陳海濱 王立姣 趙鵬 趙建軍 譚超

(河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院 1.泌尿外二科;2.呼吸內(nèi)二科;3.胸外科,河北 邯鄲 056004)

透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌臨床常見[1-2]，盡管治療手段取得了重要的進(jìn)步，但其5年生存率仍然較低[3-4]。基因的異常表達(dá)是腎腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的重要分子遺傳因素[5-6]。近年學(xué)者發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮PAS結(jié)構(gòu)域包含蛋白-1(EPAS-1)與腫瘤的形成有關(guān)。EPAS-1又稱低氧誘導(dǎo)因子2α(HIF-2α)，是1997年克隆出的含有HLH-PAS的蛋白，是缺氧的主要轉(zhuǎn)錄因子，在低氧時(shí)引起酶或基因變化發(fā)揮促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用[7]。EPAS-1主要在低氧區(qū)域誘導(dǎo)癌基因表達(dá)、調(diào)節(jié)細(xì)胞異型增生促進(jìn)血管新生，主要是為適應(yīng)細(xì)胞微環(huán)境中的低氧狀態(tài)[8]。目前EPAS-1在透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌中的研究鮮少，其與細(xì)胞增殖的關(guān)系尚需要闡明。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年1月～2017年7月在我院確診為透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌并行手術(shù)治療的患者78例。其中男40例，女38例，年齡43～85歲，中位年齡60歲。腫瘤最大徑(0.6～9.5)cm，平均(4.3±1.1)cm；分級(Fuhrman)：Ⅰ級9例，Ⅱ級34例，Ⅲ級29例，IV級6例；其中30例伴有腎竇累犯，48例無腎竇累犯。均留取術(shù)后新鮮的腫瘤組織作為觀察組，留取距腫瘤標(biāo)本肉眼可見的邊緣>3 cm的正常腎組織作為對照組，樣本均于-80℃冰箱中凍存。納入標(biāo)準(zhǔn)：①首次發(fā)病并手術(shù)治療，術(shù)后病理為透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌，并符合WHO中的標(biāo)準(zhǔn)及分型。②臨床及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①診斷不明確或病理形態(tài)中伴有異源性上皮或間葉分化的腫瘤。②術(shù)前行放、化療。③伴有其它器官嚴(yán)重的內(nèi)科系統(tǒng)疾病?；颊呋蚣覍俸灦ㄖ橥鈺?，研究符合《赫爾辛基宣言》中的相關(guān)要求，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 選擇人腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞系和人腎皮質(zhì)近曲小管上皮HK-2細(xì)胞系，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。培養(yǎng)基PRMI1640及胎牛血清購自Gibco公司；ECL顯色液購自Thermo公司；EPAS-1、GAPDH、PCNA、二抗和DAB購自蘇州睿贏生物技術(shù)公司；CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物公司；RIPA裂解液、胰酶消化液、質(zhì)粒提取試劑盒、二抗及DAB購自武漢三鷹生物公司；載體和引物均由蘇州吉瑪基因生物公司合成，酶標(biāo)儀為Thermo公司生產(chǎn)的MK3，PCR儀為美國Bio Rad IQ5。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞的構(gòu)建和培養(yǎng) 液氮中取出人腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞系和人腎皮質(zhì)近曲小管上皮HK-2細(xì)胞系，冰上復(fù)蘇，應(yīng)用10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基，在37℃、5%的CO2濃度的孵育箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長融合度至80%左右時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL接種于12孔板中，每孔1 mL。選擇人腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞系，設(shè)計(jì)小干擾RNA EPAS-1質(zhì)粒并構(gòu)建質(zhì)脂體載體轉(zhuǎn)染建立小干擾RNA EPAS-1組(siRNA EPAS-1組)，并設(shè)立786-0細(xì)胞系的空白對照組(NC組)。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測EPAS-1 mRNA的表達(dá)。Trizol提取總RNA后應(yīng)用 Nanodrop2000微量紫外分光光度計(jì)測量提取的總RNA濃度和純度。引物序列：上游：TACGTGTGCCCGGTTACGTCGACCG，下游：TCGGGTTAAAGGCCAGATAGTAGAG。以RNU6B為內(nèi)參基因，引物序列：上游：TCGTGATA GTGATGATCCAGCCA，下游：CGTAGTAGTAC AGATAGTAGATGA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件：16℃ 30 min；42℃ 30 min，85℃ 5 min后，4℃恒溫。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1min，30個(gè)循環(huán)后進(jìn)行延伸。讀取Ct值，以2-ΔΔCt法表示結(jié)果，以RQ進(jìn)行定量分析。

1.3.3 免疫組化實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用免疫組化SP法檢測組織中EPAS-1和PCNA蛋白的表達(dá)。切取4 μm切片，嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)步驟加入一抗和二抗后行DAB顯色。操作由同一主管技師完成，做好質(zhì)控工作，減少人為誤差。EPAS-1的顯色部位是細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜，以黃色-棕褐色為陽性。以二維評分法進(jìn)行定量(著色強(qiáng)度和陽性率)。著色強(qiáng)度：無著色為0分，弱為1分，中為2分，強(qiáng)為3分。陽性率：選擇5個(gè)高倍(400倍)視野進(jìn)行觀察，取平均值，陽性率<5%為0分，5%～10%為1分，以11%～25%為2分，以26%～50%為3分，以>50%為4分[9-10]。二者相乘為最終評分，總分范圍0～12分。以≤3分為陰性，以>3分為陽性。計(jì)算陽性率。PCNA的表達(dá)部位是細(xì)胞核，以黃色--棕褐色為陽性，選擇熱點(diǎn)區(qū)進(jìn)行觀察，共選擇5個(gè)高倍(400倍)視野計(jì)算陽性率，取平均值，其陽性率即為增殖指數(shù)。

1.3.4 Western Blot實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用Western Blot法檢測EPAS-1和PCNA的表達(dá)。以GAPDH為對照，基于新鮮組織，提取總蛋白，BAC法行蛋白濃度測定，SDS-PAGE凝膠配置后上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。利用Odessey紅外熒光成像儀掃描PVDF膜，以GAPDH為對照，分析灰度值，進(jìn)行結(jié)果分析。

1.4 術(shù)后隨訪 患者均進(jìn)行術(shù)后3年生存時(shí)間的隨訪，截止時(shí)間點(diǎn)為2020年7月31日。

2 結(jié)果

2.1 兩組中EPAS-1表達(dá)陽性率的比較 觀察組中EPAS-1的陽性率高于對照組(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 兩組中EPAS-1表達(dá)陽性率的比較[n(×10-2)]

圖1 EPAS-1的表達(dá)(IHC SP法)

2.2 EPAS-1在觀察組不同臨床病理特征中表達(dá)陽性率的比較 EPAS-1的陽性率在不同F(xiàn)uhrman分級、腫瘤最大徑及PCNA增殖指數(shù)的表達(dá)中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而在有無腎竇累犯、不同性別及年齡分組的表達(dá)中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖2。

表2 EPAS-1在觀察組不同臨床病理特征中表達(dá)陽性率的比較[n(×10-2)]

圖2 腫瘤中PCNA的表達(dá)(400×)

2.3 觀察組中EPAS-1的表達(dá)與生存時(shí)間的相關(guān)性 隨訪截止發(fā)現(xiàn)存活49例，死亡28例(其中1例因腦出血死亡，1例為意外死亡，均計(jì)為刪失值)，失訪1例。應(yīng)用K-M生存分析顯示EPAS-1的表達(dá)與生存時(shí)間有關(guān)(2=4.0213，P=0.0210)。見圖3。

圖3 EPAS-1表達(dá)的生存分析

2.4 人腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞系和人腎皮質(zhì)近曲小管上皮HK-2細(xì)胞系中EPAS-1蛋白和mRNA的表達(dá)比較 Western Blot結(jié)果顯示人腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞系中EPAS-1蛋白的表達(dá)明顯高于人腎皮質(zhì)近曲小管上皮HK-2細(xì)胞系(P<0.05)；RT-PCR結(jié)果顯示人腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞系中EPAS-1 mRNA的表達(dá)明顯高于人腎皮質(zhì)近曲小管上皮HK-2細(xì)胞系(P<0.05)。見表3、圖4、圖5。

表3 兩組細(xì)胞系中EPAS-1蛋白和mRNA表達(dá)的比較

圖4 EPAS-1蛋白的表達(dá)

2.5 人腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞系的siRNA EPAS-1組和NC組中PCNA蛋白和mRNA的表達(dá)比較 Western Blot結(jié)果顯示，siRNA EPAS-1組中PCNA蛋白的表達(dá)明顯低于NC組(P<0.05);RT-PCR結(jié)果顯示siRNA EPAS-1組中PCNA mRNA的表達(dá)明顯低于NC組(P<0.05)。見表4、圖6、圖7。

表4 siRNA EPAS-1組和NC組中PCNA蛋白和mRNA的表達(dá)比較

圖6 siRNA EPAS-1組和NC組中PCNA蛋白的表達(dá)

圖7 PCNA mRNA的表達(dá)

3 討論

透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌病變形成與基因和遺傳因素有關(guān)[11]。EPAS-1是從小鼠下丘腦細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中克隆出的全長cDNA序列[12]，其開放閱讀框2607bp，編碼869個(gè)氨基酸，分子量為96.5kDa[13-14]。EPAS-1的基因定位于染色體的2p16-21，共有15個(gè)外顯子、14個(gè)內(nèi)含子[15]，5′-端與AHR基因的內(nèi)含子具有高度保守性，3′-端只有1個(gè)內(nèi)含子[16]。EPAS-1與家族的同一成員HIF-1α具有相似的生化和轉(zhuǎn)錄活性。研究顯示在缺氧條件下，兩種蛋白質(zhì)均能快速增多，而氧恢復(fù)后均快速下降[17]。同時(shí)抗氧化劑(NMPG)、蛋白酶體抑制劑等的處理也能引起細(xì)胞內(nèi)兩種蛋白的增加，而H2O2能引起兩者表達(dá)的下降[18-19]。EPAS-1與HIF-1α的不同點(diǎn)表現(xiàn)為兩種蛋白質(zhì)含量不一樣，一般來說，腫瘤細(xì)胞內(nèi)EPAS-1含量較高，而HIF-1α主要表達(dá)在間質(zhì)細(xì)胞和組織細(xì)胞內(nèi)。EPAS-1和HIF-1α調(diào)控下游因子可能不同，EPAS-1主要是調(diào)控PCNA介導(dǎo)的細(xì)胞增殖，表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞增殖的特性，而HIF-1α主要是調(diào)控VEGF介導(dǎo)的血管生成，表現(xiàn)為間質(zhì)的支持作用。EPAS-1對腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的作用不如HIF-1α的作用強(qiáng)[20]。

本研究結(jié)果顯示,透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌中EPAS-1的表達(dá)明顯高于正常腎組織，人腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞系中EPAS-1蛋白和mRNA的表達(dá)明顯高于人腎皮質(zhì)近曲小管上皮HK-2細(xì)胞系，提示EPAS-1高表達(dá)是腫瘤形成的重要促進(jìn)因素，即EPAS-1具有癌基因樣的作用。且EPAS-1表達(dá)的陽性率在不同腫瘤最大徑及PCNA增殖指數(shù)的表達(dá)中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，siRNA EPAS-1組中PCNA蛋白和mRNA的表達(dá)明顯低于人腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞系，提示EPAS-1高表達(dá)是腫瘤細(xì)胞增殖的重要促進(jìn)因子，抑制EPAS-1的表達(dá)能減弱腫瘤細(xì)胞的增殖，提示EPAS-1參與腫瘤細(xì)胞的分裂增生及腫瘤生長。結(jié)果顯示EPAS-1的表達(dá)與腫瘤的Fuhrman分級相關(guān)，由于Fuhrman分級與腫瘤進(jìn)展及預(yù)后相關(guān)，因此EPAS-1表達(dá)升高是腫瘤進(jìn)展及不良預(yù)后的重要指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)觀察到EPAS-1的表達(dá)與生存時(shí)間有關(guān)，也進(jìn)一步明確了EPAS-1與預(yù)后的關(guān)系。但是EPAS-1對預(yù)后的具體判斷價(jià)值尚需要進(jìn)行多中心、多因素及大樣本分析后進(jìn)一步明確。EPAS-1的異常表達(dá)對mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯均有重要的調(diào)節(jié)作用，并能調(diào)控核質(zhì)的運(yùn)輸，引起細(xì)胞增殖及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[21]。EPAS-1在發(fā)揮功能時(shí)也常受很多因素的影響，如應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞微環(huán)境的改變等。也有研究認(rèn)為EPAS-1是誘導(dǎo)癌基因形成的因子之一，對細(xì)胞的浸潤性生長有重要促進(jìn)作用[22]。EPAS-1能與AHR相互作用，與缺氧反應(yīng)元件(5′-TACGTGCG-3′)結(jié)合，上調(diào)缺氧因子的表達(dá)。蛋白酶體的抑制劑能引起細(xì)胞內(nèi)EPAS-1的活性改變，可以消除細(xì)胞內(nèi)活性氧改變，使EPAS-1的表達(dá)升高[23-24]。EPAS-1也具有腫瘤血管生成的促進(jìn)作用，腫瘤進(jìn)展過程中的缺氧環(huán)境能使EPAS-1的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[25]。EPAS-1可提高其下游糖酵解酶基因的表達(dá)，影響腫瘤的失控性增殖和能量代謝[26]。

4 結(jié)論

EPAS-1在腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)升高，在不同臨床病理特征中的表達(dá)有差別。EPAS-1可能對腫瘤細(xì)胞增殖有一定促進(jìn)作用。檢測EPAS-1的表達(dá)可能與腫瘤的預(yù)后有關(guān)。