劉婧婷 周亞威 王文第 毛寶宏 虎亞光

（甘肅省婦幼保健院 1.婦幼保健科研中心；2.臨床檢驗(yàn)中心；3.藥學(xué)部 甘肅蘭州 730050）

先天性心臟病（congenital heart disease），簡(jiǎn)稱先心病，是一種心血管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)異常，其特征表現(xiàn)為心臟及大血管解剖異常，是新生兒最常見的出生缺陷。在每1 000個(gè)活產(chǎn)新生兒中，就有6～12人罹患先心?。?］。在嬰幼兒中，先心病占出生缺陷病死率的30%～50%［2］。作為造成兒童發(fā)病和死亡的主要原因，先心病越來越引起廣泛關(guān)注。流行病學(xué)文獻(xiàn)研究表明，許多非遺傳性風(fēng)險(xiǎn)因素，例如孕婦吸煙史［3］、肥胖［4］、妊娠前糖尿病、孕產(chǎn)婦藥物暴露及環(huán)境暴露史［2］等可能增加子代先心病的風(fēng)險(xiǎn)。

在中國(guó)，重金屬污染和微量元素缺乏是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題。隨著信息技術(shù)的發(fā)展和工業(yè)化進(jìn)程的加快，人群中鉛（plumbum，Pb）的暴露也隨之增加。研究表明，孕期鉛暴露水平與子代發(fā)生先心病的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)［5-6］。鋅（zinc，Zn）對(duì)兒童成長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)鍵影響。Zhu等［7］的研究證實(shí)，在孤立性室間隔缺損（ventricular septum defects，VSD）患兒中存在鋅元素的缺乏，且患兒Zn水平與主動(dòng)脈直徑之間存在顯著關(guān)聯(lián)。然而，關(guān)于孕期重金屬暴露及微量元素缺乏與子代先心病相關(guān)性的觀察性研究多為回顧性研究［5-7］，結(jié)果可能存在一定偏倚。本研究為前瞻性出生隊(duì)列研究，通過評(píng)估甘肅地區(qū)母親孕期重金屬元素暴露及微量元素水平與新生兒罹患先心病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系，建立孕期重金屬元素暴露和微量元素缺乏與子代先心病發(fā)生概率的預(yù)測(cè)模型，進(jìn)而為孕產(chǎn)婦妊娠期環(huán)境暴露、生活習(xí)慣等提供一些建議，以期提高出生人口質(zhì)量。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

2010～2012年我院聯(lián)合耶魯大學(xué)開展了一項(xiàng)出生隊(duì)列研究。對(duì)我院定期產(chǎn)檢直至分娩的孕婦進(jìn)行隨訪，使用標(biāo)準(zhǔn)化和結(jié)構(gòu)化的問卷收集孕婦一般人口統(tǒng)計(jì)學(xué)信息、既往病史、生育史及飲食習(xí)慣、孕早/中/晚期是否有主動(dòng)或被動(dòng)吸煙、孕早/中/晚期是否飲酒、孕早/中/晚期葉酸及維生素補(bǔ)充情況等。該項(xiàng)隊(duì)列研究共納入研究對(duì)象14 359名，共有10 542名孕婦（73.42%）完成了問卷調(diào)查。研究人群的相關(guān)詳細(xì)描述見Qiu等［8］的研究。本研究從其中10 087例單胎活產(chǎn)的孕產(chǎn)婦（已排除多胎、死胎或其他出生缺陷等）中收集到子代罹患先心病者97名作為先心病組，對(duì)照組按照1∶2的比例進(jìn)行配比。為保證研究人群的環(huán)境暴露因素相似，盡可能選擇與先心病組同年齡組、同小區(qū)（如不符合同小區(qū)，則在研究對(duì)象家庭住址5 km內(nèi)選擇）的194名孕婦作為對(duì)照組（子代未患先心?。Ｋ挟a(chǎn)前診斷為先心病的活產(chǎn)嬰兒在分娩后均接受超聲心動(dòng)圖檢查以確定診斷，至少有2名資深兒科心臟病專家在分娩后通過相關(guān)臨床檢查確診為先心病。本研究已征得孕婦本人知情同意，并獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)［（2021）GSFY倫審（09）號(hào)］。

1.2 血液樣本的采集、貯存與檢測(cè)

采集孕婦孕20～24周靜脈血，胎兒臍帶血在分娩后立即采集，均置于EDTA抗凝管中。所有樣本經(jīng)程序性冷凍后置于-80°C下冷凍，并在我院中心實(shí)驗(yàn)室保存，然后運(yùn)送至中科院蘭州化學(xué)物理研究所進(jìn)行化學(xué)元素分析。使用電感耦合等離子體質(zhì) 譜 法 （inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）檢測(cè)孕婦血液樣本及胎兒臍血樣本中鈷（cobalt，Co）、鎳（nickel，Ni）、鋁（aluminium，Al）、Zn、錳（manganese，Mn）、鈉（natrium，Na）、鎂（magnesium，Mg）、鉀（kalium，K）、鈣（calcium，Ca）、鈦（titanium，Ti）、釩（vanadium，V）、鉻（chromium，Cr）、鐵（ferrum，F(xiàn)e）、銅（copper，Cu）、鎵（gallium，Ga）、砷（arsenic，As）、硒（selenium，Se）、鍶（strontium，Sr）、鉬（molybdenum，Mo）、銀（argentum，Ag）、鎘（cadmium，Cd）、錫（stannum，Sn）、銻（stibium，Sb）、鋇（barium，Ba）、汞（mercury，Hg）、鉈（thallium，Tl）、Pb、釷（thorium，Th）28種化學(xué)元素的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對(duì)孕婦的年齡分布、受教育程度、家庭人均月收入情況、孕期是否有吸煙及飲酒史等分類變量，使用百分比（%）描述，組間比較使用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法檢驗(yàn)。各樣本中化學(xué)元素的水平等連續(xù)變量，因不符合正態(tài)分布，故使用中位數(shù)和四分位數(shù)間距［P50（P25，P75）］表示，組間比較采用Wilcoxon-Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。為了探究重金屬元素和微量元素水平與子代先心病的相關(guān)性，采用多因素logistic回歸模型分析預(yù)測(cè)子代罹患先心病的相關(guān)因素并構(gòu)建預(yù)測(cè)模型，繪制相應(yīng)的列線圖。使用R軟件，先將所有數(shù)據(jù)按75%∶25%的比例劃分為測(cè)試集和訓(xùn)練集，調(diào)用“glm（）”函數(shù)建模分析。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷念A(yù)測(cè)效果，使用R軟件“caret”包下的“confusionMatrix（）”函數(shù)輸出模型校正后的OR（aOR）值、95%CI及P值。對(duì)于所有納入分析的變量，使用“glm（）”函數(shù)建立分析模型，調(diào)用“rms”包中的“nomogram（）”函數(shù)繪制列線圖［9］。對(duì)于列線圖的內(nèi)部驗(yàn)證采用Bootstrap自抽樣法，迭代1 000次進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證［9］。使用IBM SPSSStatistics 22.0軟件（IBM公司，芝加哥，美國(guó)）和R 4.0.2軟件及其擴(kuò)展包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的人口學(xué)資料

先心病組和對(duì)照組孕婦的年齡分布、受教育程度、孕產(chǎn)史、家庭人均月收入情況、孕前體重指數(shù)、孕期是否工作、孕期是否有吸煙史、孕期是否有飲酒史及胎兒性別等方面的比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；先心病組妊娠高血壓比例及妊娠糖尿病比例均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組孕婦一般資料的比較 ［例（%）］

表1（續(xù)）

2.2 孕婦血液樣本和胎兒臍血樣本中重金屬元素和微量元素水平

與對(duì)照組相比，先心病組孕婦血液樣本中Al、Na、Ca、Ti、Se、Sr、Sn、Sb、Ba、Th水平較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。先心病組胎兒臍血樣本中Al、Zn、Mg、K、Ca、Ti、Cr、Cu、As、Se、Sr、Ag、Cd、Sn、Pb水平較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表2 先心病組與對(duì)照組孕婦血液化學(xué)元素水平的比較 ［P50（P25，P75），μg/L］

表3 先心病組與對(duì)照組胎兒臍血化學(xué)元素水平的比較 ［P50（P25，P75），μg/L］

2.3 孕婦血液樣本和胎兒臍血樣本中重金屬元素和微量元素水平與子代先心病的相關(guān)性

首先，對(duì)上述經(jīng)秩和檢驗(yàn)分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)的化學(xué)元素，取對(duì)數(shù)后使用R軟件中的“glm（）”函數(shù)進(jìn)行l(wèi)ogistic分析，結(jié)果顯示孕婦全血中的Al和Th的水平可能與子代先心病的發(fā)病相關(guān)（P＜0.05）；胎兒臍血中的Al與Cd水平可能與先心病的發(fā)病相關(guān)（P＜0.05）。見表4～5。

表4 孕婦全血中化學(xué)元素水平與先心病的相關(guān)性

表5 胎兒臍血中化學(xué)元素水平與先心病的相關(guān)性

由于體內(nèi)微量元素和金屬元素的水平受性別、年齡、地區(qū)等多種因素的影響，且各元素間也存在相互影響［10-12］，國(guó)內(nèi)沒有統(tǒng)一的針對(duì)母血和臍血化學(xué)元素的參考范圍，本研究使用本研究中對(duì)照組孕婦血液樣本及胎兒臍血樣本的化學(xué)元素濃度，按其濃度分布的四分位數(shù)進(jìn)行劃分，以P25～P75間距為參考標(biāo)準(zhǔn)，低于P25為低濃度水平，高于P75為高濃度水平，進(jìn)行下一步分析。

多因素logistic回歸分析顯示，在調(diào)整表1基線資料比較中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的混雜因素后，針對(duì)孕婦血液樣本中化學(xué)元素的水平，與中等濃度Sb水平相比，高濃度Sb水平的孕婦其子代患先心病的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加（aOR=4.81，95%CI：1.65～14.07，P=0.004），見表6。而在胎兒臍血樣本中，高濃度水平的Al（aOR=4.22，95%CI：1.35～13.16，P=0.013）、Mg（aOR=8.00，95%CI：1.52～42.08，P=0.014）、Pb（aOR=3.82，95%CI：0.96～15.23；P=0.049）與先心病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加存在關(guān)聯(lián)，見表7。

表6 孕婦全血中化學(xué)元素水平與先心病之間關(guān)系的多因素logistic回歸分析

表7 胎兒臍血中化學(xué)元素水平與先心病之間關(guān)系的多因素logistic回歸分析

表7（續(xù)）

2.4 孕期重金屬元素暴露和微量元素水平與子代先心病的預(yù)測(cè)模型

根據(jù)以上分析，孕期重金屬元素和微量元素水平與子代先心病的預(yù)測(cè)模型中納入的變量有：孕婦血Al、Th、Sb水平和胎兒臍血Al、Mg、Pb水平，繪制的列線圖見圖1。列線圖模型中將各元素的濃度以對(duì)照組孕婦血液樣本及胎兒臍血樣本濃度P25～P75間距為參考標(biāo)準(zhǔn)，低于P25為低濃度水平，高于P75為高濃度水平。使用方法：每個(gè)預(yù)測(cè)指標(biāo)的數(shù)值所在區(qū)間對(duì)應(yīng)本指標(biāo)線段的某個(gè)刻度，由該刻度向評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的線段作垂直線即可得到相應(yīng)的分值，總分即所有指標(biāo)分值相加。再以總分線段上的對(duì)應(yīng)分值點(diǎn)向先心病發(fā)生概率線段作垂直線，即可得到孕期重金屬元素和微量元素不同濃度條件下子代先心病的發(fā)生概率。例如，孕婦其外周血Al濃度為1 700μg/L，對(duì)應(yīng)Al（孕婦血）線段“1 564.84～2 891.03”的刻度，因此該指標(biāo)得分約為10分；Th濃度0.6μg/L，對(duì)應(yīng)Th（孕婦血）線段“0.5～0.87”的刻度，該指標(biāo)得分約為30分；Sb濃度6μg/L，對(duì)應(yīng)Sb（孕婦血）線段“＜8.8”的刻度，得分約為20分；胎兒臍血中Al濃度為1 500μg/L，對(duì)應(yīng)Al（臍血）線段“1 282.37～2 418.72”的刻度，因此該指標(biāo)得分約為10分；Mg濃度為3 600μg/L，對(duì)應(yīng)Mg（臍血）線段“＞35 138.35”的刻度，該指標(biāo)得分約為75分；Pb濃度為40μg/L，對(duì)應(yīng)Pb（臍血）線段“25.45～65.06”的刻度，得分約為50分。依次累計(jì)各指標(biāo)的得分為195分，故對(duì)應(yīng)的發(fā)生概率為35%～40%。該列線圖預(yù)測(cè)子代先心病模型的校正曲線趨近于理想曲線，見圖2。

圖1 預(yù)測(cè)子代先心病列線圖模型 每個(gè)預(yù)測(cè)指標(biāo)的數(shù)值所在區(qū)間對(duì)應(yīng)某個(gè)刻度，該刻度向評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的線段作垂直線即可得到相應(yīng)的分值，總分即所有指標(biāo)分值相加。以總分線段上的對(duì)應(yīng)分值點(diǎn)向先心病發(fā)生概率線段作垂直線，即可得到孕期重金屬元素和微量元素不同濃度條件下子代先心病的發(fā)生概率。［Al］鋁；［Th］釷；［Sb］銻；［Mg］鎂；［Pb］鉛。

圖2 列線圖預(yù)測(cè)子代先心病模型的校正曲線

3 討論

本研究顯示，先心病組孕婦血液中Al、Na、Ca、Ti、Se、Sr、Sn、Sb、Ba、Th的含量均高于對(duì)照組。多因素logistic回歸分析顯示，血液樣本中Sb處于高水平的孕婦，其子代患先心病的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加（aOR=4.81，P=0.004）；而在胎兒臍血樣本中，高濃度水平的Al（aOR=4.22，P=0.013）、Mg（aOR=8.00，P=0.014）、Pb（aOR=3.82，P=0.049）與先心病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加存在關(guān)聯(lián)。研究表明，先心病組的孕婦，其頭發(fā)Pb含量（中位數(shù)0.670μg/mg）明顯高于對(duì)照組（0.461μg/mg），logistic回歸分析顯示孕婦Pb暴露水平與子代發(fā)生先心病的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)（aOR=3.07）［6］，本研究結(jié)果與之類似。Jackson等［13］的研究表明，孕婦Pb暴露的水平與其子代發(fā)生完全肺靜脈異?；亓鞯目赡苄杂嘘P(guān)。Liu等［14］的研究顯示，先心病組患兒臍血Al水平明顯高于對(duì)照組（P=0.004），尤其是圓錐動(dòng)脈干畸形、左/右心室流出道畸形及其他心臟結(jié)構(gòu)異常的先心病患兒臍血Al水平與對(duì)照組有顯著差異。并且，與Al低水平組相比，Al高水平組子代先心病患病風(fēng)險(xiǎn)較高（aOR=2.08，95%CI：1.11～3.88），本研究結(jié)果與之一致。此外，Liu等［14］還觀察到，隨著臍血Al濃度升高，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性顯著降低（R2=0.019，P=0.012），丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）水平顯著升高（R2=0.018，P=0.016），說明孕母Al暴露對(duì)子代先心病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)可能與氧化應(yīng)激失衡有關(guān)。林元等［15］的研究顯示，先心病組孕婦頭發(fā)中Sb的含量高于對(duì)照組（P＜0.0001），并且孕婦頭發(fā)Sb升高其子代發(fā)生先心病的風(fēng)險(xiǎn)增加（OR=33.833；95%CI：4.060～281.929）。陳小紅［16］的研究也得到類似的結(jié)果，先心病組孕婦頭發(fā)Sb元素含量較對(duì)照組顯著升高（P＜0.0001），Sb水平升高與子代罹患先心病風(fēng)險(xiǎn)較高相關(guān)（OR=3.000，95%CI：1.348～6.678，P=0.007）。楊文慶等［17］的研究顯示，早產(chǎn)兒動(dòng)脈導(dǎo)管未閉組血清Mg水平顯著高于對(duì)照組，母親產(chǎn)前使用硫酸鎂可能增加早產(chǎn)兒發(fā)生動(dòng)脈導(dǎo)管未閉的風(fēng)險(xiǎn)，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系。然而，Yal?in等［18］的研究結(jié)果顯示，先心病組患兒全血Mg水平比對(duì)照組低［（41.4±5.3）mg/L vs（37.8±3.2）mg/L，P=0.001］，在調(diào)整了兒童年齡、性別、身高/年齡比和體重指數(shù)/年齡比等混雜因素后，先心病組患兒全血Mg水平比對(duì)照組低［（41.3±0.7）mg/Lvs（39.5±2.1）mg/L，P=0.027］。因此，孕婦Mg水平與子代先心病的患病風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)關(guān)系有待進(jìn)一步研究。此外，本研究還顯示，孕婦血液中Th的水平與其子代先心病患病風(fēng)險(xiǎn)存在一定相關(guān)性，然而，國(guó)內(nèi)外鮮有文獻(xiàn)報(bào)道這二者之間的關(guān)系。關(guān)于孕婦Th水平與子代先心病的風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)有待流行病學(xué)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，孕婦血液標(biāo)本與胎兒臍血標(biāo)本中化學(xué)元素水平可用于預(yù)測(cè)子代罹患先心病的風(fēng)險(xiǎn)。孕婦血液樣本中Sb水平升高，其子代患先心病的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。而在臍血樣本中，高濃度水平的Al、Mg、Pb與先心病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加存在關(guān)聯(lián)。結(jié)合logistic回歸模型，納入孕婦血Al、Th、Sb水平和臍血Al、Mg、Pb水平等指標(biāo)構(gòu)建的列線圖模型對(duì)于預(yù)測(cè)子代先心病的發(fā)生概率有良好的準(zhǔn)確性及一致性，有助于制定相應(yīng)干預(yù)措施，提早對(duì)于高危因素暴露下的孕產(chǎn)婦加強(qiáng)產(chǎn)前監(jiān)測(cè)，以期對(duì)子代先心病進(jìn)行早期識(shí)別并給予干預(yù)治療。然而，本研究仍存在一些不足。首先，胚胎心臟的發(fā)育在孕3～8周就基本完成，本研究未能獲得孕早期生物樣本，因此很難反映孕早期的真實(shí)暴露水平。其次，本研究的生物樣本及臨床信息收集于10年前，代表當(dāng)時(shí)的環(huán)境暴露水平，可能與當(dāng)前的環(huán)境暴露情況存在一定偏差，且本研究為單中心研究，未能納入其他中心同標(biāo)準(zhǔn)人群進(jìn)行模型的外部驗(yàn)證，導(dǎo)致結(jié)論可能存在一定偏倚。因此，該列線圖模型的實(shí)用價(jià)值仍有待于前瞻性、大樣本量、多中心的研究進(jìn)一步驗(yàn)證。