王建鋒 杜海榮 張明海

(東北林業(yè)大學(xué)野生動物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040)

冬眠是一些動物在冬季長時間不活動、不攝食而進(jìn)入睡眠狀態(tài)，并伴隨著體溫和新陳代謝速率降低的一種越冬對策[1]。除了外部長期蟄伏的冬眠表現(xiàn)，在內(nèi)部生理方面還通過降低體溫、新陳代謝速率，利用體內(nèi)激素如脂聯(lián)素、胰島素等改變能量轉(zhuǎn)化方式及路徑，提高能量利用效率的同時減少能量消耗[2]。冬眠期間，絕大多數(shù)動物不進(jìn)食，僅依靠身體儲備的脂肪來滿足能量需求。冬眠生理學(xué)離不開對動物體內(nèi)能量底物的研究，而檢驗?zāi)芰康孜锢玫囊环N重要方法是測量能量代謝過程中相關(guān)物質(zhì)的含量或活性，如甲狀腺激素、瘦素及其受體等[2]。國內(nèi)外的冬眠生理研究多集中于小型物種，如十三線地松鼠(Ictidomystridecemlineatus)、達(dá)烏爾黃鼠(Spermophilusdauricus)、小棕蝠(Myotislucifugus)[3-5]等，而針對大型獸類的冬眠生理研究相對較少，僅見棕熊(Ursusarctos)冬眠期間代謝調(diào)節(jié)的研究[6]、美洲黑熊(U.americanus)冬眠前和冬眠期的甲狀腺激素水平研究[7]等。

亞洲黑熊(U.thibetanus)，簡稱黑熊，是棲息在森林中的大型食肉目(Carnivora)動物，分布和活動范圍較廣。在冬季的北方地區(qū)，由于氣候寒冷和冰雪覆蓋，使食物來源較為匱乏，黑熊演化出冬眠機(jī)制以應(yīng)對惡劣的環(huán)境。熊科(Ursidae)動物是生物多樣性保護(hù)的旗艦物種，為探究黑熊在冬季的生理狀況以及冬眠期間保持能量平衡的生理因素，于2020年11月—2021年3月在黑龍江省哈爾濱市山河實驗林場開展黑熊冬眠試驗，通過對冬眠前后的糞便樣品進(jìn)行測定，分析與冬眠相關(guān)的生理生化指標(biāo)變化，試圖探究其冬眠前后能量利用、新陳代謝相關(guān)的生理因素及其生理機(jī)制，藉此為黑熊野外種群保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)，亦可能為醫(yī)學(xué)發(fā)展和疾病治療提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

在黑龍江省哈爾濱市山河實驗林場開展試驗，選取5只健康無病的黑熊成體，其中成年雄性2只、成年雌性3只，體重116～134 kg。冬眠試驗期間，開設(shè)單獨室內(nèi)籠舍，并與其他黑熊分開飼養(yǎng)。黑熊的喂養(yǎng)飼料由玉米面、奶粉、蜂蜜和豬肉(及肉湯)等食物組成，每天進(jìn)食2次，分別是08：00和15：00，并提供自由飲水條件。

1.2 試驗過程

1.2.1 育肥

2020年11月，配合野外黑熊育肥情況，給試驗黑熊增加喂食高脂質(zhì)食物(蜂蜜、豬肉及肉湯)，在體重顯著增長后再逐漸減少喂食直至停食。模擬野外冬眠環(huán)境，籠舍中不供應(yīng)暖氣，開窗通風(fēng)使得室內(nèi)溫度保持在-5～-15 ℃，同時鋪設(shè)稻草等基礎(chǔ)保暖材料于籠舍內(nèi)。

1.2.2 冬眠

2020年12月，黑熊進(jìn)入蟄伏的冬眠狀態(tài)，不活動、不進(jìn)食、不排泄，期間禁止任何人為活動干擾。

1.2.3 出眠

經(jīng)過90～100 d的冬眠，試驗黑熊在2021年3月逐漸恢復(fù)活動狀態(tài)，蘇醒出眠。

1.3 采樣與保存

黑熊等大型獸類性情兇猛，以往的相關(guān)生理研究多使用血液采樣，通常需要提前進(jìn)行麻醉。麻醉劑的使用可能對動物體的正常生理生化造成影響，劑量不當(dāng)還可能導(dǎo)致動物呼吸抑制、器官損傷等不良反應(yīng)，嚴(yán)重情況下可能致死[8-9]；麻醉取血需要專業(yè)的技術(shù)操作，同時也存在一些倫理問題，使用非損傷性(排泄物)采樣替代血液采樣，能夠很大程度降低對試驗動物的不利影響[10]。本研究于黑熊冬眠前后分別采集5 d的排泄物樣品，進(jìn)行測定和分析。測定指標(biāo)多為物理性質(zhì)較為穩(wěn)定的蛋白類物質(zhì)(表1)，揮發(fā)性弱或難以揮發(fā)，既避免了麻醉對黑熊的應(yīng)激影響，又保證了樣品能夠在相當(dāng)程度上反應(yīng)指標(biāo)的變化趨勢。籠舍架有監(jiān)控相機(jī)進(jìn)行全天候記錄，配備人員定時喂養(yǎng)和觀察。同時，配置溫濕度記錄儀，記錄室內(nèi)的溫濕度變化情況。

1.3.1 樣品收集

準(zhǔn)備5個帶有濾網(wǎng)的40 cm×40 cm收集器皿，分別置于5只黑熊籠舍下方，于每日傍晚收集當(dāng)天的新鮮糞樣，進(jìn)行簡單過濾后暫存采樣袋中。

1.3.2 樣品保存

向過濾后的糞樣加入磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)以維持生物活性，將處理后的樣品分為2份，每份10 g，裝入新的采樣袋并標(biāo)記，放入冰箱-20 ℃保存。

1.4 試驗方法

根據(jù)國內(nèi)外已有冬眠生理研究，篩選了36項與冬眠過程、能量代謝等相關(guān)的生理生化指標(biāo)，將5只黑熊的20份樣品(冬眠前后各選取10份)進(jìn)行試驗。根據(jù)不同物質(zhì)的特性，分別采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)和微量法進(jìn)行測定，由江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司和蘇州科銘生物技術(shù)有限公司提供技術(shù)服務(wù)，測定指標(biāo)及對應(yīng)測定方法詳見表1。

表1 黑熊冬眠前后生理生化指標(biāo)的測定方法及數(shù)據(jù)分析結(jié)果

1.4.1 酶聯(lián)免疫吸附測定法——以甲狀腺素測定為例

用純化的甲狀腺素捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入甲狀腺素，再與辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的檢測抗體結(jié)合，形成抗體—抗原—酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物四甲基聯(lián)苯胺(3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine，TMB)顯色。TMB在HRP的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色。顏色的深淺和樣品中的甲狀腺素濃度呈正相關(guān)。用Rayto酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中甲狀腺素濃度。

1.4.2 微量法——以葡萄糖測定為例

葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并產(chǎn)生過氧化氫；過氧化物酶催化過氧化氫氧化4-氨基安替比林偶聯(lián)酚，生成有色化合物，在505 nm有特征吸收峰，其顏色深淺與葡萄糖摩爾濃度成正比。

1.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)采樣時間，將試驗數(shù)據(jù)分為冬眠前和冬眠后，運用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。先用描述性統(tǒng)計進(jìn)行均值和標(biāo)準(zhǔn)差計算，后進(jìn)行正態(tài)性檢驗，再根據(jù)結(jié)果進(jìn)行顯著性檢驗。若2組數(shù)據(jù)都服從正態(tài)分布且方差齊性采用參數(shù)檢驗(t檢驗)，不服從正態(tài)分布或方差不齊性進(jìn)行非參數(shù)檢驗(秩和檢驗)[11-12]，通過顯著性檢驗分析冬眠前后的2組數(shù)據(jù)是否存在顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬眠前后的指標(biāo)差異

在36項指標(biāo)中，葡萄糖、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇和總膽固醇5項指標(biāo)水平在冬眠前高于冬眠后，其余31項指標(biāo)水平在冬眠前均低于冬眠后(表1)。

2.2 秩和檢驗

由于2組數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布或方差不齊性，故采用秩和檢驗。在秩和檢驗中，當(dāng)P<0.05時，說明2組數(shù)據(jù)存在顯著差異；當(dāng)P<0.01時，說明2組數(shù)據(jù)存在極顯著差異，當(dāng)P>0.05時，說明2組數(shù)據(jù)不存在顯著差異。從表1可知，甲狀腺激素等12項指標(biāo)在冬眠前后出現(xiàn)顯著變化，其中，甘油三酯等4項指標(biāo)在冬眠前后的差異極顯著，褪黑激素等24項指標(biāo)在冬眠前后則無顯著差異。

3 討論

3.1 脂質(zhì)利用

甘油三酯是一種重要的脂質(zhì)，水解后形成游離脂肪酸和甘油以供能量消耗。動物在冬眠時會對體內(nèi)新陳代謝進(jìn)行廣泛調(diào)整，通常包括抑制碳水化合物的分解，并在冬眠期間從利用碳水化合物轉(zhuǎn)變?yōu)橐揽恐|(zhì)氧化提供能量[13]。在對達(dá)烏爾黃鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，其冬眠前肥育期甘油三酯的水平比冬眠期和蘇醒期均高[4]。黑熊在育肥期間會攝入大量高脂肪食物，為冬眠囤積能量儲備，甘油三酯處于最高的水平。由于在冬眠期間消耗了身體的脂肪儲備，冬眠后黑熊的甘油三酯極顯著低于冬眠前的水平(P<0.01)。

過氧化物酶體增殖物激活受體-α(PPAR-α)是一類轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)的代謝，維持脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)。在PPAR-α的刺激下，甘油三酯在脂肪代謝中會變得更為高效，PPAR-α的增加與甘油三酯的降低存在相關(guān)[14]。本研究中，黑熊的PPAR-α水平在冬眠后極顯著高于冬眠前(P<0.01)，其與甘油三酯水平呈負(fù)相關(guān)。

3.2 糖類利用

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的激活可以減少葡萄糖的生成，黑熊在冬眠期間主要依靠消耗脂肪儲備來維持身體機(jī)能，需要提高AMPK水平以減少葡萄糖的生成與消耗。冬眠前尚未進(jìn)入蟄伏狀態(tài)，AMPK水平較低，而在冬眠蘇醒后體內(nèi)AMPK水平仍較冬眠前高(P<0.05)，則是冬眠機(jī)制的延續(xù)[15]。

堿性磷酸酶是一種膜結(jié)合糖蛋白，在堿性pH下催化單磷酸酯水解，參與了葡萄糖和脂肪酸在腸道內(nèi)的主動轉(zhuǎn)運，還幫助葡萄糖通過腎臟復(fù)雜小管的吸收。冬眠時堿性磷酸酶活性在大部分器官中均顯著增加，高于冬眠前的水平[16]。出于冬眠蘇醒后黑熊對恢復(fù)生長的需求，堿性磷酸酶質(zhì)量濃度在一段時間內(nèi)仍會保持較冬眠前高的水平(P<0.01)。

3.3 能量平衡

瘦素主要由脂肪組織產(chǎn)生和分泌，通過給下丘腦傳遞關(guān)于體脂和能量平衡的信息，充當(dāng)能量平衡的反饋控制器，其質(zhì)量濃度通常和身體肥胖相關(guān)[17]。當(dāng)瘦素增加時，身體基礎(chǔ)代謝率(basal metabolic rate，BMR)降低，產(chǎn)熱能力和棕色脂肪組織的質(zhì)量也會隨之增加[5]。冬眠前較高的甘油三酯水平聯(lián)動瘦素抵抗，導(dǎo)致瘦素水平較低[18]，而冬眠期及蘇醒期黑熊的瘦素水平較高(P<0.05)則是為了降低BMR，有利于節(jié)約能量消耗。

饑餓素主要產(chǎn)生于胃內(nèi)的分泌細(xì)胞，是下丘腦神經(jīng)元回路的神經(jīng)遞質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，在冬眠哺乳動物中，饑餓素可能對食物攝入和體重調(diào)節(jié)有重要作用。饑餓素的水平往往會隨著動物禁食而增加，金背黃鼠(Spermophiluslateralis)在經(jīng)過5 d的禁食后饑餓素水平明顯上升[19]，試驗黑熊在冬眠禁食后的饑餓素水平同樣也較冬眠前高(P<0.05)。黑熊在蘇醒出眠后，相對較高的饑餓素水平有促進(jìn)攝食的作用，幫助身體盡快恢復(fù)到正常狀態(tài)。

由于黑熊在冬眠期間幾乎不進(jìn)行排泄，抗利尿激素的分泌可以抑制排尿反應(yīng)，從而減少身體水分和其他物質(zhì)的流失。在冬眠剛結(jié)束的時期，黑熊體尚未完全恢復(fù)到正常狀態(tài)，進(jìn)食和排泄還未完全恢復(fù)正常，抗利尿激素水平依舊較高(P<0.05)。由于排尿少，黑熊冬眠后的尿酸水平自然也較冬眠前高(P<0.05)。

3.4 入眠與蘇醒

甲狀腺素由甲狀腺產(chǎn)生和儲存，具有協(xié)調(diào)動物體生長和代謝的重要作用。在冬眠前直至冬眠后期甲狀腺素會持續(xù)下降，通過抑制新陳代謝，為冬眠期間的低體溫做準(zhǔn)備；而在出眠蘇醒后，體溫和活動隨之恢復(fù)[10]，黑熊的甲狀腺素水平上升(P<0.05)。促甲狀腺素釋放激素(TRH)由下丘腦產(chǎn)生，可刺激促甲狀腺激素的合成，從而促進(jìn)甲狀腺素的分泌。在冬眠前期TRH缺乏、刺激甲狀腺功能減弱，而冬眠蘇醒后黑熊體內(nèi)的TRH水平升高(P<0.05)，其變化與甲狀腺素基本一致。

胰島素是一種由胰臟分泌的具有降低血糖作用的激素，臨床常用于治療糖尿病，還能促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)合成。在冬眠后期至冬眠蘇醒時期，十三線地松鼠的胰島素分泌會隨著體溫上升而逐漸增加，在體溫穩(wěn)定到正常水平后會下降[3]，黑熊亦有著相似的變化趨勢。冬眠后，黑熊體內(nèi)的胰島素水平升高(P<0.05)，這有利于黑熊短時間內(nèi)恢復(fù)正常的身體狀況。

脂聯(lián)素是參與能量代謝的重要脂肪因子，研究發(fā)現(xiàn)其與能量平衡、胰島素敏感性有關(guān)，可以刺激產(chǎn)熱，并通過刺激脂肪酸氧化誘導(dǎo)體重和脂肪量減少[20]。脂聯(lián)素會與3種受體結(jié)合，其中之一便是脂聯(lián)素受體2。脂聯(lián)素受體2會導(dǎo)致胰島素敏感性的增加，在體質(zhì)偏瘦的小鼠體內(nèi)檢測到更高的水平[21]。在冬眠期間，黑熊消耗了大量脂肪貯備，蘇醒后體重減輕，急需提高胰島素水平和體溫來恢復(fù)正?；顒?，故試驗中黑熊的脂聯(lián)素受體2水平冬眠后極顯著高于冬眠前(P<0.01)。

除本研究檢測的指標(biāo)外，還有一些對動物冬眠有重要影響的物質(zhì)，如下丘腦室管膜膠質(zhì)細(xì)胞(tanycytes)，可檢測來自外周的代謝產(chǎn)物和內(nèi)分泌信號，并調(diào)節(jié)這些成分從血液到大腦的運轉(zhuǎn)，屬于冬眠內(nèi)源性節(jié)律調(diào)節(jié)者[22]。但以往試驗需要在小型鼠類的(腦部)組織進(jìn)行，目前受條件所限，難以在大型獸類活體內(nèi)測量，故本研究未涉及。

3.5 結(jié)論

在黑熊冬眠試驗中，分析了2個時期生理生化的差異和變化。由于瘦素、饑餓素、胰島素等激素的協(xié)調(diào)、能量底物甘油三酯的增多，以及其他信號分子的刺激，黑熊得以在長期蟄伏和禁食下保持基礎(chǔ)生命活動，從而順利越冬。對黑熊冬眠的生理適應(yīng)研究，有助于進(jìn)一步揭示動物的冬眠機(jī)制，深入分析冬眠背后的生理、環(huán)境因素，結(jié)合棲息地生態(tài)研究，可以更好地為保護(hù)這些物種及其生存環(huán)境提供借鑒。

致謝：感謝黑龍江省哈爾濱市山河實驗林場的段洪偉場長及工作人員在試驗期間提供的支持和幫助。