2修飾COFs材料表面的-OH之間氫鍵的形成，進(jìn)而促使其回收率增加。本文選取含有0.1% (v/v)甲酸乙腈溶液作為蔬菜樣品中17種喹諾酮類藥物的最佳萃取溶劑。

2.2 吸附凈化時(shí)間的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)選擇dSPE法作為蔬菜樣品的凈化方法，在保證17種喹諾酮類藥物回收率的前提下，應(yīng)在盡可能短的時(shí)間內(nèi)完成蔬菜樣品中喹諾酮類藥物的提取與凈化。因此，本實(shí)驗(yàn)考察了納米TiO2修飾COFs材料與蔬菜樣品的吸附時(shí)間對(duì)17種喹諾酮類藥物回收率的影響。結(jié)果表明：吸附凈化時(shí)間對(duì)于17種喹諾酮類藥物的回收率無顯著影響，在1.0～10.0 min范圍內(nèi)，其回收率穩(wěn)定在76.2%～117.0%范圍。本實(shí)驗(yàn)選擇1.0 min為吸附凈化時(shí)間。

2.3 吸附劑用量的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)采用納米TiO2修飾COFs材料為dSPE方法的吸附劑，主要目的在于保證喹諾酮類藥物回收率的同時(shí)，利用較少的納米TiO2修飾COFs材料有效地去除樣品中色素與糖類等基質(zhì)干擾物。為了獲得納米TiO2修飾COFs材料的最佳用量，實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)考察了納米TiO2修飾COFs材料用量在10.0 mg～60.0 mg范圍內(nèi)，其對(duì)17種喹諾酮類藥物回收率的影響，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)吸附劑用量為10.0 mg時(shí)，17種喹諾酮類藥物的回收率在46.1%～68.3%范圍。這主要是由于蔬菜樣品中未被去除的色素與糖類等干擾物對(duì)目標(biāo)分析物的基質(zhì)抑制效應(yīng)引起的。隨著吸附劑用量的增加，基質(zhì)抑制效應(yīng)逐漸減弱；當(dāng)吸附劑用量為40.0 mg～50.0 mg時(shí)，17種喹諾酮類藥物的回收率穩(wěn)定在78.1%～109%范圍。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)選取50.0 mg 納米TiO2修飾COFs材料為吸附劑的最佳用量。

2.4 校正曲線、檢出限、定量限、精密度與回收率

為了驗(yàn)證17種喹諾酮類藥物在乙腈/甲酸水溶液流動(dòng)相體系中的線性關(guān)系，配制了質(zhì)量濃度為0.2～20 μg/kg的恩諾沙星、氧氟沙星、洛美沙星、氟甲喹、惡喹酸、馬波沙星、達(dá)氟沙星、雙氟沙星、氟羅沙星、西諾沙星、伊諾沙星、萘啶酸與奧比沙星和質(zhì)量濃度為1.0～100 μg/kg的環(huán)丙沙星、培氟沙星、諾氟沙星與沙拉沙星的基質(zhì)加標(biāo)系列。每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果表明，17種喹諾酮類藥物在0.2 μg/kg～100 μg/kg內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系(r2>0.9990)；采用在空白基質(zhì)中添加目標(biāo)組分的方法，依據(jù)色譜峰的信噪比(S/N) 大于3倍確定檢出限(LOD)，S/N大于10倍確定定量限(LOQ)，得到17種喹諾酮類藥物的LOD和LOQ分別為0.033μg/kg～0.23 μg/kg和0.11 μg/kg～0.76 μg/kg，結(jié)果見表2。

以市售西紅柿為空白基質(zhì)，17種喹諾酮類藥物的低、中、高加標(biāo)水平：恩諾沙星、氧氟沙星、洛美沙星、氟甲喹、惡喹酸、馬波沙星、達(dá)氟沙星、雙氟沙星、氟羅沙星、西諾沙星、伊諾沙星、萘啶酸與奧比沙星的加標(biāo)濃度為：0.4μg/kg、4.0μg/kg、16.0μg/kg；環(huán)丙沙星、培氟沙星、諾氟沙星與沙拉沙星的加標(biāo)濃度為2.0 μg/kg、20 μg/kg、80μg/kg，各進(jìn)行9次的回收率和重復(fù)性的平行試驗(yàn)，加標(biāo)樣品的MRM圖譜如圖3所示。結(jié)果表明：17種喹諾酮類藥物在低、中、高3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為76.9%～118%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.6%～7.3% (見表2)。

表2 17種喹諾酮類藥物的保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限與定量限

續(xù)表2

圖3 17種喹諾酮類藥物加標(biāo)樣品的MRM圖譜(出峰時(shí)間同表1)

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

應(yīng)用所建立的方法對(duì)市售的不同種類的蔬菜樣品，包括西紅柿、黃瓜、大白菜、豆芽等共120份樣品進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明：在所檢測(cè)的蔬菜樣品樣品中，5份豆芽樣品檢出諾氟沙星，其含量為：0.62 μg/kg～5.22 μg/kg，其它樣品均未檢出17種喹諾酮類藥物(小于方法定量限)。其中1份陽性樣品的MRM色譜圖如圖4所示。

圖4 陽性樣品的MRM圖譜

3 結(jié)論

建立了一種dSPE-LC-MS/MS同時(shí)檢測(cè)蔬菜中17種喹諾酮類藥物殘留的分析方法。結(jié)果表明：以自制的納米TiO2修飾COFs材料為dSPE的吸附劑可有效去除蔬菜中的色素與糖類等雜質(zhì)，樣品凈化一步完成，極大地縮短了樣品前處理時(shí)間。采用空白基質(zhì)加標(biāo)工作曲線進(jìn)行定量分析，提高了方法的靈敏度和準(zhǔn)確度。該方法可適用于蔬菜中17種喹諾酮類藥物殘留的快速分析。