史圣甲 賈一凡 季興哲 周梁 張洲

(1.西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心，陜西 西安 710003；2.腫瘤生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·空軍軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室， 陜西 西安710032)

精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜而協(xié)調(diào)的過程[1-2]，支持細(xì)胞是曲細(xì)精管中唯一的體細(xì)胞，為精子發(fā)生通過提供必需的結(jié)構(gòu)、免疫和營養(yǎng)支持[3-4]。支持細(xì)胞數(shù)目及功能異常將導(dǎo)致精子發(fā)生障礙，在臨床上多表現(xiàn)為唯支持細(xì)胞綜合征(Sertoli cell-only syndrome，SCOS)[3,5]。因此，進(jìn)一步探索支持細(xì)胞數(shù)目和功能的調(diào)控機(jī)制，將有助于深入理解精子發(fā)生機(jī)制，從而推動(dòng)非梗阻性無精子癥的診療進(jìn)展。環(huán)狀RNA(circular RNA， circRNA)是一類新近發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非編碼RNA[6-7]。大量研究證實(shí)circRNA可通過多種機(jī)制調(diào)控關(guān)鍵基因的表達(dá)，在多種疾病的發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[8-9]。然而circRNA在精子發(fā)生及成熟中的功能尚不完全清楚。課題組前期文章發(fā)現(xiàn)非梗阻性無精子癥和梗阻性無精子癥患者睪丸組織中存在大量差異表達(dá)的circRNA，并通過實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)證實(shí)環(huán)狀_RNA0008045(Circbase ID：has_circ_0008045，circ_MGLL)在非梗阻性無精子癥睪丸組織中的表達(dá)較梗阻性無精子癥升高[10]，但具體功能仍待深入探索。因此，本研究進(jìn)一步評(píng)估了circ_MGLL對(duì)支持細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并探索了潛在機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 睪丸原代支持細(xì)胞(CP-H060RNA)及睪丸支持細(xì)胞專用完全培養(yǎng)基(CM-H060)購自武漢普諾賽公司。RNA提取試劑盒、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(Cell count kit-8，CCK-8)、細(xì)胞凋亡試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。一步法RT-qPCR試劑盒購自北京康為世紀(jì)公司。Lipofectamine 2000購自Thermo Fisher公司，EdU細(xì)胞增殖試劑盒、si-circ_MGLL、si-正常對(duì)照(Normal control，NC)、miR-NC、miR-1228/miR-1233/miR-149/miR-924類似物(mimics)購自廣州銳博生物科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 NanoDrop紫外分光光度計(jì)購自Thermo Fisher公司，流式細(xì)胞儀購自Beckman公司，熒光定量PCR儀、多功能酶標(biāo)儀購自BIORAD公司，熒光顯微鏡購自O(shè)LYMPUS公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將50000個(gè)支持細(xì)胞鋪至6孔板，至細(xì)胞匯合度至60%時(shí)，取250 μL 無血清培養(yǎng)基+5 μL小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)/miRNA/質(zhì)粒制備試劑I，取250 μL 無血清培養(yǎng)基+5 μL Lipofectamine 2000制備試劑Ⅱ。將試劑Ⅰ和試劑Ⅱ混合，孵育15 min，而后逐滴滴加至細(xì)胞，5 h后更換為完全培養(yǎng)基，48 h后進(jìn)行后續(xù)功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染si-NC的支持細(xì)胞命名為si-NC組，轉(zhuǎn)染si-circ_MGLL的支持細(xì)胞命名為si-circ_MGLL組。

1.3.2 RNA提取和一步法RT-qPCR 胰酶消化si-NC組或si-circ_MGLL組細(xì)胞，1 mL裂解液充分裂解10 min， 1 mL注射器反復(fù)抽吸數(shù)次。加入200 μL氯仿，震蕩15 s，室溫放置5 min，4℃、13400 g離心后，吸取水相層。加入1/2體積的乙醇，轉(zhuǎn)移至吸附柱中，4℃、13400 g離心后加入500 μL去蛋白液。4℃、12000 g離心后加入500 μL漂洗液。4℃、13400 g再次離心去除殘留試劑，加入20 μL去RNA酶ddH2O，室溫放置2 min。4℃、13400 g離心，所得液體即為組織/細(xì)胞總RNA，NanoDrop測定RNA純度與濃度。配制一步法RT-qPCR反應(yīng)試劑：12.5 μL 2×UltraSYBR Onestep Buffer, circ_MGLL/MGLL或相應(yīng)對(duì)照正義及反義引物各0.5 μL，UltraSYBR Onestep EnzymeMix 0.5 μL，RNA模板1 μL(100 ng)，去RNA酶ddH2O補(bǔ)齊至25 μL。震蕩混勻后離心，上機(jī)檢測，PCR反應(yīng)條件設(shè)定為反轉(zhuǎn)錄45℃ 10 min，預(yù)變性95℃ 5 min，變性95℃ 10 s+退火/延伸62℃ 45 s(35個(gè)循環(huán))，4℃保存樣品至檢測結(jié)束。GAPDH正義引物：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAG TC-3′，反義引物：5′-GAAGATGGTGATGGGATTT CA-3′；circ_MGLL正義引物：5′-GCCTACCTGCTC ATGGAGTT-3′，反義引物：5′-AGACGGCATTCAG CAGTTG-3′；MGLL正義引物：5′-ACAACTTTCAA GGTCCT-3′，反義引物：5′-CGAGAGAGCACGCTG GAG-3′。GAPDH做為內(nèi)參，相對(duì)表達(dá)水平計(jì)算公式：2-ΔΔct。

1.3.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)檢測細(xì)胞增殖速度 將5000個(gè) si-NC組和si-circ_MGLL組細(xì)胞鋪至96孔板，每組設(shè)置8個(gè)副孔，共5個(gè)96孔板。過夜培養(yǎng)后，兩組各取1板，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃孵育1 h，酶標(biāo)儀450 nm記錄吸光度值，此時(shí)數(shù)據(jù)為第0天數(shù)據(jù)。而后每天同一時(shí)間兩組各取1板細(xì)胞，重復(fù)上述步驟，獲取第1至第4天吸光度值。根據(jù)兩組吸光度值繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.3.4 5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU)檢測增殖細(xì)胞 si-NC組和si-circ_MGLL組細(xì)胞加入100 μL EdU培養(yǎng)基孵育2 h。1×PBS清洗2次后加入50 μL甘氨酸，搖床孵育5 min。1×PBS清洗2次后加入100 μLApollo染色反應(yīng)液，室溫避光搖床孵育30 min。1×PBS清洗2次后加入TrintonX-100搖床孵育10min。1×PBS清洗2次后加入Hoechst反應(yīng)液，室溫避光搖床孵育30 min。1×PBS清洗2次后，熒光顯微鏡拍照。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡和周期 收集si-NC組和si-circ_MGLL組細(xì)胞，1×PBS清洗3次，1 mL Binding buffer懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至106/mL。檢測細(xì)胞凋亡：兩組細(xì)胞加入5 μL Annexin-V FITC，室溫避光孵育10 min，而后加入5 μL PI，室溫避光孵育5 min。1×PBS清洗2次，500 μLPBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡。檢測細(xì)胞周期：兩組細(xì)胞加入70%預(yù)冷乙醇500 μL固定，4℃過夜。離心后，400 μL PI染色液混勻，4℃避光孵育30 min。1×PBS清洗2次，500 μL PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測細(xì)胞周期。

1.3.6 熒光素酶報(bào)告基因檢測circ_MGLL和miRNAs結(jié)合關(guān)系 合成circ_MGLL全長序列，對(duì)熒光素酶報(bào)告載體psiCHECK2質(zhì)粒進(jìn)行XhoI和NotI酶切，將circ_MGLL插入psiCHECK2對(duì)應(yīng)位點(diǎn)，所得載體即為Luci-circ_MGLL。當(dāng)支持細(xì)胞密度至70%時(shí)，將Luci-circ_CLTLC1與miR-1228/miR-1233/miR-149/miR-924 mimics共轉(zhuǎn)染至支持細(xì)胞，根據(jù)共轉(zhuǎn)染成分的不同分為五組：Luci-circ_MGLL+miR-NC組、Luci-circ_MGLL+miR-1228組、Luci-circ_MGLL+miR-1233組、Luci-circ_MGLL+miR-149組、Luci-circ_MGLL+miR-924組。48 h后，裂解各組細(xì)胞，向細(xì)胞裂解液中加入100 μL螢火蟲熒光素酶檢測試劑，混勻后測定相對(duì)熒光強(qiáng)度。而后加入100 μL海腎熒光素酶檢測試劑，混勻后多功能酶標(biāo)儀測定相對(duì)熒光強(qiáng)度。根據(jù)兩次檢測熒光強(qiáng)度的比值計(jì)算各組相對(duì)熒光素強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 沉默circ_MGLL表達(dá)促進(jìn)支持細(xì)胞增殖 RT-qPCR結(jié)果顯示，si-circ_MGLL可有效沉默支持細(xì)胞中呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)circ_MGLL的表達(dá)，而對(duì)呈線性結(jié)構(gòu)MGLL的表達(dá)無影響(P<0.05)(見圖1A)。CCK-8結(jié)果顯示，沉默circ_MGLL表達(dá)后，支持細(xì)胞增殖速度加快(P<0.05 )(見圖1B)。EdU結(jié)果顯示，沉默circ_MGLL表達(dá)后，增殖細(xì)胞比例升高(P<0.05)(見圖1C、圖1D)，以上結(jié)果提示circ_MGLL抑制支持細(xì)胞增殖。

圖1 敲降circ_MGLL增強(qiáng)支持細(xì)胞增殖

2.2 沉默circ_MGLL表達(dá)抑制支持細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，沉默circ_MGLL表達(dá)后，支持細(xì)胞凋亡百分比降低(P<0.05)(見圖2A、圖2B)，G1期細(xì)胞百分比明顯降低，S期細(xì)胞百分比明顯升高(P<0.05)(見圖2C、圖2D)，以上結(jié)果提示circ_MGLL促進(jìn)支持細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期于G1期。

圖2 敲降circ_MGLL抑制支持細(xì)胞凋亡

2.3 circ_MGLL可結(jié)合相關(guān)miRNAs MiRanda、Targetsca和RNAhybird網(wǎng)站聯(lián)合預(yù)測circ_MGLL潛在結(jié)合的miRNAs (見圖3A)，結(jié)果顯示miR-1228、miR-1233、miR-149、miR-924和circ_MGLL具有較高的結(jié)合潛能(見圖3B)。序列比對(duì)分析提示circ_MGLL與miR-1228、miR-1233、miR-149、miR-924存在結(jié)合位點(diǎn)(見圖3C)。熒光素酶報(bào)告基因顯示：Luci-circ_MGLL與上述miRNA類似物共轉(zhuǎn)染后，相對(duì)熒光強(qiáng)度較miR-NC共轉(zhuǎn)染組明顯降低(P<0.05)(見圖3D)，以上結(jié)果提示circ_MGLL可吸附并結(jié)合上述miRNAs。

圖3 circ_MGLL潛在結(jié)合miRNAs

3 討論

支持細(xì)胞可為生殖細(xì)胞提供其分化及成熟必需的營養(yǎng)及免疫豁免微環(huán)境，其數(shù)目和功能異常將導(dǎo)致精子發(fā)生障礙[4,11-13]。既往研究已初步證實(shí)非編碼可通過多種機(jī)制影響睪丸支持細(xì)胞的數(shù)目和功能而調(diào)控精子發(fā)生[14-16]。如miR-4270通過靶向抑制生長停滯與DNA損傷誘導(dǎo)基因α(Growth arrest and DNA damage inducible alpha，GADD45A)的表達(dá)，而抑制人和小鼠支持細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，從而導(dǎo)致精子發(fā)生障礙[17]。另有研究[18]發(fā)現(xiàn)miR-202在非梗阻性無精子癥睪丸組織中表達(dá)升高，并抑制細(xì)胞增殖和生物合成功能。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)circ_0000116在非梗阻性無精子癥睪丸組織中表達(dá)上調(diào)，并可作為競爭性內(nèi)源性RNA(Competing endogenous RNA，ceRNA)吸附miR-449a而抑制精子發(fā)生[19]。因此，進(jìn)一步鑒定與支持細(xì)胞數(shù)目與功能相關(guān)的非編碼RNA，將有助于推動(dòng)無精子癥診療進(jìn)展。

課題組還發(fā)現(xiàn)非梗阻性無精子癥和梗阻性無精子癥患者睪丸組織中存在大量差異表達(dá)的circRNA，其中circ_0023313、circ_0008045(circ_MGLL)、circ_00058058在非梗阻性無精子癥睪丸組織中表達(dá)升高，而circ_0061817、circ_00002023、circ_00008533在非梗阻性無精子癥組織中表達(dá)下降[10]。其中尚無研究探討來源于單酰甘油酯酶(MGLL)第7外顯子的circ_RNA0008045(Circbase ID：has_circ_0008045，circ_MGLL)在睪丸組織中的表達(dá)及功能。因此選取circ_MGLL作為本研究的后續(xù)研究對(duì)象，結(jié)果顯示：沉默circ_MGLL的表達(dá)將導(dǎo)致支持細(xì)胞增殖能力增加、而凋亡水平降低。因此，推測異常升高的circ_MGLL將誘導(dǎo)支持細(xì)胞凋亡，而支持細(xì)胞數(shù)目異常將導(dǎo)致精子發(fā)生障礙，這可能是非梗阻性無精子癥的發(fā)病機(jī)制之一。

近年來，研究證實(shí)ceRNA機(jī)制是circRNA調(diào)控相關(guān)致病基因表達(dá)最常見的一種形式。circRNA可通過吸附并結(jié)合相關(guān)miRNAs，從而解除miRNAs對(duì)下游靶基因轉(zhuǎn)錄的抑制，進(jìn)而參與調(diào)控相關(guān)疾病的發(fā)生及進(jìn)展[20-21]。為了深入揭示circ_MGLL調(diào)控支持細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制，本研究初步探索了circ_MGLL是否具有作為ceRNA的潛能。通過三個(gè)生物信息學(xué)網(wǎng)站[22-24]和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，我們發(fā)現(xiàn)circ_MGLL可結(jié)合miR-1228、miR-1233、miR-149、miR-924。既往研究顯示miR-1228在乙二醇甲醚暴露的動(dòng)物睪丸中表達(dá)升高，并與細(xì)胞凋亡和分化密切相關(guān)[25]。此外，miR-1233可被證實(shí)可通過抑制雙特異性磷酸酶9(Dual-Specificity Phosphatase 9，DUSP9)的表達(dá)而抑制凋亡[26]。研究還發(fā)現(xiàn)，miR-149是精子功能的重要調(diào)控調(diào)控因子，其在人類胚胎早期發(fā)育過程中發(fā)揮重要功能[27]。因此，circ_MGLL可能通過結(jié)合上述miRNAs并抑制其相關(guān)功能，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)睪丸支持細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控。

本研究僅探索了circ_MGLL在睪丸支持細(xì)胞中的表達(dá)及功能，尚缺少大樣本的無精子癥患者睪丸組織標(biāo)本的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。此外對(duì)circ_MGLL調(diào)控支持細(xì)胞增殖和凋亡機(jī)制的相關(guān)探索較為粗淺。盡管發(fā)現(xiàn)了一系列凋亡相關(guān)miRNAs是circ_MGLL的潛在結(jié)合因子，但仍需更深入的研究闡述相關(guān)miRNAs是否可介導(dǎo)circ_MGLL對(duì)支持細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默circ_MGLL表達(dá)促進(jìn)睪丸支持細(xì)胞增殖并抑制凋亡，并可吸附結(jié)合miR-1228/miR-1233/miR-149/miR-924。本研究初步探索了circ_MGLL對(duì)睪丸支持細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制，為非梗阻性無精子癥提供了潛在的診療靶點(diǎn)。