林彩娟 耿國興 彭振仁 黃小桃 吳柳霖徐鈺琪 李威 錢家樂 羅靜思

（1.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院遺傳代謝中心實驗室，廣西南寧 530012；2.廣西出生缺陷預(yù)防控制研究所，廣西南寧 530012；3.廣西生殖健康與出生缺陷防治重點實驗室，廣西南寧 530012；4.廣西新生兒疾病篩查中心，廣西南寧 530012）

遺傳代謝?。╥nherited metabolic diseases，IMD）是指由于基因突變引起酶缺陷、細胞膜功能異常或受體缺陷，從而導(dǎo)致機體生化代謝紊亂，造成中間或旁路代謝產(chǎn)物蓄積，或終末代謝產(chǎn)物缺乏，引起一系列臨床癥狀的一組疾病［1］。早產(chǎn)是IMD發(fā)生的重要影響因素［2］。與足月兒相比，早產(chǎn)兒是新生兒中的特殊群體，其臟器生理功能的發(fā)育尚不完善，部分氨基酸代謝相關(guān)酶活性不足，致使部分氨基酸的代謝受阻［3］。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)是一項可同時完成多種氨基酸及肉堿代謝物檢測的高效技術(shù)［4］。目前已有相關(guān)研究報道出生體重、胎齡等因素均會對新生兒IMD篩查指標產(chǎn)生影響［5-6］，因此臨床上依據(jù)足月兒參考標準對早產(chǎn)兒篩查指標進行判讀會降低結(jié)果的準確率，但國內(nèi)尚無大數(shù)據(jù)的臨床研究來建立早產(chǎn)兒體內(nèi)氨基酸水平的參考范圍，且氨基酸的代謝水平在一定程度上反映了早產(chǎn)兒體內(nèi)的營養(yǎng)代謝狀態(tài)。為此，本研究基于串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，通過回顧性調(diào)查分析廣西地區(qū)早產(chǎn)兒的血氨基酸水平，比較早產(chǎn)兒與足月兒的血氨基酸譜差異，為實驗室建立早產(chǎn)兒血氨基酸水平參考標準和臨床判讀提供科學(xué)依據(jù)，同時從代謝的角度為早產(chǎn)兒營養(yǎng)提出指導(dǎo)意見。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性收集2018～2020年于廣西新生兒疾病篩查中心進行IMD篩查且篩查結(jié)果為陰性（未患IMD）的30 757例新生兒的臨床資料，其中早產(chǎn)兒2 146例、足月兒28 611例。根據(jù)胎齡分為極早產(chǎn)組（胎齡＜32周，n=209）、中期早產(chǎn)組（32周≤胎齡＜34周，n=307）、晚期早產(chǎn)組（34周≤胎齡＜37周，n=1 630）；根據(jù)出生體重分為極低出生體重組（出生體重＜1 500 g，n=161）、低出生體重組（1 500 g≤出生體重＜2 500 g，n=1 085）組、正常出生體重組（2 500 g≤出生體重≤4 000 g，n=900）；根據(jù)出生后采血時間分為采血時日齡3～7 d組（n=1 664）、8～14 d組（n=314）、15～28 d組（n=168）。將37周≤胎齡≤42周、2 500 g≤出生體重≤4 000 g、出生后3～7 d采血的足月健康新生兒納入正常對照組。本研究獲得廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院倫理委員會的批準（桂婦保院醫(yī)研倫快審［2020-1］59號），且所有新生兒監(jiān)護人均簽署知情同意。

1.2 標本采集與實驗室檢測

采集出生后3～7 d充分哺乳的正常新生兒及出生3 d后早產(chǎn)新生兒足跟血樣本，滴于S&S903專用采血濾紙片上，自然滲透、無污染、自然晾干后遞送至廣西新生兒疾病篩查中心，采用串聯(lián)質(zhì)譜法檢測氨基酸水平。

1.3 檢測指標

檢測指標包括11種氨基酸，分別為瓜氨酸（citrulline，Cit）、苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）、蛋 氨 酸（methionine，Met）、酪 氨 酸（tyrosine，Tyr）、丙氨酸（alanine，Ala）、纈氨酸（valine，Val）、亮氨酸（leucine，Leu）、精氨酸（arginine，Arg）、鳥氨酸（ornithine，Orn）、甘氨酸（glycine，Gly）、脯氨酸（proline，Pro）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用協(xié)方差分析，控制相關(guān)的影響因素，估算不同分組間各指標的調(diào)整測量值的分布范圍差異，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（P25，P75）］表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同胎齡早產(chǎn)兒基本資料

本研究將2 146例早產(chǎn)兒按胎齡分組，補充其采血前的生理病理信息，包括性別、胎齡、出生體重、采血日齡、新生兒黃疸、新生兒肺炎、靜脈營養(yǎng)使用情況及母親孕期的疾病信息。結(jié)果顯示胎齡、出生體重、采血日齡、新生兒肺炎、靜脈營養(yǎng)在早產(chǎn)兒各組間的分布比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 不同胎齡早產(chǎn)兒基本資料及母親孕期疾病情況分布比較

2.2 各影響因素與氨基酸指標的相關(guān)性分析

將早產(chǎn)兒各影響因素與氨基酸指標進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Met、Ala、Val、Leu、Gly、Pro與性別呈正相關(guān)；Cit、Ala與胎齡呈正相關(guān)，Phe、Met、Val、Arg與胎齡呈負相關(guān)；Tyr、Ala、Val、Leu、Pro與出生體重呈正相關(guān)；Cit、Met、Ala、Arg與采血日齡呈正相關(guān)，Phe、Val與采血日齡呈負相關(guān)；Cit、Ala、Val、Leu、Orn、Gly、Pro與采血前黃疸呈負相關(guān)；Tyr、Ala、Orn、Gly、Pro與采血前肺炎呈負相關(guān)；除Tyr與靜脈營養(yǎng)呈負相關(guān)外，Cit、Phe、Met、Val、Leu、Arg、Orn、Pro均與靜脈營養(yǎng)呈正相關(guān)；Phe、Ala、Val、Leu、Orn、Gly、Pro與母親妊娠糖尿病呈負相關(guān)（均P＜0.05）。見表2。

表2 11種氨基酸指標檢測結(jié)果與影響因素的相關(guān)關(guān)系矩陣

2.3 不同胎齡早產(chǎn)兒組氨基酸代謝水平特點

采用協(xié)方差分析控制與11種氨基酸代謝水平相關(guān)的影響因素，調(diào)整不同胎齡早產(chǎn)兒組間氨基酸指標的測量水平，并與正常對照組進行比較，結(jié)果顯示11種氨基酸在各組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中Phe、Arg在極早產(chǎn)、中期早產(chǎn)、晚期早產(chǎn)組中水平高于正常對照組（P＜0.05），Ala、Val、Orn、Gly、Pro在極早產(chǎn)、中期早產(chǎn)、晚期早產(chǎn)組中水平均低于正常對照組（P＜0.05）；且從極早產(chǎn)到足月發(fā)現(xiàn)Arg隨胎齡增加而遞減，Ala隨胎齡增加而遞增；Cit、Met在極早產(chǎn)、中期早產(chǎn)組中水平高于正常對照組（P＜0.05）。見表3。

表3 不同胎齡組早產(chǎn)兒和正常對照組足月兒全血氨基酸代謝水平比較 （±s，μmol/L）

表3 不同胎齡組早產(chǎn)兒和正常對照組足月兒全血氨基酸代謝水平比較 （±s，μmol/L）

注：［Cit］瓜氨酸；［Phe］苯丙氨酸；［Met］蛋氨酸；［Tyr］酪氨酸；［Ala］丙氨酸；［Val］纈氨酸；［Leu］亮氨酸；［Arg］精氨酸；［Orn］鳥氨酸；［Gly］甘氨酸；［Pro］脯氨酸。a示與正常對照組比較，P＜0.05。

P值氨基酸正常對照組(n=28 611)極早產(chǎn)組(n=209)中期早產(chǎn)組(n=307)晚期早產(chǎn)組(n=1 630)F值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 Cit Phe Met Tyr Ala Val Leu Arg Orn Gly Pro 13.079±0.024 60.915±0.083 22.445±0.037 103.081±0.238 311.756±0.526 147.454±0.214 175.574±0.253 7.857±0.046 149.073±0.373 531.544±0.997 198.701±0.289 14.160±0.280a 63.687±0.967a 27.765±0.428a 82.572±2.784a 207.497±6.160a 137.991±2.507a 178.395±2.956 20.851±0.538a 135.207±4.365a 423.046±11.664a 165.634±3.376a 14.348±0.231a 66.837±0.798a 26.828±0.353a 102.311±2.297 224.066±5.083a 142.652±2.068a 187.588±2.439a 16.944±0.444a 127.162±3.602a 417.756±9.624a 165.193±2.786a 13.114±0.100 63.512±0.346a 26.670±0.153 115.199±0.997a 260.126±2.206a 133.893±0.898a 170.563±1.059a 8.590±0.193a 122.617±1.563a 507.656±4.177a 177.179±1.209a 14.818 37.407 101.196 65.845 353.218 225.253 42.310 373.610 387.395 293.323 545.221

2.4 不同出生體重早產(chǎn)兒組氨基酸代謝水平特點

采用協(xié)方差分析控制與11種氨基酸代謝水平相關(guān)的影響因素，比較早產(chǎn)兒不同出生體重組間與正常對照組氨基酸水平的差異，結(jié)果顯示11種氨基酸在各組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中Ala、Val、Pro水平隨出生體重增加而增加，但仍較正常對照組低。比較極低出生體重組與正常對照組，除Phe、Leu外其他氨基酸水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；低出生體重組與正常對照組比較，除Leu外其他氨基酸水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；正常出生體重組與正常對照組比較，發(fā)現(xiàn)Cit、Arg、Gly水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表4 不同出生體重組早產(chǎn)兒和正常對照組足月兒全血氨基酸代謝水平比較 （±s，μmol/L）

表4 不同出生體重組早產(chǎn)兒和正常對照組足月兒全血氨基酸代謝水平比較 （±s，μmol/L）

注：［Cit］瓜氨酸；［Phe］苯丙氨酸；［Met］蛋氨酸；［Tyr］酪氨酸；［Ala］丙氨酸；［Val］纈氨酸；［Leu］亮氨酸；［Arg］精氨酸；［Orn］鳥氨酸；［Gly］甘氨酸；［Pro］脯氨酸。a示與正常對照組比較，P＜0.05。

P值氨基酸正常對照組(n=28 611)極低出生體重組(n=161)低出生體重組(n=1 085)正常出生體重組(n=900)F值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.035＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 Cit Phe Met Tyr Ala Val Leu Arg Orn Gly Pro 13.079±0.024 60.915±0.083 22.445±0.037 103.081±0.238 311.756±0.526 147.454±0.214 175.574±0.253 7.857±0.046 149.073±0.373 531.544±0.997 198.701±0.289 14.425±0.319a 62.658±1.102 27.982±0.488a 74.651±3.168a 203.915±7.019a 134.066±2.857a 177.605±3.370 20.096±0.616a 130.331±4.974a 425.968±13.291a 162.190±3.845a 13.602±0.123a 64.247±0.425a 24.571±0.188a 106.341±1.220a 241.306±2.704a 134.683±1.101a 175.115±1.298 12.024±0.237a 122.650±1.916a 461.694±5.120a 169.310±1.481a 12.955±0.135 63.954±0.466a 22.030±0.207a 121.157±1.340a 268.349±2.969a 134.850±1.208a 171.441±1.426a 8.089±0.260 125.673±2.104a 527.364±5.622 182.578±1.626a 11.977 33.093 84.546 88.331 352.165 72.496 2.875 226.986 101.791 79.703 181.610

2.5 出生后不同采血日齡組早產(chǎn)兒氨基酸代謝水平特點

采用協(xié)方差分析控制與11種氨基酸代謝水平相關(guān)的影響因素，比較早產(chǎn)兒出生后采血不同日齡組間氨基酸水平差異，結(jié)果顯示除Orn外其他氨基酸代謝水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中Cit、Met、Arg水平隨日齡增加逐漸升高（P＜0.05），而Phe、Tyr、Ala、Pro水平隨日齡增加而降低（P＜0.05）。不同日齡組間兩兩比較，發(fā)現(xiàn)8～14 d組與3～7 d組比較除Val、Orn外差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，15～28 d組與3～7 d組比較除Leu、Orn外均有統(tǒng)計學(xué)差異，8～14 d組與15～28 d組比較除Orn、Gly外 差 異 均 有 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義（P＜0.05）。見表5。

表5 不同采血日齡組早產(chǎn)兒全血氨基酸代謝水平 （±s，μmol/L）

表5 不同采血日齡組早產(chǎn)兒全血氨基酸代謝水平 （±s，μmol/L）

注：［Cit］瓜氨酸；［Phe］苯丙氨酸；［Met］蛋氨酸；［Tyr］酪氨酸；［Ala］丙氨酸；［Val］纈氨酸；［Leu］亮氨酸；［Arg］精氨酸；［Orn］鳥氨酸；［Gly］甘氨酸；［Pro］脯氨酸。a示與3～7 d組比較，P＜0.05；b示與8～14 d組比較，P＜0.05。

P值氨基酸3～7 d組(n=1 664)8～14 d組(n=314)15～28 d組(n=168)F值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.126＜0.001＜0.001 Cit Phe Met Tyr Ala Val Leu Arg Orn Gly Pro 13.030±0.088 65.114±0.377 23.155±0.184 115.249±1.188 253.924±1.860 136.068±0.925 170.619±1.231 9.816±0.275 123.584±1.288 513.023±3.712 176.817±1.084 14.152±0.202a 61.613±0.869a 25.256±0424a 99.564±2.734a 241.216±4.281a 138.290±2.128 189.782±2.833a 13.714±0.633a 125.204±2.966 398.039±8.546a 170.289±2.495a 15.562±0.276a,b 57.485±1.187a,b 27.370±0.579a,b 79.779±3.737a,b 225.529±5.852a,b 125.057±2.910a,b 174.939±3.873b 17.394±0.865a,b 132.180±4.055 389.837±11.684a 157.384±3.410a,b 46.374 23.188 31.788 49.734 13.070 7.550 19.293 45.791 2.075 113.320 16.290

3 討論

氨基酸是胎兒及新生兒主要的營養(yǎng)物質(zhì)，氨基酸紊亂容易導(dǎo)致胎兒死亡及宮內(nèi)生長受限等問題［7］。氨基酸缺乏會引起人體生長遲緩、生理機能減退和對疾病抵抗力降低；相反，如果體內(nèi)某些氨基酸的濃度太高，又會導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生，這類疾病統(tǒng)稱為氨基酸代謝?。?］。氨基酸在蛋白質(zhì)合成、免疫應(yīng)答、神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)及器官功能成熟等生命活動的各個方面具有重要作用，與早產(chǎn)兒的生長發(fā)育和疾病發(fā)生密切相關(guān)［9］。開展早產(chǎn)兒氨基酸代謝研究十分必要。本研究利用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對早產(chǎn)兒氨基酸代謝產(chǎn)物進行檢測，分析在不同胎齡、出生體重和采血日齡條件下其代謝特點。

早產(chǎn)兒胎齡對氨基酸指標影響較大。由于早產(chǎn)兒體內(nèi)相關(guān)代謝指標成熟度的差異，血液代謝物水平也有較大差異，檢測結(jié)果偏高或偏低。以胎齡分組控制了相關(guān)混雜因素后研究發(fā)現(xiàn)，11種氨基酸中早產(chǎn)兒各胎齡組與正常對照組比較均有差異，早產(chǎn)兒體內(nèi)存在多種氨基酸代謝異常，其中Phe、Arg在極早產(chǎn)、中期早產(chǎn)、晚期早產(chǎn)組中水平高于正常對照組，而Ala、Val、Orn、Gly、Pro水平則降低，與周婧瑤等［8］、劉丹陽等［10］相關(guān)研究報道基本一致，且從極早產(chǎn)到足月發(fā)現(xiàn)Arg隨胎齡增加而遞減，Ala隨胎齡增加而遞增。Arg水平偏高可能與早產(chǎn)兒體內(nèi)有應(yīng)激性調(diào)節(jié)有關(guān)［11］，而低胎齡可能引起Phe羥化酶活性輕度延遲，從而造成一過性的Phe升高［12］，Ala、Val、Orn、Gly、Pro水平低于正常對照組，可能是早產(chǎn)兒的胎盤氨基酸轉(zhuǎn)運功能受損或氨基酸合成能力不足及低效率的營養(yǎng)吸收導(dǎo)致［13-14］?？紤]到晚期早產(chǎn)與足月胎齡的接近性，我們還對比了晚期早產(chǎn)兒與足月兒氨基酸水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除Cit、Met外其余9種氨基酸水平均有差異，因此可推測出早產(chǎn)兒在過渡到足月兒相同的營養(yǎng)階段時，Cit和Met已接近足月兒水平。此外，在極早產(chǎn)、中期早產(chǎn)和晚期早產(chǎn)組中Met、Arg、Orn水平隨著胎齡增加而降低，而Tyr、Ala水平隨著胎齡增加而升高，Phe、Val、Leu隨胎齡增加呈先升高后降低的趨勢，Gly、Pro隨胎齡增加先降低后升高的趨勢。由此證明早產(chǎn)兒體內(nèi)氨基酸水平在不同胎齡期存在著發(fā)育不平衡狀態(tài)。

不同出生體重早產(chǎn)兒氨基酸代謝水平不同。本研究控制了相關(guān)影響因素后早產(chǎn)兒不同出生體重組與正常對照組比較，11種氨基酸均有差異，其中Ala、Val、Pro水平隨出生體重增加而增加，但仍較正常對照組低，部分指標與陳玉霞等［15］文獻報道的相比于足月兒，非足月兒的Val、Pro水平明顯降低一致。正常出生體重組與正常對照組比較，發(fā)現(xiàn)Cit、Arg、Gly水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，氨基酸基本達到足月兒水平，由此推測不同胎齡早產(chǎn)兒出生體重越大越接近正常時Cit、Arg、Gly水平。此外，在不同出生體重早產(chǎn)兒分組中，發(fā)現(xiàn)Cit、Met、Arg水平隨著出生體重增加而降低，而Tyr、Val、Ala、Gly、Pro水平隨著出生體重增加而升高。

不同采血日齡組早產(chǎn)兒氨基酸代謝水平不同。本研究比較早產(chǎn)兒出生后不同采血日齡組間差異，除Orn外其余氨基酸水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，其中Cit、Met、Arg水平隨日齡增加逐漸升高，而Phe、Tyr、Ala、Pro水平隨日齡增加而降低，說明隨著日齡增加早產(chǎn)兒食量逐漸增加，Cit、Met、Arg等部分氨基酸的攝入和吸收增加，Ala對肝臟有很強的修復(fù)功能使得肝臟發(fā)育逐漸成熟，肝臟中酶代謝活性增強導(dǎo)致Phe降低，Tyr、Pro促進了早產(chǎn)兒的消化、吸收和代謝功能逐漸成熟。該結(jié)論除Met、Pro不同外，其余與董麗萍等［11］研究基本相符，考慮與早產(chǎn)兒營養(yǎng)期間可能充分攝入或吸收了Met，而Pro攝入或吸收不足有關(guān)。不同日齡組兩兩比較發(fā)現(xiàn)，8～14 d組與3～7 d組比較除Val、Orn外均有差異，15～28 d組與3～7 d組比較除Leu、Orn外均有差異，8～14 d組與15～28 d組比較除Orn、Gly外均有差異，可見營養(yǎng)階段的過渡與日齡增長密不可分，在早產(chǎn)兒機體發(fā)育不平衡且營養(yǎng)不足情況下，根據(jù)具體情況推遲超過7 d采血，同時以日齡結(jié)合營養(yǎng)階段分析氨基酸譜的變化更有利于臨床實踐中的營養(yǎng)干預(yù)。

串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)通過檢測早產(chǎn)兒干血斑中的氨基酸含量變化而判斷是否可能患有某種或多種IMD。早產(chǎn)兒（胎齡＜37周）、低體重兒（出生體重＜2 500 g），由于其自身、出生前后環(huán)境及護理治療的復(fù)雜性，對IMD篩查結(jié)果可產(chǎn)生影響，導(dǎo)致漏篩及篩查結(jié)果假陽性率或假陰性率升高［16］。氨基酸在早產(chǎn)兒體內(nèi)的代謝異常復(fù)雜，本研究發(fā)現(xiàn)不同胎齡、出生體重及采血日齡均會影響早產(chǎn)兒氨基酸代謝，不同條件下氨基酸在早產(chǎn)兒體內(nèi)的分布不同，綜合以上因素提示早產(chǎn)兒Arg水平隨著胎齡、出生體重增加而降低，隨日齡增加而升高，而Tyr、Ala水平隨著胎齡、出生體重增加而升高，隨日齡增加而降低，因此了解早產(chǎn)兒氨基酸代謝變化特點為實驗室選取適合的陽性截斷值并結(jié)合胎齡、出生體重及采血日齡進行判讀和為臨床正確診斷提供科學(xué)基礎(chǔ)，也為改善早產(chǎn)兒營養(yǎng)代謝狀況提供了科學(xué)依據(jù)。本研究中發(fā)現(xiàn)相對于足月兒，低胎齡低體重早產(chǎn)兒Ala、Val、Gly、Pro水平較低，提示臨床優(yōu)化方案進行營養(yǎng)支持，此外當早產(chǎn)兒血中個別氨基酸水平明顯改變時需引起臨床醫(yī)師注意，在靜脈營養(yǎng)管理中更應(yīng)注意各種氨基酸攝入的平衡。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。