齊 茜，師 順，黃 勇，劉 洋，劉 勇，孟沛藝，劉曉林，張藝平，呂頻頻，張春暖

(河南科技大學 動物科技學院，河南 洛陽 471023)

0 引言

氨氮主要以離子態(tài)氨(NH4+)和非離子態(tài)氨(NH3)兩種形式廣泛存在于水環(huán)境中。低濃度氨氮對魚類的生存繁殖沒有明顯的影響，但是由于環(huán)境污染及集約化養(yǎng)殖，很多養(yǎng)殖水體中的氨氮含量已經(jīng)超過了正常范圍，導致氨氮在魚體內(nèi)過度積累，進而影響其正常生理機能，這可能是導致魚類死亡的真正原因[1-6]。已有研究表明：氨氮脅迫會不同程度造成金頭鯛(Sparusaurata)、團頭魴(Megalobramaamblycephala)、淇河鯽(Carassiusauratus)、虎斑烏賊(Sepiapharaonis)、花椒鼠(Corydoraspaleatus)和草魚(Ctenopharyngodonidellus)等鰓、腦組織出現(xiàn)細胞腫大、核偏移溶解和空泡化等損傷現(xiàn)象[7-13]，能誘導魚體組織抗氧化相關(guān)酶活性變化，例如,翹嘴鱖(Sinipercachuatsi)、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)、泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)、鯔魚(Mugilcephalus)、青魚(Mylopharyngodonpiceus)、圓斑星鰈(Veraspervariegatus)等[6,11-17]，以及一系列炎癥反應(yīng)，例如，大彈涂魚(Boleophthalmuspectinirostris)、翹嘴鱖、泥鰍、瓦氏黃顙魚、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)等[5-6,14,18-19]。研究表明：不同魚類的氨氮耐受性可能與自身的氮代謝途徑或生活的水層有關(guān)，其氨氮耐受能力存在明顯差異，也暗示不同魚類的氨氮調(diào)節(jié)機制不同[8-9]。因此，探究氨氮對魚類的毒性效應(yīng)，對揭示氨氮脅迫對魚類的毒性作用機制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用雜交鱘(體質(zhì)量(50.24±0.50) g)來自安陽自繁群體，試驗開始前取健康無病、規(guī)格基本一致的180尾雜交鱘于60 cm×30 cm×40 cm的玻璃缸中暫養(yǎng)7 d，水溫(21±0.5) ℃，pH7.5，溶解氧 6～8 mg/L，每天投喂2次，投餌率2%。暫養(yǎng)結(jié)束后，將試驗魚隨機分為3組(對照組0 mg/L；低質(zhì)量濃度組 10 mg/L；高質(zhì)量濃度組 50 mg/L)，每組3個重復，每個重復20尾。

1.2 試驗設(shè)計與樣品采集

試驗開始前2天停止投喂，以10 g/L NH4Cl母液調(diào)整至試驗設(shè)計的氨氮質(zhì)量濃度，每隔24 h換水1/3，氨氮脅迫時長為48 h，恢復48 h(即試驗第96 h)。其間內(nèi)循環(huán)，養(yǎng)殖條件同暫養(yǎng)條件，每隔8 h采用那納氏試劑比色法檢測水體氨氮質(zhì)量濃度。在試驗0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和96 h時，每桶分別隨機選擇3尾雜交鱘采樣。首先,用50 mg/L MS-222進行輕度麻醉，進行尾靜脈采血，全血離心10 min制備血清；然后，取鰓絲用液氮速凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆茫蛔詈?，取鰓絲、腦組織用磷酸鹽緩沖液漂洗，Bouin氏液固定保存。

1.3 試驗方法

腦組織與鰓組織經(jīng)Bouin氏液固定過夜,用于制作石蠟切片，具體步驟如下：過夜后樣本先用梯度乙醇(體積分數(shù)分別為70%、80%、90%、95%、100%)逐級脫水，再用1/2二甲苯、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明,石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(hematexylin-eosin，HE)染色，最后用顯微觀察并拍照。

血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、 過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)以及鰓絲Na+/K+-ATP均采用南京建成科技有限公司測試盒測定。取0.1 g樣品加入9倍體積的預冷生理鹽水，研磨成組織勻漿，4 ℃下3 000 r/min離心10 min，制備待測樣本，然后按試劑盒說明進行操作。

采用索萊寶試劑盒提取鰓絲總RNA，然后使用HIFIscript cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA?；诿绹鴩疑镄畔⒅行臄?shù)據(jù)庫鱘魚雜交種的親本獲得白介素1β(interleukin 1 beta，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)基因開放閱讀框序列，以β-actin為管家基因，在美國國家生物信息中心數(shù)據(jù)庫的Primer-BLAST程序中完成引物設(shè)計，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系(20.0 μL)：2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix 10.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O 8.2 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃、 105 s，60 ℃、1 min，72 ℃、32 s，進行40個循環(huán)；60 ℃、30 s，95 ℃、15 s。采用2-△△Ct法計算目的基因相對表達量[22]。

表1 雜交鱘炎癥反應(yīng)相關(guān)基因與內(nèi)參基因的實時熒光定量PCR引物序列

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Microsoft Excel軟件進行數(shù)據(jù)初步處理；利用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和Duncan’s多重比較，結(jié)果用均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨氮脅迫對雜交鱘大腦組織結(jié)構(gòu)的影響

不同質(zhì)量濃度氨氮脅迫下腦組織切片的變化分別如圖1和圖2所示。對照組腦組織可見清晰的粉紅色神經(jīng)纖維，以及被神經(jīng)纖維包裹的分泌細胞、支持細胞，且細胞無破損，神經(jīng)纖維排列緊密(見圖1a)。脅迫6～12 h時，高、低質(zhì)量濃度組，部分神經(jīng)細胞腫大，同時伴隨細胞核偏移現(xiàn)象，部分分泌細胞的細胞核溶解(見圖1b、圖1c、圖2b和圖2c)。脅迫24 h時，支持細胞幾乎消失不見，神經(jīng)纖維開始解體，神經(jīng)細胞出現(xiàn)大面積溶解(見圖1d和圖2d)。脅迫48 h時，低質(zhì)量濃度組神經(jīng)纖維解體現(xiàn)象明顯，并且伴有神經(jīng)元壞死的現(xiàn)象(見圖1e)，高質(zhì)量濃度組神經(jīng)纖維解體現(xiàn)象更加嚴重，神經(jīng)細胞破裂、細胞核溶解現(xiàn)象大面積發(fā)生(見圖2e)。解除氨氮脅迫恢復48 h后，低質(zhì)量濃度組神經(jīng)纖維破損解體現(xiàn)象發(fā)生很大程度的緩解，同時支持細胞也出現(xiàn)在視野內(nèi)，但神經(jīng)細胞腫脹現(xiàn)象依舊存在(見圖1f)，相比低質(zhì)量濃度組，高質(zhì)量濃度組恢復效果不明顯，神經(jīng)纖維破損依舊嚴重，且分泌細胞數(shù)量減少，并且分泌細胞腫脹現(xiàn)象明顯，支持細胞數(shù)量稀少(見圖2f)，腦組織受損情況依然嚴重。

(a) 對照組

(a) 對照組

2.2 氨氮脅迫與恢復對雜交鱘鰓組織結(jié)構(gòu)的影響

不同質(zhì)量濃度氨氮脅迫下雜交鱘鰓組織切片的變化如圖3和圖4所示。對照組，鰓絲排列整齊，僅有少量的分泌物(見圖3a)。高、低質(zhì)量濃度組，脅迫6～12 h時，鰓絲顏色均變淡，邊緣出現(xiàn)不整齊及腫脹現(xiàn)象，同時表面分泌物增多，泌氯細胞和上皮細胞中開始出現(xiàn)核溶解以及細胞空泡化(見圖3b、圖3c、圖4b和圖4c)。脅迫24 h時，細胞核溶解以及細胞空泡化現(xiàn)象進一步加劇，且高質(zhì)量濃度組較低質(zhì)量濃度組嚴重(見圖3d和圖4d)。脅迫48 h時，低質(zhì)量濃度組鰓絲變短，且鰓絲間距繼續(xù)增大，鰓表面上皮細胞排列紊亂現(xiàn)象大面積出現(xiàn)，同時細胞空泡化現(xiàn)象更為嚴重，鰓絲出現(xiàn)嚴重損傷變短，且鰓絲界限開始不易分辨(見圖3e)；高質(zhì)量濃度組，鰓絲邊緣模糊不清難以分辨，上皮細胞水性變腫，且大面積脫落，鰓絲變短、腫脹且相鄰鰓絲間距增大(見圖4e)。解除氨氮脅迫恢復48 h后，低質(zhì)量濃度組鰓的恢復情況良好，鰓表面分泌物減少，泌氯細胞完整，上皮細胞排列整齊，基本恢復到脅迫前水平(見圖3f)；而高質(zhì)量濃度組雖有所緩解，但并未恢復到氨氮脅迫前的水平，泌氯細胞和上皮細胞的細胞核溶解，細胞空泡化現(xiàn)象依然存在(見圖4f)。

(a) 對照組

(a) 對照組

2.3 氨氮脅迫與恢復對雜交鱘幼魚鰓絲Na+/K+-ATP酶活性的影響

與對照組相比，低質(zhì)量濃度組和高質(zhì)量濃度組Na+/K+-ATP酶活性均呈現(xiàn)下降-升高-降低的變化趨勢(見圖5)，其中，低質(zhì)量濃度組在脅迫12 h達到最低值，而高質(zhì)量濃度組在脅迫6 h達到最低值，均與對照組差異顯著(P<0.05)。脅迫12 h后，高、低質(zhì)量濃度組Na+/K+-ATP酶活性上升且在48 h達到最大值。解除氨氮脅迫恢復48 h后，兩個試驗組再次下降，與對照組差異不顯著(P>0.05)。

注：小寫字母不同表示兩者之間存在顯著性差異(P<0.05)，下同。

2.4 氨氮脅迫與恢復對雜交鱘血清抗氧化指標的影響

經(jīng)過不同氨氮質(zhì)量濃度脅迫后，雜交鱘幼魚血清中的抗氧化指標隨時間變化如圖6所示。脅迫6 h，低質(zhì)量濃度組和高質(zhì)量濃度組血清的SOD、CAT和GSH-Px酶活性較對照組顯著升高(P<0.05)。脅迫12 h，SOD降至最低點。脅迫24 h，GSH-Px降至最低點；解除氨氮脅迫恢復48 h后，3種酶活性降低均有恢復趨勢，其中，低質(zhì)量濃度組的SOD與對照組依舊差異顯著(P<0.05)，而CAT和GSH-Px與對照組無顯著差異(P>0.05)，高質(zhì)量濃度組SOD和GSH-Px與對照組無顯著性差異(P>0.05)，而CAT與對照組差異顯著(P<0.05)。MDA含量脅迫6 h與對照組無顯著變化(P>0.05)，低質(zhì)量濃度組24 h升高至最大值，高質(zhì)量濃度組12 h升高至最大值，而解除氨氮脅迫恢復48 h后，低質(zhì)量濃度組與對照組無顯著性差異(P>0.05)，高質(zhì)量濃度組顯著高于對照組(P<0.05)。

圖6 氨氮脅迫與恢復對雜交鱘幼魚血清抗氧化指標的影響

2.5 氨氮脅迫與恢復對雜交鱘鰓絲炎癥相關(guān)因子的影響

在高、低質(zhì)量濃度氨氮脅迫組，雜交鱘幼魚鰓絲IL-1β基因和TNF-α基因表達量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(見圖7)。脅迫12 h，高、低質(zhì)量濃度組IL-1β基因相對表達量顯著高于對照組(P<0.05)。脅迫6 h，高濃度組TNF-α基因相對表達量顯著升高(P<0.05)。脅迫12 h，低質(zhì)量濃度組TNF-α基因相對表達量顯著升高，且顯著高于對照組(P<0.05)。解除氨氮脅迫恢復48 h后，IL-1β基因和TNF-α基因相對表達量顯著下調(diào)，低質(zhì)量濃度組與對照組差異不顯著(P>0.05)，而高質(zhì)量濃度組仍顯著高于對照組(P<0.05)。

(a) IL-1β基因 (b) TNF-α基因

3 討論

腦是魚的神經(jīng)中樞，是調(diào)控機體各系統(tǒng)的最高中樞。文獻[23]研究表明：高質(zhì)量濃度的氨氮脅迫會對神經(jīng)細胞造成損傷，甚至導致神經(jīng)細胞死亡。腦組織中的膠質(zhì)細胞在氨氮脅迫過程中發(fā)生腫脹變性，最終導致腦組織發(fā)生氧化損傷而死亡[1]。在對淇河鯽魚的研究中發(fā)現(xiàn)，氨氮脅迫可以破壞腦組織中的神經(jīng)纖維，神經(jīng)細胞體不同程度壞死，導致其神經(jīng)系統(tǒng)功能發(fā)生障礙[9]。在對鯉鯽魚的研究中，發(fā)現(xiàn)氨氮會對腦組織中的血液循環(huán)產(chǎn)生影響，阻礙神經(jīng)細胞分泌神經(jīng)遞質(zhì)，從而導致機體各種代謝途徑受阻[24]。本研究中，雜交鱘幼魚經(jīng)過不同質(zhì)量濃度的氨氮脅迫后，其腦中神經(jīng)纖維出現(xiàn)不同程度的破壞，分泌細胞和支持細胞部分細胞核溶解并空泡化，尤其是高質(zhì)量濃度脅迫下更為嚴重，與淇河鯽魚情況相近；解除氨氮脅迫恢復后，高質(zhì)量濃度組的恢復效果遠不如低質(zhì)量濃度組。以此推斷氨氮脅迫對腦細胞的損傷可能破壞雜交鱘幼魚機體神經(jīng)活動，影響神經(jīng)遞質(zhì)的合成以及釋放，進而影響到機體其他系統(tǒng)的功能正常運轉(zhuǎn)，而且隨著氨氮質(zhì)量濃度增大，對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷越來越嚴重且難以恢復，從而對雜交鱘魚的生存和生長產(chǎn)生阻礙甚至導致死亡。但是，氨氮影響的是何種神經(jīng)遞質(zhì)的合成及釋放還需要做進一步探究。

鰓是雜交鱘幼魚重要的呼吸器官，并且直接參與外界環(huán)境與內(nèi)環(huán)境之間的物質(zhì)交換過程，同時也是重要的調(diào)節(jié)水鹽平衡和新陳代謝的器官。因此，外界環(huán)境變化對鰓組織的影響尤為明顯。針對鯽魚和花椒鼠的研究表明，長期暴露于有毒有害物質(zhì)中，鰓組織更容易遭受明顯的損傷，其損傷情況與本研究類似。本試驗中，無論高質(zhì)量濃度或低質(zhì)量濃度的氨氮脅迫都會導致鰓絲組織上皮細胞紊亂，泌氯細胞等細胞出現(xiàn)水腫、細胞核溶解和空泡化，鰓絲變短，鰓絲基部出現(xiàn)不同程度的充血，鰓絲之間的距離增大。文獻[13]研究了草魚氨氮脅迫對鰓組織的損傷，與本試驗中雜交鱘相比，草魚的鰓組織受損情況更加嚴重，可能和魚本身的氨氮耐受性有關(guān)。不同質(zhì)量濃度氨氮脅迫的恢復過程中，高質(zhì)量濃度的氨氮脅迫難以恢復到脅迫前水平，但相比較腦組織，鰓的恢復能力要更強。

Na+/K+-ATP酶作為鰓組織上泌氯細胞和細胞器膜上的一種重要的蛋白酶，對于魚體滲透調(diào)節(jié)作用具有非常特殊的作用[15]。本研究中，隨著氨氮脅迫的持續(xù)，鰓絲的Na+/K+-ATP酶活性呈先降低再升高又降低的變化趨勢，且高質(zhì)量濃度組比低質(zhì)量濃度組下降速度更快。這與鯔魚(Mugilcephalus)的慢性氨氮脅迫研究結(jié)果相同，在較高質(zhì)量濃度脅迫下，非離子氨氮對鰓絲的直接損傷加重，導致鰓絲細胞膜磷脂過氧化，進而造成生物膜功能和結(jié)構(gòu)的完整性受損，同時Na+/K+-ATP酶活性受到抑制[15]。在低鹽度脅迫下的銀鯧魚(Pampusargenteus)試驗中也發(fā)現(xiàn)，Na+/K+-ATP酶活性受環(huán)境脅迫的抑制作用具有時序性，氨氮脅迫的持續(xù)作用能刺激機體的主動滲透調(diào)節(jié)機制，而且滲透調(diào)節(jié)機制作用效果隨脅迫質(zhì)量濃度變高而增強[25]。本試驗也與青魚和圓斑星鰈的研究結(jié)果相近，脅迫初期由于水體中高質(zhì)量濃度氨氮通過滲透作用進入機體，機體氨氮排泄過程受阻，通過影響Na+/K+-ATP酶蛋白結(jié)構(gòu)使酶活力降低，之后魚體內(nèi)滲透壓不斷提高激活體內(nèi)滲透機制，機體通過主動滲透調(diào)節(jié)使得酶活性上升[16-17]。

當環(huán)境中的生態(tài)因子發(fā)生改變時，將導致魚體產(chǎn)生一系列的魚體應(yīng)激反應(yīng)，這包括其體內(nèi)的活性氧自由基的產(chǎn)生遠大于消耗，從而導致機體受到不同程度的損傷[26]。CAT、SOD、GSH-Px是機體進行氧化代謝的重要酶類，在其共同作用下，使自由基的產(chǎn)生和清除達到動態(tài)平衡，減少機體氧化損傷，是機體內(nèi)重要的保護酶系統(tǒng)[26-27]。在本研究中，無論是10 mg/L還是50 mg/L 的氨氮質(zhì)量濃度脅迫下，雜交鱘幼魚的CAT、SOD、GSH-Px均顯著高于對照組，分析這種短時間內(nèi)的升高變化可能與毒性興奮效應(yīng)有關(guān)，機體內(nèi)魚體代謝平衡受到干擾，進而啟動抗氧化防御及一系列修復機制[19]。脅迫6～48 h后，CAT、SOD、GSH-Px酶活性均不同程度降低，可能是隨著氨氮脅迫時間的延長，雜交鱘體內(nèi)的活性氧自由基已超出抗氧化系統(tǒng)調(diào)節(jié)范圍，與青魚與大菱鲆的研究報道一致[16,19]。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，是生物體內(nèi)自由基的指示物，常常作為各種氧自由基損傷機體的指標。本研究中，血清MDA含量在脅迫12 h時顯著升高，解除氨氮脅迫恢復48 h后，高、低質(zhì)量濃度組的MDA含量均不同程度高于脅迫發(fā)生前，說明機體循環(huán)代謝受到的損傷依然存在。

炎癥反應(yīng)可以反映組織受損傷的程度，并促進組織修復[28-29]。TNF-α是主要的促炎癥細胞因子之一，能夠刺激促炎癥細胞因子如IL-1β等的釋放，增強它們的生物效應(yīng)，并為體內(nèi)的炎癥和細胞損傷程度提供關(guān)鍵指標[30]。河豚(Takifuguobscurus)鰓炎癥因子TNF-α基因和IL-1β基因在氨氮脅迫下誘導表達[31]。本研究中，高、低質(zhì)量濃度組脅迫6 h后，雜交鱘幼魚鰓絲IL-1β基因和TNF基因的相對表達量均顯著上調(diào)，與翹嘴鱖幼魚的研究結(jié)果類似[7]，分析這種短時間內(nèi)的升高變化應(yīng)與毒性興奮效應(yīng)有關(guān)，在啟動抗氧化防御及一系列修復機制的同時，上調(diào)炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達[19]；而大彈涂魚在8.99 mg/L質(zhì)量濃度下脅迫6 h時，TNF基因相對表達量顯著降低[6]，這與魚品種的耐受性相關(guān)，大彈涂魚的氨氮耐受力低于施氏鱘、中華鱘(A.sinensis)和翹嘴鱖等[5]。解除氨氮脅迫恢復48 h后，低質(zhì)量濃度組和高質(zhì)量濃度組的雜交鱘幼魚鰓絲內(nèi)的TNF-α基因和IL-1β基因表達量顯著下調(diào)，但是高質(zhì)量濃度組沒有恢復到正常水平，說明高質(zhì)量濃度的氨氮脅迫能抑制和炎癥反應(yīng)有關(guān)酶的活性以及基因表達的水平，短暫恢復后不能恢復到健康的水平，這與鰓部組織切片觀察的結(jié)果一致。在養(yǎng)殖中，要避免長時間高質(zhì)量濃度脅迫對養(yǎng)殖對象的影響，還要注意養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)中的氨化等因素對氨氮含量的影響[32]。

4 結(jié)論

(1)氨氮脅迫會對雜交鱘幼魚的神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)及抗氧化能力造成損傷。

(2)面對氨氮脅迫，雜交鱘幼魚在短時間內(nèi)有一定的自我修復能力。

(3)雜交鱘養(yǎng)殖中應(yīng)避免氨氮高質(zhì)量濃度長時間脅迫。