趙景宏 劉濤 喬彥 張榮驛 鄧建平 王浩宇

(南充市中心醫(yī)院 1.心內(nèi)科;2.內(nèi)分泌科，四川 南充 637000)

心血管疾病(Cardiovascular disease，CVD)是慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD)最常見(jiàn)的并發(fā)癥，是慢性腎臟病患者的主要死亡原因。然而，心臟疾病和腎臟疾病相互作用的具體機(jī)制仍不清楚[1-4]。硫酸吲哚酚(IS)是一種尿毒癥毒素，其在體內(nèi)的累積與腎功能下降有關(guān)。尤其是晚期CKD患者血清中IS水平的增高與患者預(yù)后及CVD事件的風(fēng)險(xiǎn)明顯相關(guān)[5-6]。研究證實(shí)IS參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，因?yàn)樗梢酝ㄟ^(guò)增強(qiáng)氧化應(yīng)激導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂[7]。此外體外研究也顯示IS可通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和NF-kB(Nuclear factor-kappa B)信號(hào)通路促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大[8-9]。

MicroRNA(miRNA)是一種高度保守的非編碼RNA,可通過(guò)與靶基因3′-非編碼區(qū)(3′UTR)特異性結(jié)合調(diào)節(jié)基因表達(dá)，導(dǎo)致翻譯抑制或靶基因mRNA降解。miRNA已被證實(shí)在心血管疾病包括心肌梗死、心肌肥大和心肌缺血再灌注中發(fā)揮重要作用[10-13]。然而，由于miRNA可調(diào)節(jié)多個(gè)潛在靶基因，所以許多miRNA在心血管疾病中的作用還有待明確。既往研究表明過(guò)表達(dá)miR-223-3p可減輕缺血/再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，促進(jìn)心臟功能的恢復(fù)，然而其具體作用機(jī)制尚不清楚[14]。本研究探討miR-223-3p在IS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞活力的影響及其作用機(jī)制，以期為心血管疾病的治療提供新的作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與H9c2細(xì)胞損傷模型的建立 H9c2細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(Manassas, VA, USA)。H9c2細(xì)胞在含有5%CO2和95%潮濕空氣環(huán)境中培養(yǎng)，室溫為37℃。培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清(Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)、100 μg/mL鏈霉素和100單位/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基。H9c2細(xì)胞損傷模型建立如下：設(shè)空白對(duì)照組(不作任何處理)和不同濃度IS組(濃度分別為50、100、200、400、800 μmol/L)，培養(yǎng)24 h后檢測(cè)細(xì)胞活力。結(jié)果表明IS濃度為400 μmol/L時(shí)細(xì)胞相對(duì)活力最接近50%，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)IS組濃度選擇400 μmol/L。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-223-3p mimic, miR-223-3p mimic NC, NLRP3過(guò)表達(dá)載體pcDNA-NLRP3和空載體NLRP3 NC由GenePharma公司合成 (Shanghai, China)。根據(jù)制造商的說(shuō)明，用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)將其轉(zhuǎn)染到六孔板中的H9c2細(xì)胞。培養(yǎng)6～8 h后，用含有10%FBS的新鮮DMEM替換培養(yǎng)基再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK8 H9c2細(xì)胞以每孔5000個(gè)細(xì)胞的密度種植在96孔板，適當(dāng)處理后混合10 μL CCK-8溶液和90 μL無(wú)血清DMEM，室溫下孵育2 h。根據(jù)制造商的說(shuō)明，用CCK-8法(Shanghai Beyotime Biotechnology, Shanghai, China)測(cè)定細(xì)胞活力。然后用微孔板讀取器在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度(OD)值。根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行不同分組，檢測(cè)IS對(duì)細(xì)胞活力的影響時(shí)分為空白對(duì)照組(不作任何處理)，陰性對(duì)照組(加入生理鹽水)和IS組。檢測(cè)miR-223-3p對(duì)細(xì)胞活力的影響時(shí)分為空白對(duì)照組(不作任何處理)、陰性對(duì)照組(miR-223-3p NC)和miR-223-3p過(guò)表達(dá)組(miR-223-3p mimic)。檢測(cè)NLRP3對(duì)細(xì)胞活力的影響時(shí)分為空白對(duì)照組(不作任何處理)、陰性對(duì)照組(NLRP3 NC)和NLRP3過(guò)表達(dá)組(pcDNA-NLRP3)。檢測(cè)miR-223-3p通過(guò)調(diào)控NLRP3增強(qiáng)細(xì)胞活力時(shí)分為空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組(miR-223-3p NC)，miR-223-3p過(guò)表達(dá)組(miR-223-3p mimic)和miR-223-3p過(guò)表達(dá)+NLRP3過(guò)表達(dá)組(miR-223-3p mimic+pcDNA-NLRP3)。

1.4 RT-qPCR 使用Trizol試劑(invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc)從H9c2細(xì)胞中提取總RNA,并用nanodrop(nanodrop Technologies; Thermo Fisher Scientific, Inc.)測(cè)定RNA濃度。根據(jù)制造商的說(shuō)明使用5X all-in-one rT MasterMix試劑盒(abmgoodchina inc.)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后使用evagreen 2X qPcr MasterMix-low rox試劑盒在aBi 7500PCR檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行檢測(cè)。引物序列如下：。2-ΔΔCT法評(píng)價(jià)基因相對(duì)表達(dá)水平。miR-223-3P:F: 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′,R: 5′-CGGGCT GTCAGTTTGTCA-3′;Caspase-1:F：5′-GCCTTGCC CTCATAATCT-3′, R：5′-ACATCTGGGACTTCTT CG-3′。檢測(cè)IS對(duì)miR-223-3P表達(dá)的影響，分組如下：空白對(duì)照組(不作任何處理)，陰性對(duì)照組(加入生理鹽水)和IS組。

1.5 Western blot 培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞在RIPA(Beyotime institute of Biotechnology)裂解緩沖液中裂解，通過(guò)BCA法(Beyotime institute of Biotechnology)檢測(cè)總蛋白濃度。含有50 μg的蛋白樣品在6%～10%SDS-PAGE凝膠上電泳分離，再將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上。室溫下用5%脫脂牛奶在TBS-0.05% Tween-20溶液中封閉1 h,然后在4℃下加NLRP3一抗(1∶1000稀釋；cat. no. ab98151)培養(yǎng)過(guò)夜。用PBS液洗滌3次，加二抗孵育2 h。蛋白質(zhì)的表達(dá)用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法和Tanon-5200化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)了miR-223-3p對(duì)NLRP3蛋白表達(dá)的影響，分組如下：空白對(duì)照組(不作任何處理)和miR-223-3p過(guò)表達(dá)組(miR-223-3p mimic)。

1.6 熒光素酶報(bào)告分析法 熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒psiCHECK- NLRP3-3′-UTR野生型(WT)和psiCHECK- NLRP3-3′-UTR突變型(MUT)由上?；蛑扑幱邢薰緲?gòu)建，在NLRP3的3′-UTR中含有野生型和突變型miR-223-3p結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染到H9c2細(xì)胞。24 H后使用Nano-Glo Promega熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)(Promega, Madison, WI,USA)檢測(cè)熒光素酶活性。分組如下：陰性對(duì)照組(NC，加入生理鹽水)和miR-223-3p過(guò)表達(dá)組(miR-223-3p，轉(zhuǎn)染miR-223-3p mimic)。

1.7 ELISA法 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)H9c2細(xì)胞上清液中Caspase-1和IL-1β的表達(dá)水平。根據(jù)制造商的說(shuō)明采用Elisa試劑盒(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)進(jìn)行檢測(cè)，使用微孔板讀取器在450nm處測(cè)定OD值。檢測(cè)miR-223-3p對(duì)Caspase-1和IL-1β表達(dá)水平的影響時(shí)分為空白對(duì)照組(不作任何處理)，陰性對(duì)照組(miR-223-3p無(wú)義序列組)和miR-223-3p過(guò)表達(dá)組(miR-223-3p mimic)。檢測(cè)NLRP3對(duì)caspase-1和IL-1β表達(dá)的影響時(shí)分為空白對(duì)照組(不作任何處理)、陰性對(duì)照組(NLRP3 NC)和NLRP3過(guò)表達(dá)組(pcDNA-NLRP3)。檢測(cè)miR-223-3p通過(guò)NLRP3調(diào)控caspase-1和IL-1β表達(dá)時(shí)分為空白對(duì)照組(不作任何處理)，陰性對(duì)照組(miR-223-3p NC)，miR-223-3p過(guò)表達(dá)組(miR-223-3p mimic)和miR-223-3p過(guò)表達(dá)+ NLRP3過(guò)表達(dá)組(miR-223-3p mimic+ pcDNA-NLRP3)。

2 結(jié)果

2.1 IS對(duì)細(xì)胞活力的影響 與空白對(duì)照組(0.99±0.03)相比，不同濃度的IS(50、100、200、400、800 μmol/L)對(duì)H9c2細(xì)胞活力均有抑制作用(分別為0.87±0.03、0.79±0.03、0.67±0.04、0.51±0.04、0.43±0.04)。因?yàn)镮S濃度為400 μmol/L時(shí)細(xì)胞相對(duì)活力最接近50%，故后續(xù)選用這個(gè)濃度作為H9c2細(xì)胞損傷造模濃度，見(jiàn)圖1。

圖1 IS對(duì)細(xì)胞活力的影響

2.2 miR-223-3P在各組中的表達(dá) RT-qPCR檢測(cè)各組H9c2細(xì)胞中miR-223-3P表達(dá)水平，結(jié)果顯示和空白對(duì)照組(0.98±0.04)及陰性對(duì)照組(0.97±0.03)相比，IS組細(xì)胞miR-223-3P表達(dá)水平明顯降低(0.69±0.04)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組中miR-223-3P表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖2。

圖2 miR-223-3p在各組中的表達(dá)水平

2.3 各組細(xì)胞中細(xì)胞活力表達(dá)水平 與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，IS組中H9c2細(xì)胞活力明顯降低(分別為0.97±0.03、0.95±0.04、0.52±0.04)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 各組細(xì)胞活力水平

2.4 miR-223-3p可靶向結(jié)合NLRP3 通過(guò)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)Targetscan(http://www.targetscan.org/vert_71/)發(fā)現(xiàn)NLRP3存在與miR-223-3p結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-223-3p可與NLRP3靶向結(jié)合，見(jiàn)圖4、圖5。

圖4 miR-223-3p與NLRP3結(jié)合位點(diǎn)

圖5 相對(duì)熒光素酶活性測(cè)定

2.5 miR-223-3p負(fù)調(diào)控NLRP3表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，miR-223-3p mimic組中NLRP3蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，證實(shí)miR-223-3p可負(fù)調(diào)控NLRP3蛋白表達(dá)，見(jiàn)圖6。

圖6 miR-223-3p對(duì)NLRP3蛋白表達(dá)的影響

2.6 過(guò)表達(dá)miR-223-3p對(duì)細(xì)胞活力的影響 將添加IS的H9c2細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組(miR-223-3p NC)和miR-223-3p過(guò)表達(dá)組，CCK8檢測(cè)細(xì)胞活性，結(jié)果顯示與空白對(duì)照組(0.52±0.05)和陰性對(duì)照組相比(0.54±0.06)，miR-223-3p過(guò)表達(dá)組(0.71±0.06)細(xì)胞活性明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖7。

圖7 miR-223-3p對(duì)細(xì)胞活力的影響

2.7 過(guò)表達(dá)miR-223-3p對(duì)caspase-1和IL-1β表達(dá)的影響 Elisa結(jié)果顯示，和空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組(miR-223-3p無(wú)義序列組)相比，miR-223-3p過(guò)表達(dá)組中caspase-1和IL-1β表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞中caspase-1和IL-1β水平

2.8 過(guò)表達(dá)NLRP3對(duì)細(xì)胞活力的影響 將添加IS的H9c2細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組(NLRP3 NC)和NLRP3過(guò)表達(dá)組，細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果顯示與空白對(duì)照組(0.57±0.08)和陰性對(duì)照組相比(0.55±0.06)，NLRP3過(guò)表達(dá)組(0.31±0.05)中H9c2細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖8。

圖8 NLRP3對(duì)細(xì)胞活力的影響

2.9 過(guò)表達(dá)NLRP3對(duì)caspase-1和IL-1β表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組(NLRP3 NC)相比，過(guò)表達(dá)NLRP3可明顯增強(qiáng)H9c2細(xì)胞中caspase-1和IL-1β表達(dá)水平(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞中caspase-1和IL-1β水平

2.10 miR-223-3p通過(guò)調(diào)控NLRP3增強(qiáng)細(xì)胞活力 與空白對(duì)照組(0.50±0.07)和陰性對(duì)照組(0.48±0.08)相比，miR-223-3p過(guò)表達(dá)組(0.70±0.06)中細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)(P<0.05)，但是與miR-223-3p過(guò)表達(dá)組相比，miR-223-3p過(guò)表達(dá)+ NLRP3過(guò)表達(dá)組(0.59±0.06)中細(xì)胞活力則有所降低(P<0.05)，說(shuō)明miR-223-3p通過(guò)抑制NLRP3表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞活力，見(jiàn)圖9。

圖9 miR-223-3p通過(guò)調(diào)控NLRP3增強(qiáng)細(xì)胞活力

2.11 miR-223-3p通過(guò)調(diào)控NLRP3抑制caspase-1和IL-1β表達(dá) 與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，miR-223-3p過(guò)表達(dá)組中caspase-1和IL-1β表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，但與miR-223-3p過(guò)表達(dá)組相比，miR-223-3p過(guò)表達(dá)+ NLRP3過(guò)表達(dá)組中caspase-1和IL-1β表達(dá)水平則有所增高(P<0.05)，證實(shí)NLRP3可逆轉(zhuǎn)miR-223-3p對(duì)caspase-1和IL-1β表達(dá)的抑制作用，見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞中caspase-1和IL-1β水平

3 討論

有研究[15]表明心血管疾病患者的心血管死亡率和全因死亡率與腎小球?yàn)V過(guò)率的下降相關(guān)，然而慢性腎損害促進(jìn)心血管疾病發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制非常復(fù)雜，因此需要對(duì)其機(jī)制進(jìn)行更深入系統(tǒng)的研究。

miRNA在胚胎發(fā)育、增殖、血管生成、凋亡、細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和腫瘤發(fā)生等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在心血管系統(tǒng)中，miRNA還參與血管生成、心肌細(xì)胞收縮、脂質(zhì)代謝與控制、斑塊形成、心律失常和心肌細(xì)胞生長(zhǎng)[16]。既往研究發(fā)現(xiàn)miR-223-3p可減輕缺血/再灌注誘導(dǎo)的心肌損傷，但是其在慢性腎臟病所致心血管疾病中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)IS建立小鼠心肌H9c2細(xì)胞損傷模型，發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，IS組中miR-223-3p表達(dá)水平明顯降低，但是過(guò)表達(dá)miR-223-3p可明顯增強(qiáng)H9c2細(xì)胞活性，減輕IS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，證實(shí)miR-223-3p對(duì)IS誘導(dǎo)的心肌H9c2細(xì)胞的保護(hù)作用。

本研究進(jìn)一步探討了miR-223-3p發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用的具體機(jī)制。結(jié)果顯示miR-223-3p可能以NLRP3依賴的方式調(diào)控心肌細(xì)胞活性。NLRP3炎性小體是一種細(xì)胞溶質(zhì)蛋白復(fù)合物，由NLRP3、ASC(apoptosis-associated speck-like protein)和pro-caspase-1組成。NLRP3炎性小體是在一些內(nèi)源性“危險(xiǎn)信號(hào)”比如氧化應(yīng)激、溶媒體失穩(wěn)和線粒體功能障礙的刺激下組裝形成的[17]。研究表明NLRP3炎性小體的激活與多種炎性疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[18-19]，它可通過(guò)活化的caspase-1引起多種促炎細(xì)胞因子如IL-1β和IL-18的成熟和分泌[20]。而分泌的IL-1β和IL-18可加重炎癥，最終導(dǎo)致細(xì)胞溶解和細(xì)胞焦亡[21]。既往研究證實(shí)心肌缺血和心肌損傷常伴有嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[22],作為炎癥反應(yīng)的核心，NLRP3炎性小體被認(rèn)為是眾多炎癥性疾病的關(guān)鍵因子，并且有研究證明抑制NLRP3信號(hào)通路對(duì)冠狀動(dòng)脈結(jié)扎引起的心肌缺血和損傷具有保護(hù)作用[23]。研究結(jié)果表明過(guò)表達(dá)NLRP3可促進(jìn)caspase-1和IL-1β表達(dá)水平的增高并可導(dǎo)致H9c2細(xì)胞活性降低，與既往研究結(jié)果相符。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-223-3p可下調(diào)caspase-1和IL-1β的表達(dá)水平，為驗(yàn)證miR-223-3p是否通過(guò)NLRP3炎性小體通路調(diào)控細(xì)胞活性，進(jìn)行了功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，miR-223-3p過(guò)表達(dá)組中細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)，但是與miR-223-3p過(guò)表達(dá)組相比，miR-223-3p過(guò)表達(dá)+ NLRP3過(guò)表達(dá)組中細(xì)胞活力則有所降低，說(shuō)明NLRP3可逆轉(zhuǎn)miR-223-3p對(duì)細(xì)胞活力的增強(qiáng)作用，發(fā)現(xiàn)與miR-223-3p過(guò)表達(dá)組相比，miR-223-3p過(guò)表達(dá)+ NLRP3過(guò)表達(dá)組中caspase-1和IL-1β表達(dá)水平則有所增高，證明NLRP3可逆轉(zhuǎn)miR-223-3p對(duì)caspase-1和IL-1β表達(dá)的抑制作用。上述結(jié)果證實(shí)miR-223-3p通過(guò)負(fù)調(diào)控NLRP3表達(dá)，抑制炎性小體形成并下調(diào)caspase-1和IL-1β的表達(dá)水平增強(qiáng)細(xì)胞活力。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-223-3p在IS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯降低，過(guò)表達(dá)miR-223-3p可明顯增強(qiáng)H9c2細(xì)胞活力，miR-223-3p可靶向結(jié)合NLRP3并負(fù)調(diào)控NLRP3表達(dá)，miR-223-3p可能是通過(guò)調(diào)控NLRP3抑制caspase-1和IL-1β表達(dá)從而增強(qiáng)H9c2細(xì)胞活力。本研究對(duì)慢性腎疾病相關(guān)心肌細(xì)胞損傷的病因和治療提供了新的認(rèn)識(shí)，且加深了心腎相互作用機(jī)制的理解。但是本實(shí)驗(yàn)只做了細(xì)胞層面的研究，還需要開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。