李曉艷 張汝 程瑩 吳綺楠

(1.西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院老年科，四川 成都 610031；2.西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院內(nèi)分泌科,四川 成都 610031；3.重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院內(nèi)分泌腎臟內(nèi)科，重慶 400030)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，也是終末期腎病的主要病因，全球發(fā)病率居高不下，近年來中藥在治療DN中表現(xiàn)出巨大的潛力；中藥可從氧化應(yīng)激、自噬、炎癥、線粒體功能障礙等多方面防治足細(xì)胞損傷[1-3]。葛根素是從葛根的干燥根中分離提取的主要有效成分；研究表明葛根素具有改善糖尿病腎病患者血糖、蛋白尿、腎功能等作用[4-5]。如葛根素可改善DN伴蛋白尿患者氧化應(yīng)激損傷，降低血清炎癥因子含量[6]。葛根素可通過抑制足細(xì)胞中NOX4的表達(dá)來減輕糖尿病腎損害[7]。葛根素通過促進(jìn)足細(xì)胞自噬減輕糖尿病性腎病[8]。研究報(bào)道m(xù)iR-370過表達(dá)通過抑制DN大鼠模型中的CNPY1來促進(jìn)腎小球膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)積累[9]。抑制miR-370可防止高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷[10]。然而葛根素對高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞損傷的影響及其機(jī)制是否與miR-370有關(guān)尚未完全明確。因此，本實(shí)驗(yàn)探討葛根素是否通過調(diào)控miR-370影響高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞損傷。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 小鼠足細(xì)胞MPC5購自上海酶研生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；葡萄糖購自上?？泼羯锟萍加邢薰?；葛根素購自上海寶曼生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、RIPA蛋白裂解液、BCA試劑盒購自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司；SYBR Premix ExTaqTM試劑盒購自日本Takara公司；抗體均購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞處理與分組 小鼠足細(xì)胞MPC5用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別用濃度為5.5 mmol/L、30 mmol/L的葡萄糖培養(yǎng)MPC5細(xì)胞，作為對照組和模型組；分別用濃度為1、5、10 μmol/L葛根素和30 mmol/L葡萄糖處理MPC5細(xì)胞，記為低、中、高劑量葛根素組；將anti-miR-NC、anti-miR-370轉(zhuǎn)染至MPC5細(xì)胞后用30 mmol/L葡萄糖處理，記為anti-miR-NC組、anti-miR-370組；將miR-NC、miR-370轉(zhuǎn)染至MPC5細(xì)胞后用10 μmol/L葛根素和30 mmol/L葡萄糖處理，記為高劑量葛根素+miR-NC組、高劑量葛根素+miR-370組。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，PBS漂洗，加入Annexin V-FITC和PI各5 μL，混勻，避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.4 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，定量后取60 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)至PVDF上，用5%脫脂牛奶封閉，加入一抗4℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育2 h，暗室中曝光顯影，定影，檢測蛋白條帶灰度值，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-370表達(dá)水平 提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以U6為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。miR-370上游引物序列：5′-AGACCAGGTCACG TCTCTG-3′，下游引物序列：5′-GACAGACAAACCA GGTTCCA-3′；U6上游引物序列：5′-CTCGCTTCGG CAGCACA-3′，下游引物序列：5′-AACGCTTCACG AATTTGCGT-3′。

2 結(jié)果

2.1 葛根素對高糖處理MPC5 損傷的影響 與對照組相比，模型組細(xì)胞凋亡率升高，caspase-3、Bax表達(dá)水平升高，Bcl-2表達(dá)水平降低(均P<0.05)；與模型組相比，低、中、高劑量葛根素組細(xì)胞凋亡率降低，caspase-3、Bax表達(dá)水平降低，Bcl-2表達(dá)水平升高，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。見表1、圖1。

表1 葛根素對高糖處理MPC5 損傷的影響

圖1 葛根素對高糖處理MPC5 的凋亡及凋亡相關(guān)蛋白的影響

2.2 葛根素對高糖處理MPC5自噬的影響 與對照組相比，模型組p62表達(dá)水平升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)水平降低(均P<0.05)；與模型組相比，低、中、高劑量葛根素組p62表達(dá)水平降低，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)水平升高(均P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 葛根素對高糖處理MPC5自噬相關(guān)蛋白的影響

2.3 葛根素對高糖處理MPC5中miR-370表達(dá)的影響 模型組miR-370表達(dá)水平(3.18±0.13)較對照組(1.01±0.05)升高(P<0.05)；與模型組(3.18±0.13)相比，低(3.12±0.08)、中(2.45±0.10)、高劑量葛根素組(1.34±0.07)miR-370表達(dá)水平降低，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。

表2 葛根素對高糖處理的MPC5自噬相關(guān)蛋白的影響

2.4 干擾miR-370對高糖處理MPC5損傷及自噬的影響 與anti-miR-NC組相比，anti-miR-370組miR-370表達(dá)水平降低，細(xì)胞凋亡率降低，caspase-3、Bax表達(dá)水平降低，Bcl-2表達(dá)水平升高，p62表達(dá)水平降低，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)水平升高(均P<0.05)，見表4、圖3。

表4 干擾miR-370對高糖處理MPC5損傷及自噬的影響

圖3 干擾miR-370對高糖處理MPC5損傷及自噬的影響

2.5 miR-370能逆轉(zhuǎn)葛根素對高糖處理MPC5損傷及自噬的影響 與高劑量葛根素+miR-NC組相比，高劑量葛根素+miR-370組細(xì)胞凋亡率升高，caspase-3、Bax表達(dá)水平升高，Bcl-2表達(dá)水平降低，p62表達(dá)水平升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)水平降低(均P<0.05)，見圖4、表5。

圖4 過表達(dá)miR-370能逆轉(zhuǎn)葛根素對高糖處理MPC5損傷及自噬的影響

表5 過表達(dá)miR-370對高糖處理MPC5損傷及自噬的影響

3 討論

足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過屏障的重要組成部分，在DN的發(fā)生發(fā)展中占有重要作用，足細(xì)胞損傷是DN進(jìn)展的核心環(huán)節(jié)[11]。自噬作為一種溶酶體依賴性細(xì)胞內(nèi)降解途徑，可清除細(xì)胞內(nèi)受損蛋白和細(xì)胞器，是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的細(xì)胞保護(hù)性機(jī)制；近年來研究證實(shí)足細(xì)胞自噬異常在DN發(fā)病過程中起到重要作用[12-14]。因此，通過調(diào)控足細(xì)胞凋亡和自噬從而減輕足細(xì)胞損傷是防治DN的重要方法。研究報(bào)道中醫(yī)藥具有防治DN的作用[15]。如葛根素通過下調(diào)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠中基質(zhì)金屬蛋白酶9減輕了糖尿病早期腎臟的損害[16]。葛根素可通過減輕氧化應(yīng)激，從而預(yù)防糖尿病性腎病[17]。葛根素通過調(diào)節(jié)PERK / eIF2alpha / ATF4信號通路對自噬的影響進(jìn)而影響糖尿病腎病的腎功能[18]。LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ，p62是自噬溶酶體標(biāo)記蛋白，LC3定位于自噬泡和自噬泡膜表面，參與自噬體的形成，通常情況下，LC3經(jīng)加工成為胞質(zhì)可溶性Ⅰ型LC3(LC3-Ⅰ)；自噬期間LC3-Ⅰ經(jīng)泛素樣加工修飾，與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成Ⅱ型LC3(LC3-Ⅱ)并聚集到自噬體膜上，因此，LC3-Ⅱ水平可反映自噬活性；在溶酶體降解過程中，與底物結(jié)合的p62被蛋白水解酶降解，因此，p62水平升高常被認(rèn)為是自噬活性受到抑制的標(biāo)志[19-20]。雷公藤甲素可通過提高細(xì)胞自噬，減少細(xì)胞凋亡減輕足細(xì)胞損傷，延緩DN的進(jìn)展[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低、中、高劑量葛根素處理后，高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞的凋亡率降低，caspase-3、Bax的表達(dá)水平降低，Bcl-2表達(dá)水平升高，p62表達(dá)水平降低，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)水平升高，且呈劑量依賴性。表明葛根素可劑量依賴的提高細(xì)胞自噬、抑制細(xì)胞凋亡，從而減輕高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞損傷。

miRNA廣泛存在于生物體中，在多種生理和病理過程均起關(guān)鍵作用，參與DN的發(fā)病機(jī)制[22-23]。研究報(bào)道m(xù)iR-370的表達(dá)在肝臟缺血/再灌注損傷的小鼠中顯著上調(diào)；下調(diào)miR-370可以有效減輕肝臟損傷[24]。miR-370可通過靶向FOXO1抑制H2O2誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞的氧化應(yīng)激和凋亡[25]。且已有研究表明miR-370通過抑制血管緊張素Ⅱ 1型受體相關(guān)蛋白來促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞中miR-370表達(dá)水平升高；干擾miR-370表達(dá)后，MPC5細(xì)胞凋亡率降低，p62表達(dá)水平降低，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)水平升高；說明干擾miR-370表達(dá)可提高細(xì)胞自噬、抑制細(xì)胞凋亡。此外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)葛根素處理后miR-370表達(dá)水平降低，過表達(dá)miR-370逆轉(zhuǎn)了葛根素對高糖處理的MPC5細(xì)胞凋亡及自噬的影響。

4 結(jié)論

葛根素可劑量依賴的提高細(xì)胞自噬、抑制細(xì)胞凋亡，從而減輕高糖所致的MPC5細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與下調(diào)miR-370表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控自噬相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。