包春霞，富玉蘭，何烏云嘎，王秀蘭，奧·烏力吉

蒙藥吉祥安坤丸是蒙醫(yī)臨床上治療婦科疾病的首選藥物，由益母草、赤瓟子、木香、土木香、丁香、紅花等18味藥物配伍組成，具有調(diào)經(jīng)活血，補(bǔ)氣安神之功效[1]。吉祥安坤丸在臨床上主要用于月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、絕經(jīng)綜合征、異常子宮出血及乳腺增生等疾病的治療，且療效顯著。目前，對(duì)于吉祥安坤丸的研究主要圍繞臨床應(yīng)用方面，藥理研究甚少。本實(shí)驗(yàn)以未成年雌性大鼠為研究對(duì)象，給予不同劑量的吉祥安坤丸灌胃，對(duì)其傳統(tǒng)功效進(jìn)行研究，為該藥在臨床上精確應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)未成年雌性SD大鼠36只，25日齡，體質(zhì)量70～80 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司(遼寧省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(遼)2020-0001。飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古民族大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房，溫度22～24 ℃，濕度50%～60%，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d無異常的大鼠納入實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)符合相關(guān)倫理學(xué)要求。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 吉祥安坤丸(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥制劑室，批號(hào)：內(nèi)藥制字14060899)；卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)、孕酮(PROG)、睪酮(T)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白細(xì)胞介素-6(IL-6)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒均購(gòu)自江蘇晶美生物科技有限公司；雌激素受體(ER)免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自中國(guó)Affinity公司；95%乙醇和甲醛溶液均購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；Cole氏蘇木素染色液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；署紅Y購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；NIKON Eclipes顯微鏡購(gòu)自上海土森視覺科技有限公司；eppendorf離心機(jī)購(gòu)自廣州吉源生物科技有限公司；TECAN SPARK多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自上海閃譜生物科技發(fā)展有限公司；DP73顯微鏡拍照系統(tǒng)購(gòu)自日本OLYMPUS公司。

1.3動(dòng)物分組與給藥 將未成年雌性SD大鼠隨機(jī)分為低、高劑量組和對(duì)照組，每組12只。低、高劑量組分別給予1.0、2.0 g/(kg·d)吉祥安坤丸混懸液灌胃，對(duì)照組給予等體積蒸餾水灌胃，3組均連續(xù)給藥21 d。

1.4觀察指標(biāo)及方法

1.4.1體質(zhì)量及臟器系數(shù)：各組大鼠每4天稱量體質(zhì)量，給藥21 d后，采用陰道細(xì)胞涂片觀察發(fā)情周期，選擇動(dòng)情間期處理大鼠，稱量體質(zhì)量。每組隨機(jī)選取8只大鼠按1～8的順序編號(hào)，麻醉后腹主動(dòng)脈取血，室溫放置30 min后，以3000 r/min離心10 min，收集上清液，于-80 ℃冷凍保存。采血后取大鼠卵巢和子宮，生理鹽水洗凈，濾紙吸干，稱量卵巢和子宮濕質(zhì)量，然后用4%甲醛固定。計(jì)算其臟器系數(shù)，臟器系數(shù)(%)=臟器濕質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%。

1.4.2發(fā)情周期陰道細(xì)胞涂片觀察：各組大鼠給藥最后10 d每天8：00～8：30做陰道涂片，暴露陰道后，用蘸有少許生理鹽水的無菌小棉簽，緩慢置于大鼠陰道內(nèi)，輕輕旋轉(zhuǎn)，然后將蘸取的陰道細(xì)胞均勻涂在載玻片上，待涂片稍干后，用95%乙醇固定，HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察，連續(xù)觀察2個(gè)發(fā)情周期。發(fā)情周期4～5 d為正常，<4 d或>5 d均為發(fā)情周期紊亂，<4 d為發(fā)情周期縮短，>5 d為發(fā)情周期延長(zhǎng)[2]。發(fā)情周期紊亂率=每組發(fā)情周期紊亂大鼠只數(shù)/每組大鼠總只數(shù)×100%。

1.4.3血清性激素及細(xì)胞因子測(cè)定：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清FSH、LH、E2、PROG、T、IGF-Ⅰ、VEGF、TNF-α及IL-6水平。操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度。

1.4.4卵巢和子宮組織ER的表達(dá)：采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)。稱量卵巢、子宮質(zhì)量，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40 g/L的甲醛固定，常規(guī)制片，厚約50 μm，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色程序后封片，運(yùn)用Image J軟件進(jìn)行定量分析卵巢和子宮組織ER的表達(dá)情況。平均光密度(AOD)=累積光密度(IOD)/面積。

2 結(jié)果

2.1吉祥安坤丸對(duì)體質(zhì)量及卵巢、子宮系數(shù)的影響 3組體質(zhì)量和卵巢系數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組比較，低劑量組子宮系數(shù)下降，但比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而高劑量組子宮系數(shù)明顯上升(P<0.05)。表明未成年雌性大鼠子宮可能為吉祥安坤丸的靶器官。見圖1。

圖1 不同劑量吉祥安坤丸處理未成年雌性SD大鼠3組體質(zhì)量及卵巢、子宮系數(shù)比較

2.2吉祥安坤丸對(duì)發(fā)情周期的影響 通過觀察陰道細(xì)胞涂片判斷大鼠發(fā)情周期，動(dòng)情前期以有核上皮細(xì)胞為主；動(dòng)情期以角化上皮細(xì)胞為主，呈“落葉狀”堆積或相互連接成片；動(dòng)情后期以角化上皮細(xì)胞、有核上皮細(xì)胞和白細(xì)胞為主，3種細(xì)胞數(shù)量差異不大；動(dòng)情間期以白細(xì)胞為主[3]。見圖2。對(duì)照組發(fā)情周期延長(zhǎng)7只、未發(fā)情1只，發(fā)情周期紊亂率為100.0%；低劑量組發(fā)情周期延長(zhǎng)1只、正常7只，發(fā)情周期紊亂率為12.5%；高劑量組發(fā)情周期延長(zhǎng)4只、正常4只，發(fā)情周期紊亂率為50.0%；與對(duì)照組比較，低、高劑量組發(fā)情周期紊亂率明顯下降(P<0.05，P<0.01)，但低、高劑量組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明吉祥安坤丸能改善發(fā)情周期。

圖2 未成年雌性SD大鼠發(fā)情各期的陰道細(xì)胞涂片(HE ×40)

2.3吉祥安坤丸對(duì)血清性激素的影響 3組血清FSH和T水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組比較，高劑量組血清LH、E2、PROG水平均明顯升高，低劑量組血清LH水平也明顯升高(P<0.05，P<0.01)。表明吉祥安坤丸對(duì)卵泡的發(fā)育及排卵有一定的促進(jìn)作用。見表1。

表1 不同劑量吉祥安坤丸處理未成年雌性SD大鼠3組血清性激素水平比較

2.4吉祥安坤丸對(duì)血清細(xì)胞因子的影響 與對(duì)照組比較，低、高劑量組血清TNF-α水平明顯下降(P<0.05)；而VEGF、IL-6水平有上升趨勢(shì)，IGF-Ⅰ水平有下降趨勢(shì)，但3組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明吉祥安坤丸可能對(duì)炎性因子具有抑制作用。見表2。

表2 不同劑量吉祥安坤丸處理未成年雌性SD大鼠3組血清細(xì)胞因子水平比較

2.5吉祥安坤丸對(duì)卵巢和子宮組織ER表達(dá)的影響 光鏡下可見，ER蛋白不同程度地表達(dá)于低、高劑量組和對(duì)照組卵巢顆粒細(xì)胞和子宮組織中。見圖3和4。圖像分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，低劑量組卵巢和子宮組織ER表達(dá)水平明顯升高，高劑量組子宮組織ER表達(dá)水平明顯上升(P<0.05)。表明吉祥安坤丸能促進(jìn)卵巢、子宮組織中ER的表達(dá)。見表3。

圖3 不同劑量吉祥安坤丸處理未成年雌性SD大鼠3組卵巢組織雌激素受體表達(dá)情況

圖4 不同劑量吉祥安坤丸處理未成年雌性SD大鼠3組子宮組織雌激素受體表達(dá)情況

表3 不同劑量吉祥安坤丸處理未成年雌性SD大鼠3組卵巢和子宮組織ER表達(dá)水平比較

3 討論

蒙藥吉祥安坤丸又名烏力吉-18味丸，出自蒙醫(yī)藥經(jīng)典著作《觀者之喜》，由益母草、赤瓟子、木香、土木香等18味藥物組成，方中以活血、調(diào)經(jīng)的益母草和破血痞及治療陰道疾患的赤瓟子為主藥，輔以木香、土木香調(diào)和氣血，佐以丁香理氣、紅花清血熱，加以沙棘、山奈、硼砂活血化瘀、破癖，以小白蒿、刺柏葉、熊膽鎖脈止血；又佐以鹿茸、冬蟲夏草補(bǔ)益經(jīng)血、強(qiáng)筋壯骨；以牛黃、朱砂清熱鎮(zhèn)靜；以長(zhǎng)喙訶子、五靈脂祛痹、調(diào)和體素。該方用以治療婦女氣血相搏、月經(jīng)不調(diào)、腰骶關(guān)節(jié)痛、頭痛、多汗、周身沉重、四肢水腫、產(chǎn)褥熱、乳腺腫脹等諸癥，故為治療婦科疾病首選之藥[4]。蒙醫(yī)臨床上應(yīng)用廣泛，療效明確。

未成年雌性大鼠發(fā)情周期受日漸成熟的下丘腦-垂體-卵巢軸支配。生理狀態(tài)下，卵巢在周期性的排卵和分泌相應(yīng)性激素的同時(shí)，還伴隨陰道上皮細(xì)胞周期性變化及脫落。據(jù)研究報(bào)道，大鼠發(fā)情周期中陰道脫落細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化主要受雌激素水平變化的影響，E2分泌不足，會(huì)造成發(fā)情周期延長(zhǎng)和動(dòng)情期縮短，故發(fā)情周期紊亂可以作為反映性激素分泌是否失衡的指標(biāo)[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，吉祥安坤丸明顯升高未成年雌性大鼠血清E2水平，并改善大鼠的發(fā)情周期。該結(jié)果與吉祥安坤丸調(diào)經(jīng)活血之傳統(tǒng)功效完全吻合。

細(xì)胞因子是影響女性生殖系統(tǒng)生理和病理過程的重要因素。近年來，細(xì)胞因子已成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。IGF-Ⅰ是由生長(zhǎng)激素刺激肝臟產(chǎn)生的一類廣譜性促生長(zhǎng)因子，其生物學(xué)作用廣泛，能模擬生長(zhǎng)激素的某些生物學(xué)效應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，抑制細(xì)胞凋亡，還具有類似胰島素的代謝活性及免疫調(diào)節(jié)作用，是反映生長(zhǎng)激素生物功能的靈敏指標(biāo)[6-7]。VEGF是重要的血管形成因子和血管通透因子，由內(nèi)皮細(xì)胞和子宮內(nèi)膜中的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。近來研究發(fā)現(xiàn)，VEGF參與調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的生長(zhǎng)、胚胎的發(fā)育、卵巢血管的生成及腫瘤的生長(zhǎng)，在女性生殖功能方面起著重要的作用[8-9]。TNF-α和IL-6是機(jī)體重要的炎性因子，具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)作用，也是機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)。有研究表明，當(dāng)女性生殖器官感染時(shí)，血清TNF-α和IL-6的含量明顯升高[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，吉祥安坤丸對(duì)血清VEGF、IGF-Ⅰ水平無明顯影響，但能明顯降低血清TNF-α水平。一項(xiàng)吉祥安坤丸藥理研究結(jié)果表明其具有抗炎作用[11]，而本實(shí)驗(yàn)明確了吉祥安坤丸具有抑制炎性因子作用。由此可見，吉祥安坤丸對(duì)女性生殖器官感染可能有一定的療效。

人類生殖功能是機(jī)體內(nèi)外各種因素綜合調(diào)控的結(jié)果，而起主要調(diào)控作用的是下丘腦-垂體-性腺軸，其生理功能正常是維持女性性腺生殖功能的重要保證[12-15]。腺垂體能夠分泌促性腺激素FSH和LH，F(xiàn)SH促進(jìn)女性卵泡發(fā)育，且在LH協(xié)同作用下使卵泡分泌雌激素和孕激素，PROG通常在E2作用的基礎(chǔ)上發(fā)揮作用，可限制子宮內(nèi)膜增生，使增生期內(nèi)膜轉(zhuǎn)化為分泌期[16-18]。另外，女性進(jìn)入青春期后，卵巢開始分泌雌激素，與靶器官的ER結(jié)合，促進(jìn)陰道、子宮、輸卵管及卵巢的發(fā)育，同時(shí)促使子宮內(nèi)膜增生而產(chǎn)生月經(jīng)。目前研究表明，青春期異常子宮出血原因在于性腺發(fā)育不成熟，雌激素分泌呈持續(xù)低水平，導(dǎo)致無排卵，致使缺乏PROG對(duì)子宮內(nèi)膜增生的拮抗，使子宮內(nèi)膜漸進(jìn)性增生過度，導(dǎo)致不規(guī)律出血、崩漏[19]。本研究結(jié)果顯示，吉祥安坤丸對(duì)未成年雌性大鼠血清FSH無顯著影響，但能夠明顯升高血清LH、E2、PROG水平及子宮系數(shù)，對(duì)卵巢、子宮組織ER的表達(dá)也有一定的促進(jìn)作用，故而推測(cè)吉祥安坤丸對(duì)卵泡發(fā)育及排卵有一定的促進(jìn)作用，并對(duì)子宮發(fā)育也有一定的影響，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)子宮、卵巢組織ER有關(guān)，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。吉祥安坤丸在歷代傳統(tǒng)蒙醫(yī)經(jīng)典書籍中均有記載，由于其傳承有別，各地區(qū)對(duì)此方藥用量不同而出現(xiàn)臨床療效不同。本實(shí)驗(yàn)中，高劑量組子宮系數(shù)、血清LH、E2、PROG水平及子宮組織ER表達(dá)水平明顯升高，而低劑量組只有血清LH水平及卵巢和子宮組織ER表達(dá)水平升高，而對(duì)血清E2、PROG水平無明顯影響，故認(rèn)為高劑量組的作用較低劑量組更優(yōu)。

本實(shí)驗(yàn)從吉祥安坤丸對(duì)未成年雌性大鼠發(fā)情周期、性激素、細(xì)胞因子、臟器系數(shù)及卵巢和子宮ER表達(dá)的影響入手，對(duì)其藥理藥效進(jìn)行基礎(chǔ)研究，結(jié)果提示吉祥安坤丸能明顯升高未成年雌性大鼠血清LH、E2、PROG水平及卵巢、子宮組織ER表達(dá)水平，降低血清TNF-α水平，并改善發(fā)情周期。本研究為后續(xù)吉祥安坤丸傳統(tǒng)功效的作用機(jī)制研究，提供了一種新的思路與方法。