黃成麗 林芳榮 李根 王忠玲 王雪嬌

(海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院門診部，海南 海口 570145)

新藥青蒿素(Artemisinin，ART)及其衍生物雙氫青蒿素(Dihydroartemisinin，DHA)和青蒿琥酯(artesunate， ARTS)的藥物使用是當前的熱點問題，已經被美國食品與藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準，既往研究多集中于ART在鐵離子調控方面，因而曾被稱為“鐵離子依賴性凋亡”藥物，即“鐵死亡”[1]。并且，隨著鐵死亡概念的提出及深入研究，逐漸證實ART及洐生物所誘導的多種惡性腫瘤細胞發(fā)生的死亡方式主要就是鐵死亡。有研究[2]表明，不飽和脂肪酸DHA通過鐵死亡強烈抑制急性髓細胞白血病(Acute inyeloid leukemia,AML)細胞系的活性。也有研究[3]表明，DHA通過Fork head box protein M1(FOXM1)介導導致頭頸癌細胞系細胞周期停滯，特異性地通過引發(fā)鐵蛋白沉積癥并導致頭頸癌細胞發(fā)生鐵死亡。ART的卵巢癌細胞增殖作用與幾種關鍵細胞周期調節(jié)蛋白[包括周期素D3(cyclinD3)，轉錄因子E2F-1和細胞周期蛋白依靠性激酶抑制劑p21]的表達改變以及雷帕霉素信號傳導的機制靶標的抑制有關。較高濃度的ART處理卵巢癌細胞后，可以導致活性氧(Reactive oxyge species,ROS)依賴性DNA損傷并導致鐵死亡[4]。但是，ART是否能誘導腎癌細胞發(fā)生鐵死亡，以及誘導腎癌細胞發(fā)生鐵死亡的具體機制尚不清楚。因此，本研究探討ART及其衍生物DHA和 ARTS對腎癌細胞系786-0的作用以及對其誘導鐵死亡的機制，以期為臨床上腎癌的治療提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 DHA/ARTS作用786-0腎癌細胞系檢測細胞存活率 786-0細胞正常培養(yǎng)至對數(shù)生長期，細胞用0.25%胰蛋白酶消化，計數(shù)，調整細胞密度為1×104/孔，接種于96孔板。搖勻細胞后將96孔板置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將細胞分為對照組(DMSO組)[加入1‰DMSO(二甲基亞砜)]、DHA組(加入5、10、20、50 μM DHA)、ARTS組(加入5、10、20、50 μM ARTS)、DHA+DFO組(加入5、10、20、50 μM DHA+20 μM DFO)、DHA+Fer-1組(加入5、10、20、50 μM DHA+20 μM Fer-1)、ARTS+DFO組(加入5、10、20、50 μM ARTS+20 μM DFO)、ARTS+Fer-1組(加入5、10、20、50 μM ARTS+20 μM Fer-1)。將96孔板置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。取出96孔板，吸棄原培養(yǎng)液，然后在每孔加入CCK-8試劑為10 μL，終培養(yǎng)液為100 μL，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)45 min后在450 nm處檢測吸光度(OD)值。將處于對數(shù)生長期的786-0細胞用0.25%胰蛋白酶消化，計數(shù)，調整細胞密度為5×104/孔，接種于24孔板。倒置顯微鏡觀察細胞殺傷情況并拍照。

1.2 細胞內活性氧化物檢測 分組后用于熒光拍照的孔板細胞藥物作用24 h，后續(xù)用于流式檢測的細胞藥物作用12 h，作用時間后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次。用含有10 μM DCFDA的無酚紅培養(yǎng)基細胞染色1 h。PBS洗去多余的DCFDA。然后用熒光顯微鏡觀察熒光強度并拍照或者流式細胞儀檢測。

1.3 RNA提取，反轉錄及RT-qPCR 收集預先處理好的786-0細胞，用PBS輕柔清洗2次，每孔加入500 μL Trizol裂解5 min，將細胞吹下收集至1.5 mL離心管。離心管中加入100 μL氯仿，充分混合并劇烈震蕩15 s。4℃，12000 g離心15 min，小心吸取水相上清200 μL轉移至一新1.5 mL離心管，棄乙醇，空氣中干燥。加入適量的無核酶水溶解RNA，并測濃度。按試劑盒說明，配置每20μL逆轉錄體系中包含20 μL逆轉反應混合物，1 μg RNA及水。反應條件為：65℃ 5 min，冰上2 min，25℃ 5 min，50℃ 45 min，85℃ 2 min，降溫至4℃。cDNA可穩(wěn)定保存于-20℃。按照實驗目的，計劃Q-RT-PCR實驗方案，并配置反應體系。

1.4 細胞蛋白質提取和檢測 用含1%脫脂牛奶的TBST緩沖液室溫封閉PVDF膜2 h，TBST洗膜5 min，再將膜與特異性一抗4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，再將膜與特異性二抗室溫孵育1 h。TBST再次洗膜3次，每次10 min。加ECL顯影液，用Bio-Rad ChemiDoc XRS+化學發(fā)光成像系統(tǒng)檢測發(fā)光情況。用Bio-Rad ChemiDoc XRS+化學發(fā)光成像系統(tǒng)檢測發(fā)光情況。

1.5 構建pmCherry-EGFP-FTH1質粒 FTH1開放閱讀框插入mCherry-GFP質粒。準備好生長狀態(tài)良好的細胞，用適量生理鹽水洗滌細胞2～3次。質粒提取試劑盒(南京Vazyme Biotech公司)，分散將蛋白裂解液均勻滴加入培養(yǎng)皿內，再用干凈的細胞刮刀將細胞刮于培養(yǎng)皿的一側，然后利用移液槍將細胞碎片和裂解液的混合物轉移到1.5 mL的EP管內。利用超聲波細胞破碎儀對混合物超聲3～5次，然后在冰盒內靜置10 min。按說明書用質粒提取試劑盒提取，并保留部分菌液，質粒送測序。待測序結果正確，挑取剩余菌液接種到3 mL培養(yǎng)基中，搖床過夜。提取質粒，并標記好質粒濃度。

1.6 細胞轉染 將786-0細胞接種到孔板中，待細胞生長至70%左右融合度時進行轉染。按照Lipofectamine RNAi MAX說明書并稍加改進進行操作，轉染RNA試劑時：A管：lipo RNAi MAX 7.5 μL，opti-MEM培養(yǎng)基將總體積稀釋至100 μL，混勻B管：siRNA，opti-MEM培養(yǎng)基將總體積稀釋至100 μL，A、B兩管室溫靜置5 min；將B管中的液體全部加入A管中混勻，室溫靜置15 min。然后為待轉染細胞換液，將250 μL混合液加入細胞培養(yǎng)基中繼續(xù)進行培養(yǎng)。待達到合適的轉染時間后可進行后續(xù)實驗。轉染質粒時，按照Lipofectamine LTX Reagent說明書并稍加改進進行操作，待達到合適的轉染時間后可進行后續(xù)實驗。

2 結果

2.1 DHA/ARTS作用786-0細胞形態(tài)和CCK-8分析 786-0細胞系在DHA和ARTS作用后，從顯微鏡觀察和CCK-8檢測，顯示細胞發(fā)生了明顯死亡，并且隨著藥物濃度的增大存活細胞數(shù)越少。而且由DHA和ARTS所產生的致死作用可以被鐵死亡抑制劑DFO和Fer-1所抑制。見圖1。

圖1 DHA和ARTS作用786-0細胞后細胞活力

2.2 DHA/ARTS可增加786-0細胞內ROS水平 DHA和ARTS作用下786-0細胞內ROS的熒光強度明顯高于對照組(q=2.894，2.342；P<0.05)。在鐵死亡抑制劑DFO和Fer-1干預下，DHA+DFO組、DHA+ Fer-1組、ARTS+DFO組、ARTS+ Fer-1組786-0細胞內ROS的熒光強度明顯低于DHA組和ARTS組(P<0.05)。見圖2。

圖2 DHA和ARTS升高786-0細胞內ROS水平

2.3 DHA/ARTS作用786-0細胞NCOA4和FTH1蛋白變化 DHA/ARTS作用786-0細胞，細胞內NCOA4和FTH1水平下降具有一致性，且蛋白下降具有藥物時間依賴性，見圖3。

圖3 DHA/ARTS降低NCOA4/FTH1的蛋白水平具有時間依耐性

2.4 敲減NCOA4可抑制DHA和ARTS對于786-0細胞作用 結果顯示，si-NCOA4 2#和si-NCOA4 3#轉染786-0細胞后，細胞內NCOA4的mRNA相對表達量和蛋白的相對表達量明顯低于對照組(P<0.05)。CCK-8結果顯示，si-NCOA4 2#和si-NCOA4 3#轉染786-0細胞后，細胞的增殖率明顯高于對照組(P<0.05)，且si-NCOA4 3#組細胞增殖率明顯高于si-NCOA4 2#組(P<0.05)。見圖4。

圖4 敲減NCOA4可抑制DHA和ARTS對于786-0細胞作用

2.5 DHA/ARTS可增加FTH1自噬降解 結果顯示，當沒有自噬發(fā)生時，顯示黃色熒光，當自噬發(fā)生，黃色熒光減少，紅色熒光增多，且紅色熒光強度可反映自噬水平。在DHA和ARTS作用之后黃色熒光減少，紅色熒光明顯增多，反映了DHA增加了FTH1的自噬水平而發(fā)生鐵死亡作用(見圖5)。從自噬結果來看，DHA組和ARTS組的細胞自噬率明顯高于對照組(P<0.05)，且50 μM的DHA和ARTS組細胞的自噬率明顯高于20 μM的DHA和ARTS組(P<0.05)。在siRNA-NCOA4沉默NCOA4表達后，細胞自噬率明顯降低(P<0.05)。見圖6。

圖5 DHA/ARTS作用細胞后FTH1自噬情況檢測(50×)

圖6 細胞自噬發(fā)生率

3 討論

自2012年Dixon等[5]在小分子化合物Erastin處理RAS基因突變的人纖維肉瘤細胞系HT-1080細胞時，發(fā)現(xiàn)一種新的具有鐵離子依賴性的細胞死亡方式，并命名為鐵死亡以來，有大量關于鐵死亡的研究被發(fā)表。在藥物研究方面，研究者發(fā)現(xiàn)如索拉非尼、柳氮磺胺吡啶、鹽霉素、順鉑、青蒿素等[6-7]藥物均能誘導鐵死亡的發(fā)生。本研究顯示青蒿素衍生物雙氫青蒿素和青蒿琥酯可以誘導786-0腎癌細胞系內ROS水平增高，誘發(fā)腎癌細胞鐵死亡。在腎癌化療藥物耐藥性高，化療效果不理想的情況下，這一發(fā)現(xiàn)對腎癌的藥物治療提供了一種新的可能性。

在鐵死亡機制研究中，除了胱氨酸/谷氨酸逆向轉運體和谷胱甘肽過氧化物酶4這兩條非常經典的通路外，研究者還發(fā)現(xiàn)了p53、Nrf2、ATF4等[8-9]相關通路都和鐵死亡有著密切的聯(lián)系。而這些通路最終都影響細胞內ROS的代謝，導致ROS的聚積，而發(fā)生鐵死亡。Lee等[10]發(fā)現(xiàn)NCOA4分子可以介導鐵結合蛋白的進入溶酶體而發(fā)生蛋白自噬性降解，從而增加細胞內游離的Fe2+，而導致細胞發(fā)生鐵死亡，這種方式也被稱之為鐵自噬性鐵死亡。本研究結果和之前的研究結果相似，通過siRNA技術沉默NCOA4的表達，進而抑制鐵死亡的發(fā)生。此外，在mCherry系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TH1在DHA/ARTS作用下，發(fā)生了自噬性降解。這些都說明DHA和ARTS可以通過NCOA4/FTH1信號通路誘導腎癌細胞通過介導鐵結合蛋白自噬性降解而發(fā)生鐵自噬性鐵死亡。

青蒿素是我國著名藥學家屠呦呦教授首次發(fā)現(xiàn)并從黃花蒿中提取出來的活性成分，因其有效的抗瘧作用，挽救了數(shù)百萬人的生命。近年來，青蒿素及雙氫青蒿素、青蒿琥酯等洐生物的抗腫瘤作用也逐漸成為化療藥物研發(fā)領域的熱點[10-11]?，F(xiàn)有研究表明，青蒿素及其衍生物抗腫瘤譜廣，在體內外研究中，顯示了對肺癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、白血病等等腫瘤都其作用[12-16]。而其發(fā)揮抗腫瘤作用的機制復雜，包括干擾細胞周期，抑制腫瘤增殖；抑制腫瘤細胞侵襲和轉移；誘導腫瘤細胞內質網應激和凋亡；增加細胞內氧化應激水平；誘導DNA損傷；誘發(fā)鐵死亡。青蒿素及其等洐生物還能增加腫瘤細胞對化療藥物敏感性，增強化療藥物抗腫瘤療效[17-18]。本研究通過檢測腎癌細胞中ROS的表達發(fā)現(xiàn)，在DHA和ARTS作用786-0細胞，其細胞內ROS明顯升高，并且其致ROS升高的作用，可被鐵死亡抑制劑DFO和Fer-1所抑制。分析其原因，可能是DHA和ARTS可以通過NCOA4/FTH1信號通路激活細胞內ROS的激活，鐵死亡主要是胞內脂質活性氧生成與降解的平衡失調所致，當細胞抗氧化能力降低，脂質活性氧堆積，就能引起細胞氧化性死亡?？梢奟OS的大量累積是鐵死亡發(fā)生的重要因素。

本文仍存在一定局限性：首先，本研究尚未驗證DHA和ARTS-NCOA4及FTH1通路中是否存在GPX4的調控，這將是本研究課題今后的延伸方向；其次，研究缺少能夠直接提示鐵死亡水平的標記物，缺少動物實驗加以驗證研究結果的準確性。

4 結論

青蒿素衍生物DHA和ARTS可誘導786-0腎癌細胞系發(fā)生鐵死亡，其致鐵死亡的發(fā)生是通過NCOA4介導FTH1特異性自噬降解而實現(xiàn)。本研究揭示了青蒿素衍生物DHA/ARTS誘導腎癌細胞系發(fā)生了鐵死亡，并探討了其發(fā)生機制，具有一定的臨床意義。