梁風塵，周晉華，吳 歡，胡尚影

(1.安徽中醫(yī)藥大學研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031；3.安徽中醫(yī)藥大學科研技術中心，安徽 合肥 230031)

超高效液相色譜-四級桿飛行時間串聯質譜(ultra-performance liquid chromatography/quadrupole time-of-flight-tandem mass spectrometry,UPLC-QTOF/MS)是中藥單品及復方入血成分分析鑒定工作的有力手段,具有高分辨率、高靈敏度、分析速度快等特點[1]。UPLC法已成功應用于復方守宮散中皂苷、二苯乙烯苷、蒽醌類成分的含量測定[2-4]，為復方守宮散的物質基礎研究提供了一定的依據，而多級串聯功能的高分辨質譜與液相色譜聯用儀可為中藥化學成分研究提供更有力的鑒別手段[5]。因此，為了進一步驗證并鑒定復方守宮散的化學成分以及在大鼠血漿中的移行成分，本研究采用UPLC-QTOF/MS對復方守宮散原藥化學成分和灌胃復方守宮散后的大鼠血漿中藥物移行成分進行研究，以期為復方守宮散的質量標準制定及其臨床應用提供科學依據。

復方守宮散由守宮、何首烏、梅花、生曬參、三七、沒藥6味中藥組成，是安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科經驗方。目前，關于復方守宮散的研究主要集中于臨床、藥理等方面[6]，對其化學成分及血中移行成分的研究較少。本實驗以UPLC作為復雜組分的分離工具，以QTOF/MS作為定性鑒別手段，通過獲取目標物中各種成分離子的精確質核比，同時結合各個成分的二級質譜信息，再參考UNIFI(沃特世科學信息平臺)質譜數據庫和復方中單味藥材已有定性分析的文獻[7-9]，旨在建立一種快速高效的復方守宮散化學成分及其血中移行成分定性分析方法。

1 材料

1.1 儀器設備 沃特世超高效液相色譜儀(ACQUITY UPLC)、沃特世高分辨質譜儀(Waters Synapt G2-Si QTOF)、ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)：Waters；Vortex-2 Genie型臺式高速離心機：Eppendorf；Vortex-2 Genie渦旋混合器：Scientific Industries；WD-9415C超聲波清洗器：北京市六一儀器廠。

1.2 藥品和制劑 人參皂苷Re標準品(批號 J2121165，含量20 mg)、三七皂苷R1標準品(批號 D1828145，含量20 mg)、大黃素標準品(批號 H2119124，含量20 mg)、丁香酚標準品(批號 C2130380，含量20 mg)、綠原酸標準品(批號 D2122129，含量20 mg)、槲皮素標準品(批號 J2127453，含量20 mg)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；復方守宮散(批號 20210423，含量75 g)：安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑中心提供；分析用水是超純水，乙腈、甲醇等為色譜純，其余試劑均是分析純。

1.3 動物 雄性SD大鼠，SPF級，體質量(200±20)g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心[生產許可證號：SCXK(皖)2017-001]提供。動物實驗經安徽中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會批準，批文編號為AHUCM-rats-2021086。

2 方法

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm，直徑1.8 μm)；柱溫：35 ℃；進樣容積：10 μL；流速：0.25 mL/min；流動相：A(去離子水，含0.1%甲酸)和B(乙腈，含0.1%甲酸)，梯度洗脫(0～15 min，0%～20% B；15～50 min，20%～100% B；50～60 min，100% B；60～70 min，100%～0% B)。

2.1.2 質譜條件 質譜系統：Synapt G2-Si；質量范圍：50～1 500 Da；掃描時間：0.1 s；掃描離子模式：MSE，電噴霧離子源負離子模式(ESI-)和電噴霧離子源正離子模式(ESI+)下分別采集數據；參比化合物：亮氨酸-腦啡肽(掃描時間：0.3 s；間隔時間：15 s)；毛細管電壓：3 kV(ESI+)/2.5 kV(ESI-)；錐孔電壓：40 V；碰撞能：10～50 eV；離子源溫度：125 ℃；脫溶劑溫度：500 ℃；錐孔氣流速：50 L/h；脫溶劑氣流速：800 L/h；分析時間：70 min。

2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Re、三七皂苷R1、槲皮素、大黃素和綠原酸標準品適量，分別加入二甲基亞砜溶解為1 mg/mL標準品溶液。精確稱取丁香酚標準品適量，加入乙腈溶解為1 mg/mL標準品溶液。取各標準品溶液10 μL，加入1.5 mL EP管中，加入940 μL 80%甲醇水溶液[V(甲醇)∶V(水)=80∶20]，稀釋為各標準品濃度為10 μg/mL的混合標準品溶液，裝瓶，待測。

2.3 復方守宮散原藥樣品溶液的制備 取復方守宮散樣品100 mg，置于15 mL離心管內，加入10 mL無水甲醇，超聲30 min，取上清1 mL置于離心管中，14 000 r/min離心5 min，取上清，過0.22 μm微孔濾膜后，置入進樣瓶中，用于UPLC-QTOF/MS分析。

2.4 動物實驗

2.4.1 復方守宮散給藥樣品溶液制備 于灌胃前精密稱取復方守宮散適量，加入溫純水適量，用渦旋混合器混合均勻，制成0.1 g/mL復方守宮散溶液。

2.4.2 實驗動物飼養(yǎng)、給藥、取血 將7周齡SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)室溫度為(25±2)℃，濕度為50%±10%，12 h人工晝夜交替，自由取食，自由飲水。第7日20:00至第8日8:00禁食12 h，期間自由飲水。禁食結束后從大鼠眼眶靜脈叢采集血樣1 mL，置于含肝素離心管中，3 000 r/min離心15 min，收集上清液，即空白血漿。按1.0 g/kg給大鼠灌胃復方守宮散溶液2 mL，灌胃后0.5、1、2 h，分別從眼眶靜脈叢取血0.3 mL，離心，收集含藥血漿，混合搖勻，置于-80 ℃冰箱貯藏，備用。

2.5 復方守宮散的血中移行成分定性分析 取含藥血漿樣品100 μL，置于1.5 mL EP管內，加入300 μL乙腈沉淀蛋白，渦旋2 min，14 000 r/min離心5 min，取上清液100 μL，置入進樣瓶中，用于UPLC-QTOF/MS分析。采用相同條件處理空白血漿樣品。應用UPLC-QTOF/MS對上述樣品進行定性分析，主要根據所測得化合物的相對分子量，應用UNIFI軟件在規(guī)定的誤差范圍(±10-5Da)內計算可能的元素組成，結合各個成分色譜峰的二級質譜碎片信息等對色譜峰進行定性分析。

3 結果

在復方守宮散原藥樣品溶液中共鑒定出77個化學物質，包括皂苷類25個(三七皂苷6個，人參皂苷19個)、黃酮類13個、醌類12個(蒽醌類10個，萘醌類1個，含醌類1個)、糖類4個、脂酸類4個、氨基酸類3個、兒茶素類2個、芳香醇類2個、二萜類2個、揮發(fā)油類2個、其他類8個。再通過比較復方守宮散原藥樣品溶液、混合對照品溶液、空白血漿和含藥血漿的保留時間及質譜信息，剔除在空白血漿樣品中存在以及未在原藥樣品中發(fā)現的物質成分，最終在含藥血漿中確定了27個移行成分，其中皂苷類10個(三七皂苷1個，人參皂苷9個)、黃酮類6個、醌類6個(蒽醌類5個，含醌類1個)、揮發(fā)油類2個、其他類3個。復方守宮散的化學成分及其在大鼠血漿中移行成分見表1。原藥溶液、含藥血漿、空白血漿、對照品溶液的TIC圖見圖1，典型化合物大黃素的二級質譜圖及裂解規(guī)律見圖2。

注：A.復方守宮散溶液TIC圖(正離子模式)；B.復方守宮散溶液TIC圖(負離子模式)；C.含藥血漿TIC圖(正離子模式)；D.含藥血漿TIC圖(負離子模式)；E.空白血漿TIC圖(正離子模式)；F.空白血漿TIC圖(負離子模式)；G.標準品TIC圖(正離子模式)；H.標準品TIC圖(負離子模式)

圖2 大黃素的二級質譜和質譜裂解規(guī)律圖

表1 復方守宮散的化學成分及其在大鼠血漿中移行成分

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

如表1所示，在ESI-模式下共鑒定出復方守宮散化學成分66個、大鼠血漿中移行成分24個，ESI+模式下共鑒定出復方守宮散化學成分35個、大鼠血漿中移行成分5個，其中在兩種模式下均發(fā)現的有復方守宮散化學成分24個、大鼠血漿中移行成分2個。

4 討論

復方守宮散具有補虛解毒、清腫止痛的功效，自1998年開始應用于臨床以來，其療效一直較為肯定，臨床常用于治療伴有體虛、乏力、納差、疼痛的腫瘤患者[10-12]。

中藥復方化學成分復雜，口服給藥后，可吸收成分被直接吸收入血，或轉化為相應代謝產物進入血液。通過血清藥物化學研究可以確定中藥復方中有效成分，以此為標準建立定量和定性方法，可以促進中藥復方及中藥制劑的質量標準化。本研究利用中藥血清藥物化學方法初步研究復方守宮散的血中移行成分，旨在明確其藥效的物質基礎，幫助建立復方守宮散質量標準的相關指標。經過測定，在復方守宮散中鑒定出77個化學成分，能夠入血的成分達到27個。其中，何首烏的主要成分之一大黃素不僅能夠抗腫瘤，而且可以抗菌、止咳、降血壓[13]。人參有效成分20(S)-人參皂苷Rh2可使白血病患者癌細胞中HDAC1、HDAC6及HDAC2的表達水平降低，并減低其活性,最終產生遏制癌細胞增殖的效果[14]。三七皂苷R1可以通過抑制HeLa細胞的生長，改善細胞縫隙連接功能，提升順鉑的細胞毒性等，從而發(fā)揮緩解病情的作用[15]。綠原酸是梅花的化學成分之一，具有抗腫瘤和廣譜的抗菌、抗病毒作用[16]。丁香酚是沒藥主要成分之一，不但具有明顯的抗氧化作用，而且在一定濃度下對致病性真菌和金黃色葡萄球菌具有顯著抑制作用[17]。這些化學成分的藥理作用不僅在一定程度上對應復方中藥物的功效，而且有助于從潛在的物質基礎角度解釋復方守宮散抗腫瘤等作用的機制。因此，結合復方中各味中藥的藥理學研究結果和傳統功效，可以初步推斷，本次實驗測定的27種血中移行成分可能是復方守宮散藥效物質基礎的重要組成部分。

綜上所述，UPLC-QTOF/MS技術不僅為復方守宮散的血中移行成分的定性分析提供了一種簡便有效的分析手段，而且也為該制劑的有效成分研究及質量標準的制定提供一定參考。但是，復方守宮散的分析仍存在成分復雜、分離難度大、作用機制欠明確等問題，方中所含動物藥(守宮)的血中移行成分暫時無法運用UPLC-QTOF/MS技術進行鑒定，從而限制了復方守宮散的臨床推廣及基礎研究。