李轉(zhuǎn) 杜岳峰 吳東娟 張夢姣 陳利娟

(1.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西 西安 710032；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西 西安 710061)

前列腺癌(Prostatic cancer)位居男性常見腫瘤第二位，也是男性癌癥死亡的第二大原因[1]。由于人口老齡化，前列腺癌的發(fā)病率正在增加[2]。對無癥狀的男性進(jìn)行早期檢測和治療可以降低死亡率和提高生活質(zhì)量。前列腺特異性抗原(Prostate specific antigen, PSA)和前列腺酸性磷酸酶(Prostatic acid phosphatase, PAP)等標(biāo)志物的篩查明顯提高了前列腺癌的早期診斷準(zhǔn)確性[3]，然而，這些標(biāo)志物的診斷價(jià)值仍存在爭議，因此，需探索新的高效診斷標(biāo)志物。轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白2 (Metastasis-associated protein 2, MTA2)定位在染色體11q1213.1上，表達(dá)含668個(gè)氨基酸的蛋白，分子量是70kD。MTA2是Mi-2/核小體重塑脫乙酰酶復(fù)合物的核心成分，在轉(zhuǎn)錄水平上精確控制細(xì)胞骨架重組。此外，MTA2與腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]。目前報(bào)道MTA2在前列腺癌中表達(dá)模式的文獻(xiàn)鮮少。因此，本研究探討MTA2對前列腺癌預(yù)后的預(yù)測價(jià)值，并探索其在癌轉(zhuǎn)移過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 MTT(四唑鹽)、吉姆薩溶液和DAP購自美國Sigma-Aldrich。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青霉素/鏈霉素和0.25%胰蛋白酶購自美國HyClone。Opti-MEM、TRIzol購自美國Invitrogen?？筂TA2、Eotaxin-1、CCR3、p-ERK1/2、t-ERK1/2、MMP-3和β-actin的一級抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自英國Abcam。通用型IHC試劑盒購自成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司。Lipofectamine 2000購自美國Life Technologies。GoScript RT Mix、GoTaq Green Master Mix、SYBR Green PCR Master Mix購自美國Promega。Transwells購自美國Corning。Matrigel購自美國BD Biosciences。裂解緩沖液購自德國Roche。BCA試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。ECL試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 研究對象 收集2018年1月～2020年6月空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的50例前列腺癌組織及配對癌旁組織樣本用于免疫組織化學(xué)分析?；颊咝g(shù)前均未進(jìn)行治療。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理診斷確診為原發(fā)性前列腺癌。②患者知情同意。③收集樣本前3個(gè)月內(nèi)患者未進(jìn)行藥物治療。④患者無心腦血管疾病、精神障礙、免疫系統(tǒng)疾病等。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他嚴(yán)重疾病或近期具有藥物治療史的患者。②非原發(fā)性前列腺癌患者。③未簽訂知情同意書的患者。本研究已獲得本院倫理審查委員會批準(zhǔn)(倫理審批號：201801120008)，所有受試者均知情同意。

1.3 免疫組化染色檢測MTA2蛋白表達(dá)水平 組織切片在室溫下用二甲苯浸泡兩次(10 min)來脫蠟，并使用分級乙醇(100%, 2 min; 100%, 2 min; 95%, 2 min; 90%, 2 min; 80%, 2 min; 70%, 2 min)復(fù)水，隨后用蒸餾水沖洗。0.01 M檸檬酸鹽緩沖溶液用于抗原修復(fù)，微波加熱至沸騰3 min，冷卻至室溫，然后與PBS孵育15 min。免疫組化染色采用通用型IHC試劑盒，包括內(nèi)源性過氧化物酶封閉液、血清、二抗、鏈霉親和素過氧化物酶和DAB顯色液。組織切片加入50 μL過氧化物酶阻斷液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫孵育15 min后，用PBS漂洗3次，每次3 min。先用山羊血清封閉30 min，然后將切片與MTA2抗體(1∶100)在4℃孵育過夜，用PBS清洗3次，每次10 min，然后用親和素偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育30 min。經(jīng)PBS洗滌后，將切片在50 μL鏈霉親和素過氧化物酶溶液中室溫孵育15 min，再用100 μL DAB室溫浸泡2 min。用光學(xué)顯微鏡觀察MTA2蛋白表達(dá)的變化。顯微鏡下觀察5個(gè)代表性區(qū)域(放大倍數(shù)為400×)，計(jì)數(shù)陽性染色區(qū)域的細(xì)胞數(shù)量，MTA2在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核染色均為陽性。根據(jù)染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞百分比，半定量評價(jià)MTA2在每個(gè)樣本中的表達(dá)水平。對每個(gè)標(biāo)本進(jìn)行染色強(qiáng)度評分(陰性=0，弱陽性=1，中等陽性=2，強(qiáng)陽性=3)和染色百分比評分(0～10%=1，11%～50%=2，50%～75%=3，75%～100%=4)。將強(qiáng)度和百分比相加，計(jì)算每個(gè)患者的染色評分。根據(jù)MTA2蛋白的表達(dá)將50例樣本分為兩組，染色評分≥4為高表達(dá)組(n=36例)，<4為低表達(dá)組(n=14例)[5]。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及shRNA轉(zhuǎn)染 人前列腺癌細(xì)胞系(PC-3)購自美國ATCC。PC-3細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)(37℃, 5% CO2)。shMTA2 (MTA2-shRNA-pLKO.1)和shNC (Luc-shRNA-pLKO.1)質(zhì)粒均由上海吉?jiǎng)P公司合成。MTA2靶序列為5′-AGGGAGTGAGGA GTGAATTAA-3′。轉(zhuǎn)染MTA2-shRNA-pLKO.1的細(xì)胞作為shMTA2組，轉(zhuǎn)染Luc-shRNA-pLKO.1的細(xì)胞作為shNC組，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為空白對照組(Control組)。采用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將質(zhì)粒和Lipofectamine 2000用Opti-MEM稀釋，然后按照1∶1的比例混合，室溫靜置15 min 后，加入鋪板后的PC-3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h。通過qRT-PCR和Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.5 qRT-PCR檢測MTA2的mRNA表達(dá)水平 使用TRIzol提取細(xì)胞總RNA。使用GoScript RT Mix將RNA (1 g)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用GoTaq Green Master Mix進(jìn)行RT-PCR。使用SYBR Green PCR Master Mix在美國Applied Biosystems STEP One Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)上進(jìn)行PCR。RT-PCR引物為MTA2(正向：5′-GTTCTGGCAATACGG CGAGT-3′，反向：5′-CTTCGGCTGAATGCAAAG A-3′)和β-actin (正向：5′-ACTGGAACGGTGAAG GTGAC-3′，反向：5′-AGAGAAGTGGGGTGCTT TT-3′)。內(nèi)參對照為β-actin。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s，95℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸90 s，72℃延伸10 min。

1.6 細(xì)胞活力檢測 將shNC和shMTA2細(xì)胞以2×104個(gè)/孔的密度接種到24孔板中，分別培養(yǎng)48 h，根據(jù)制造商的說明，用MTT試劑檢測細(xì)胞活力。使用BIO-TEK酶標(biāo)儀檢測570 nm處的吸光度。所有實(shí)驗(yàn)做6個(gè)重復(fù)。

1.7 體外細(xì)胞遷移和侵襲分析 使用24孔Transwells (孔徑為8 μm)進(jìn)行體外遷移分析。上室加入50 μL無血清培養(yǎng)液和細(xì)胞(2×104細(xì)胞/孔)，下室加入35 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液。37℃孵育24 h后，除去上室中的未遷移細(xì)胞，膜下表面用95%甲醇固定10 min，0.5%結(jié)晶紫染色30 min。然后在顯微鏡下對5個(gè)不同區(qū)域的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。上室預(yù)先用5%的Matrigel涂覆用于確定細(xì)胞的侵襲力。所有實(shí)驗(yàn)做6個(gè)重復(fù)。

1.8 Western Blot檢測蛋白表達(dá)水平 將細(xì)胞在含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液中裂解，用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)樣本在10% SDS-PAGE上分離并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。封閉后將膜與一抗MTA2(1∶1000稀釋)、Eotaxin-1(1∶2000稀釋)、CCR3(1∶3000稀釋)、p-ERK1/2(1∶1000稀釋)、t-ERK1/2(1∶1000稀釋)、MMP-3(1∶2000稀釋)和β-actin(1∶1000稀釋)在4℃下孵育過夜。然后與HRP標(biāo)記的IgG二抗(1∶2000稀釋)在37℃孵育1 h。通過ECL試劑盒進(jìn)行顯影。β-actin作為內(nèi)部對照。所有實(shí)驗(yàn)做6個(gè)重復(fù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析及Tukey事后檢驗(yàn)。生存評估采用Kaplan-Meier法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTA2對前列腺癌預(yù)后的診斷價(jià)值 低表達(dá)組和高表達(dá)組兩組患者的年齡、Gleason評分和TNM評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。低表達(dá)組患者中出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為14.29%(2/14)，高表達(dá)組患者中出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為52.78%(19/36)，兩組患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=6.131，P=0.013)(見表1)。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，低表達(dá)組和高表達(dá)組患者的生存時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，低表達(dá)組患者的生存時(shí)間更長(2=4.756，P=0.029)，見圖1。

表1 MTA2低表達(dá)和高表達(dá)患者的臨床參數(shù)

圖1 MTA2低表達(dá)和高表達(dá)患者的Kaplan-Meier生存分析

2.2 MTA2蛋白在前列腺癌組織中高表達(dá) 免疫組化染色結(jié)果顯示(見圖2A)，前列腺患者癌組織中MTA2的染色評分顯著高于癌旁組織(5.16±0.87vs2.34±0.39,t=9.221,P<0.001)。MTA2在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)，且病變程度越高，MTA2染色強(qiáng)度越高，見圖2B。

圖2 MTA2蛋白在前列腺癌組織中高表達(dá)

2.3 沉默MTA2可抑制前列腺癌細(xì)胞的生長 與空白對照組比較，shMTA2組PC-3細(xì)胞中MTA2 mRNA和蛋白水平顯著降低(P<0.001)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對照組相比，shMTA2組的細(xì)胞活力降低了56.87%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見圖3。

圖3 沉默MTA2對PC-3細(xì)胞活力的影響

2.4 沉默MTA2可抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲 Transwells實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對照組相比，shMTA2組的細(xì)胞遷移數(shù)量降低了65.80%，細(xì)胞侵襲數(shù)量降低了56.35%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)，見圖4。

圖4 沉默MTA2對PC-3細(xì)胞遷移和侵襲的影響

2.5 沉默MTA2對前列腺癌細(xì)胞中Eotaxin-1/CCR3軸的影響 Western blot結(jié)果顯示，與空白對照組相比，shMTA2組的Eotaxin-1、CCR3、p-ERK1/2和MMP-3的蛋白相對表達(dá)量依次降低了76.03%、69.12%、72.32%和54.67%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)；t-ERK1/2的蛋白相對表達(dá)量與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖5。

圖5 沉默MTA2對PC-3細(xì)胞中Eotaxin-1/CCR3軸相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

目前，其他學(xué)者已經(jīng)在幾種人類癌癥中觀察到MTA2過表達(dá)，并且MTA2的表達(dá)水平與腫瘤侵襲能力、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)[6]。在喉鱗狀細(xì)胞癌中，MTA2的高表達(dá)表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和腫瘤分化程度相關(guān)[7]。MTA2在侵襲性肺癌中表達(dá)，其表達(dá)增加與預(yù)后不良相關(guān)[8]。在膀胱癌中，MTA2的高表達(dá)可增強(qiáng)T24細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲[9]。與這些研究一致，本研究觀察到前列腺癌組織中MTA2的表達(dá)高于癌旁組織。此外，MTA2的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者的生存期顯著相關(guān)。因此， MTA2過表達(dá)有可能成為預(yù)測前列腺癌患者預(yù)后的致癌因子。

侵襲和轉(zhuǎn)移是癌細(xì)胞的特征，也是影響預(yù)后的關(guān)鍵因素。本研究發(fā)現(xiàn)沉默MTA2可抑制前列腺癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲能力。為了揭示MTA2調(diào)控前列腺癌細(xì)胞侵襲的分子機(jī)制，本研究檢測了PC-3細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-3 (MMP-3)的表達(dá)變化。已知MMPs家族通過降解各種細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)參與癌細(xì)胞的侵襲性，MMPs降解細(xì)胞外基質(zhì)是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的先決條件。MMP活性失調(diào)后，惡性細(xì)胞可以破壞細(xì)胞間連接、溶解細(xì)胞外基質(zhì)、破壞基底膜、侵入血管并表現(xiàn)出遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[10-13]。例如，下調(diào)MMP-3的表達(dá)抑制了宮頸鱗癌細(xì)胞的侵襲[14]。本研究顯示，沉默MTA2下調(diào)了前列腺癌細(xì)胞中MMP-3的表達(dá)。此外，眾所周知，ERK通路在一系列腫瘤進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用，如增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并且，MMP-3的活性受到ERK通路的調(diào)節(jié)[15-16]。本研究中，沉默MTA2也下調(diào)了前列腺癌細(xì)胞中ERK1/2的活性，因此，MTA2對前列腺癌細(xì)胞侵襲的調(diào)控作用可能是由ERK1/2-MMP-3軸介導(dǎo)的。

趨化因子和受體網(wǎng)絡(luò)在組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)或造血效應(yīng)方面發(fā)揮作用，然而，它們也調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的遷移和侵襲[17-20]。嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(Eotaxin)家族是一組歸巢相關(guān)的CC趨化細(xì)胞因子[21-23]。Eotaxin參與嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞的募集。Eotaxin-1 (CCL11)在小鼠過敏性哮喘等多種炎癥性疾病中均過表達(dá)[24]。在腫瘤學(xué)領(lǐng)域，據(jù)報(bào)道Eotaxin-1是人非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)異常[25]。Eotaxin-1主要通過CC趨化因子受體-3(CCR3)發(fā)揮作用[26]。Eotaxin-1和CCR3的相互作用已被證明調(diào)控多種癌細(xì)胞的存活和轉(zhuǎn)移性[27]。CCR3作為Eotaxin-1的主要受體，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)上調(diào)，并且與不良的總體生存期相關(guān)[28]。本研究顯示，沉默MTA2下調(diào)了前列腺癌細(xì)胞中Eotaxin-1和CCR3的表達(dá)。已知CCR3在淋巴瘤細(xì)胞中激活ERK通路[29]，Eotaxin-1對人軟骨細(xì)胞MMP-3的上調(diào)依賴于ERK1/2的激活[30]。Zhu等[31]研究表明，Eotaxin/CCR3軸促進(jìn)前列腺癌的侵襲潛能，Eotaxin-1通過CCR3-ERK途徑上調(diào)MMP-3的表達(dá)，促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的侵襲。結(jié)合本研究結(jié)果，推測在前列腺癌發(fā)展過程中，MTA2的異常上調(diào)可能通過激活Eotaxin-CCR3-ERK1/2-MMP-3軸促進(jìn)了癌細(xì)胞的侵襲能力，而下調(diào)MTA2可能通過抑制該信號軸來抑制前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。然而，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中還需要進(jìn)一步驗(yàn)證Eotaxin-CCR3-ERK1/2-MMP-3軸在介導(dǎo)MTA2致癌作用中的主要功能和權(quán)重。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果提示，MTA2在前列腺癌組織中高表達(dá)并且與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和生存期相關(guān)。沉默MTA2降低了前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，并且抑制了Eotaxin-CCR3-ERK1/2-MMP-3軸的激活。