黃嘉豪，劉桂文，朱 杰，陳 勇

（1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院 國家生化工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京211800；2.南京高新工大生物技術(shù)研究院有限公司，江蘇 南京210032）

厭氧氨氧化是指厭氧氨氧化菌在無機(jī)厭氧條件下，以亞硝基氮（－N）作為電子受體，以氨氮（－N）作為電子供體，生成N2和少量硝基氮（－N）的 過 程［1］。與 傳 統(tǒng) 的 生 物 脫 氮 工 藝（硝化 反硝化工藝）相比，厭氧氨氧化工藝更適合處理現(xiàn)階段普遍存在的高氨氮和低碳氮比廢水，具有運(yùn)行成本低、脫氮效率高、不造成二次污染等優(yōu)點(diǎn)［2］，因此，該工藝日益受到廣大研究者的青睞并加以開發(fā)應(yīng)用［3－4］。然而，厭氧氨氧化菌自身倍增時(shí)間較長（約11～14 d），其生長及代謝狀況極易受到外界環(huán)境的影響，從而使得厭氧氨氧化工藝無法在實(shí)際應(yīng)用中得到進(jìn)一步推廣。

微生物固定化技術(shù)能夠在保持微生物生物活性的同時(shí)提高微生物對外界環(huán)境不利因素的抗逆性能［5］，該技術(shù)在厭氧氨氧化工藝中已經(jīng)得到一定程度的應(yīng)用［6－10］。不同生物填料載體的材質(zhì)及親／疏水性往往具有差異，這使得其表面形成生物膜的性能可能不同，對反應(yīng)器性能的影響也具有差異［11－12］。針對微生物的生理特征，對普通的生物填料載體進(jìn)行改性有利于進(jìn)一步提高反應(yīng)器的性能。至目前為止，研究者主要集中考察普通生物填料載體對厭氧氨氧化反應(yīng)器脫氮性能的影響，而有關(guān)改性生物填料載體對厭氧氨氧化反應(yīng)器脫氮性能的影響報(bào)道較少，考察改性生物填料載體對厭氧氨氧化反應(yīng)器脫氮性能的影響在一定程度上能使微生物固定化技術(shù)在厭氧氨氧化工藝中得到進(jìn)一步推廣。

本研究以3個(gè)上流式厭氧污泥床（up-flow anaerobic sludge bed，UASB）反應(yīng)器作為研究對象，其中2個(gè)UASB反應(yīng)器內(nèi)分別填充改性活性炭聚氨酯及改性聚乙烯塑料填料2種不同的生物填料載體，剩余的反應(yīng)器則不添加任何生物填料載體；通過提高進(jìn)水（influent，Inf）基質(zhì)濃度或縮短水力停留時(shí)間（hydraulic retention time，HRT）的方式來提高反應(yīng)器的容積負(fù)荷（nitrogenloading rate，NLR）。通過比較3個(gè)反應(yīng)器脫氮性能的變化，對比分析改性生物填料載體對厭氧氨氧化反應(yīng)器脫氮性能的影響。同時(shí)，從微觀方面闡述影響差異的原因，以期為改性生物填料載體在厭氧氨氧化工藝中的應(yīng)用推廣提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 試驗(yàn)裝置

試驗(yàn)采用3個(gè)結(jié)構(gòu)和尺寸完全相同的UASB反應(yīng)器作為厭氧氨氧化反應(yīng)器，反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)如圖1所示，并命名為R1、R2及R0。其中R1為填充了活性炭聚氨酯的反應(yīng)器；R2為填充了改性聚乙烯塑料填料的反應(yīng)器；R0作為對照組，不投加任何改性生物填料載體。3個(gè)UASB反應(yīng)器由有機(jī)玻璃制成，有效容積為1.8 L。反應(yīng)器外帶有水浴夾套，由恒溫槽控制反應(yīng)器內(nèi)溫度。同時(shí)，為了防止光源對厭氧氨氧化菌的活性產(chǎn)生影響，采用黑色海綿對反應(yīng)器進(jìn)行遮光處理。實(shí)驗(yàn)室模擬廢水由BT-100蠕動(dòng)泵從底部進(jìn)入反應(yīng)器，從沉淀區(qū)上部流出，整個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)連續(xù)運(yùn)行。

圖1 反應(yīng)器結(jié)構(gòu)示意Fig.1 System of up-flow anaerobic sludge bed reactor

1.2 生物填料

選取筆者所在實(shí)驗(yàn)室改性的2種生物填料載體作為厭氧氨氧化菌的掛膜載體，分別為活性炭聚氨酯和改性聚乙烯塑料填料。這2種生物填料均具有比表面積大、強(qiáng)度高、不堵塞、易掛膜并且價(jià)廉易得的優(yōu)點(diǎn)。2種改性生物填料載體的性質(zhì)如表1所示。向R1中投入活性炭聚氨酯，向R2中投入改性聚乙烯塑料填料，填充率均為70%。

表1 2種生物填料載體的性質(zhì)Table 1 Properties of two biofilm carrier

1.3 運(yùn)行條件

在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，向3個(gè)厭氧氨氧化反應(yīng)器接入等量的厭氧氨氧化污泥，接種量為10%。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，調(diào)節(jié)進(jìn)水的濃度和質(zhì)量濃度約為100 mg／L，然后通過分階段逐步提高進(jìn)水的和濃度或縮短水力停留時(shí)間的方式來提高3個(gè)反應(yīng)器的容積負(fù)荷，并分析2種改性生物填料載體對厭氧氨氧化反應(yīng)器脫氮性能的影響。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，取出R1、R2及R0反應(yīng)器的底泥及R1、R2內(nèi)的改性生物填料載體，對其進(jìn)行脫氫酶活性檢測，并對微生物菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行高通量測序。同時(shí)，使用掃描電子顯微鏡（SEM）對2種改性生物填料表面生物膜進(jìn)行觀察，從微觀的角度解釋影響差異的原因。在整個(gè)試驗(yàn)的過程中，控制反應(yīng)器的運(yùn)行溫度為35℃，進(jìn)水pH約為8.0，其他反應(yīng)器運(yùn)行條件如表2所示。

表2 實(shí)驗(yàn)運(yùn)行條件Table 2 Strategy of experimental operation___________________________________

1.4 實(shí)驗(yàn)廢水

實(shí)驗(yàn)采用人工配制的模擬廢水，其主要成分如表3所示。

表3 模擬廢水組成成分Table 3 Components of synthetic wastewater

1.5 分析項(xiàng)目及其方法

1.5.1 進(jìn)出水水質(zhì)分析

進(jìn)出水水質(zhì)測定所用的分析方法均參照文獻(xiàn)［13］所記載的方法，分別測定、和總氮等水質(zhì)參數(shù)，并根據(jù)各氮素基質(zhì)在反應(yīng)器進(jìn)水和反應(yīng)器出水（effluent，Eff）的質(zhì)量濃度差來計(jì)算各氮素基質(zhì)的去除率及反應(yīng)器的容積去除率（nitrogen removal efficiency，NRE）等實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，具體計(jì)算見式（1）～（5）。

1.5.2 SEM分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，從R1、R2這2個(gè)反應(yīng)器內(nèi)取出若干個(gè)生物填料載體，首先使用適量2.5%、pH7.2的戊二醛溶液浸泡，并于4℃冰箱內(nèi)固定過夜；然后使用0.1 mol／L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液清洗3次以去除生物填料表面殘余的戊二醛；其次使用不同濃度的乙醇溶液對生物填料載體進(jìn)行脫水處理，并用乙酸異戊酯進(jìn)行置換；再次將置換后的生物填料載體置于真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥；最后在生物填料載體表面鍍上1 500 nm厚度的金屬膜，使用SEM進(jìn)行觀察。

1.5.3 脫氫酶活性檢測

在細(xì)胞呼吸過程中，作為氫受體的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）在脫氫酶作用下接受氫以后，便被還原為顯色為紅色的三苯基甲（TF）［14］，其在485 nm波長下具有吸光值，根據(jù)吸光值可以計(jì)算出TF的生成量，從而算出脫氫酶（TTC-DHA）的活性。測定步驟如下：

①于厭氧氨氧化反應(yīng)器的污泥床中取適量的菌泥，置于37℃烘箱中烘干（生物填料載體表面微生物的提取則是于反應(yīng)器中取5～10個(gè)生物填料載體，使用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行浸泡，然后將其置于適當(dāng)頻率的超聲波下進(jìn)行提取，再將提取液置于37℃烘箱中烘干）。

②將樣品過270～550 μm篩，然后根據(jù)土壤脫氫酶檢測盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）說明書對2個(gè)反應(yīng)器的底泥及生物填料載體表面微生物的脫氫酶活性進(jìn)行檢測。

1.5.4 微生物菌群結(jié)構(gòu)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，從3個(gè)反應(yīng)器中取出若干個(gè)生物填料載體及反應(yīng)器底泥；使用干冰進(jìn)行保存后，將樣品送至廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行高通量測序，以分析2種生物填料載體表面微生物菌群組成差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同改性生物填料載體對厭氧氨氧化反應(yīng)器脫氮性能的影響

添加生物填料載體后，反應(yīng)器性能的變化能夠最直觀地反映生物填料載體投加的作用，因此通過比較3個(gè)厭氧氨氧化反應(yīng)器在不同容積負(fù)荷條件下的脫氮性能，可以分析出不同改性生物填料載體對厭氧氨氧化反應(yīng)器脫氮性能的影響。

不同容積負(fù)荷條件下，3個(gè)厭氧氨氧化反應(yīng)器脫氮性能的變化情況如圖2和圖3所示。

圖2 不同厭氧氨氧化反應(yīng)器進(jìn)出水氮素及其去除率變化情況Fig.2 Changes of nitrogen concentration and removal rate in different anammox reactors

圖3 不同厭氧氨氧化反應(yīng)器容積負(fù)荷、容積去除量及去除效率變化情況Fig.3 Changes of NLR，NRR and NRE in different anammox reactors

為進(jìn)一步探究2種改性生物填料載體對厭氧氨氧化反應(yīng)器脫氮性能的影響，在第16天通過縮短反應(yīng)器的水力停留時(shí)間來提高反應(yīng)器的容積負(fù)荷。從圖2可以看出：此階段R0、R1、R2的去除率及其去除率均有所下降，3個(gè)反應(yīng)器的去除率依次下降至76.81%、77.12%和87.00%；而亞硝酸鹽去除率則依次降低至76.85%、78.55%和79.88%；同時(shí)，3個(gè)反應(yīng)器的脫氮效率也有所下降，在第20天時(shí)R0、R1、R2的脫氮效率依次為71.31%、71.62%和72.76%；這可能是由于在進(jìn)水基質(zhì)剛提高不久后直接縮短了反應(yīng)器的水力停留時(shí)間，部分進(jìn)水及未來得及被厭氧氨氧化菌代謝而直接被排放出反應(yīng)器，從而導(dǎo)致反應(yīng)器出水基質(zhì)濃度變高，反應(yīng)器脫氮性能有所下降［15］。

2.2 2種改性生物填料載體表面生物膜SEM分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，從R1和R22個(gè)反應(yīng)器中取出若干個(gè)改性生物填料載體，對其進(jìn)行掃描電鏡觀察，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出：2種改性生物填料載體表面布滿大量的球狀菌，它們之間緊密排列，并呈現(xiàn)厭氧氨氧化富集物的典型結(jié)構(gòu)——“花椰菜”結(jié)構(gòu)［24］。該掛膜效果僅僅使用了40 d，這說明本實(shí)驗(yàn)室改性的活性炭聚氨酯及聚乙烯塑料填料對厭氧氨氧化菌具有較好的吸附性能，高夢佳等［25］發(fā)現(xiàn)塑料填料載體掛膜需要105 d，并且塑料填料表面生物膜的厭氧氨氧化活性明顯低于海綿載體，造成結(jié)果差異性的原因主要是因?yàn)樗玫奶盍系碾姾尚阅?、親疏水性及粗糙程度等影響填料性能的重要參數(shù)［26］已經(jīng)過優(yōu)化設(shè)計(jì)，加強(qiáng)了改性生物填料載體對厭氧氨氧化菌的富集效果。一般而言，生物填料載體粗糙程度越大，親水性越強(qiáng)，越有利于微生物在生物填料載體表面形成生物膜［27］。高大文等［28］發(fā)現(xiàn)普通的聚氨酯泡沫海綿由于其表面光滑、比表面積較小且粗糙程度較低，該性質(zhì)并不利于微生物在其表面附著生長；高夢佳等［25］發(fā)現(xiàn)普通的塑料填料并不利于厭氧氨氧化菌的掛膜，在其實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第60天仍無法在普通塑料填料表面檢測到厭氧氨氧化活性。改性后的活性炭聚氨酯及聚乙烯塑料填料在一定程度上有利于厭氧氨氧化菌的吸附，分析其原因可能是：①向普通的聚氨酯泡沫海綿表面加入生物活性炭［29］，生物活性炭對微生物較強(qiáng)的吸附作用能夠有利于微生物在聚氨酯泡沫海綿表面形成生物膜［30］；②對聚乙烯塑料填料進(jìn)行改性，增加其粗糙程度及親水性，從而加速微生物在聚乙烯塑料填料表面的掛膜過程。

圖4 2種改性生物填料載體上生物膜的掃描電子顯微鏡圖Fig.4 SEM images of biofilms on two modified biological filler carriers

由圖4可見：在2種改性填料表面除了觀察到球形菌外，還明顯可以觀察到絲狀菌的存在，與Berg等［31］在厭氧氨氧化顆粒污泥及厭氧氨氧化生物膜表面觀察到厭氧氨氧化菌及絲狀菌共存在的現(xiàn)象一致。絲狀菌對于惰性載體有很強(qiáng)的吸附作用，其存在有利于微生物的聚集，從而增加生物填料載體上的生物量。

2.3 脫氫酶（DHA）活性檢測結(jié)果

厭氧氨氧化菌將N2H4氧化為N2的過程中，將形成4個(gè)電子，該4個(gè)電子會在厭氧氨氧化菌內(nèi)形成質(zhì)子梯度來促使菌體自身合成ATP［32－33］，而這種磷酸化水平在厭氧微生物體內(nèi)能夠通過脫氫酶的活性來進(jìn)行表征［34］。張正哲［35］研究發(fā)現(xiàn)：在反應(yīng)器運(yùn)行的整個(gè)過程中，厭氧氨氧化菌的活性（SAA）、heme C含量、TTC -DHA（脫氫酶活性）三者之間具有明顯的正相關(guān)關(guān)系，而厭氧氨氧化菌的活性與反應(yīng)器的脫氮性能在一定程度上也呈正相關(guān)關(guān)系，因此可以通過脫氫酶（DHA）活性來表征厭氧氨氧化反應(yīng)菌的活性及反應(yīng)器的脫氮性能。

3個(gè)UASB反應(yīng)器的底泥及2種改性生物填料表面微生物的脫氫酶（DHA）活性如圖5所示。由圖5可以發(fā)現(xiàn)：R1和R22個(gè)反應(yīng)器底泥的脫氫酶活性均高于對照組，說明改性生物填料載體的投加能夠提高反應(yīng)器內(nèi)厭氧氨氧化菌的活性，這可能是由于改性生物填料的添加，部分微生物在生物填料表面形成生物膜而得以保留在反應(yīng)器內(nèi)，反應(yīng)器內(nèi)微生物之間的交流得到進(jìn)一步加強(qiáng)，從而增強(qiáng)了厭氧氨氧化菌的活性。

圖5 3個(gè)厭氧氨氧化反應(yīng)器底泥及改性生物填料表面生物膜脫氫酶活性比較Fig.5 Comparison of dehydrogenase activity on sludge and biofilm in three anammox reactor

2種改性生物填料生物膜所含微生物的脫氫酶活性大小也有所差異，改性聚乙烯塑料填料表面生物膜的脫氫酶活性高于活性炭聚氨酯的。DHA的活性不僅與功能微生物自身的活性有關(guān)，與所測樣品功能菌群豐度及菌群構(gòu)成也具有一定的關(guān)系。聚烯烴類均為生物惰性材料，其生物相容性較差且對微生物的活性不具有促進(jìn)作用。所用的改性生物填料的表面粗糙程度被改變并引入其他物質(zhì)增加載體的親水性，加速厭氧氨氧化菌等功能微生物在其表面形成生物膜的同時(shí)促進(jìn)其表面微生物的活性，這與郭志濤等［36］的研究結(jié)果相似。郭志濤等［36］與海景等［27］發(fā)現(xiàn)改性后的聚烯烴類載體與未改性前相比，載體表面所形成的生物膜量明顯增加，反應(yīng)器對污染物的去除能力也得到進(jìn)一步增強(qiáng)。然而，活性炭的引入雖然加強(qiáng)聚氨酯填料對微生物的吸附，但是在聚氨酯表面形成的生物膜一般較厚、容易老化、脫落，使得載體表面所吸附的功能微生物數(shù)量部分喪失，并且生物膜活性往往較低。以上差異均可導(dǎo)致改性聚乙烯塑料填料表面生物膜脫氫酶活性高于活性炭聚氨酯。

2.4 反應(yīng)器底泥及改性載體表面微生物在屬水平上的菌群分析

厭氧氨氧化反應(yīng)器的脫氮性能不僅與反應(yīng)器內(nèi)微生物的生物活性有關(guān)，微生物的菌群結(jié)構(gòu)及功能菌群的豐度對反應(yīng)器的脫氮性能也影響甚遠(yuǎn)。改性生物填料載體的投加能夠?qū)Ψ磻?yīng)器內(nèi)部分微生物進(jìn)行富集，增加其在反應(yīng)器內(nèi)的豐度，進(jìn)而使得反應(yīng)器內(nèi)的性能發(fā)生變化。因此，通過對底泥及改性生物填料載體表面微生物進(jìn)行高通量測序，能夠在微觀角度解析改性生物填料載體的投加對反應(yīng)器脫氮性能造成影響的原因；同時(shí)通過比較改性填料載體表面功能菌群的豐度，可進(jìn)一步比較改性生物填料載體的性能優(yōu)劣。

以3個(gè)厭氧氨氧化反應(yīng)器底泥及2種改性生物填料載體表面生物膜微生物在屬水平上的含量為縱坐標(biāo)、物種名稱為橫坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖6所示。已知厭氧氨氧化菌可大致分為5種，分別為Candidatus kuenenia［37］、C.anammoxoglobus［38］、C.jettenia［39］、C.scalindua［40－41］及C.brocadia［42－43］，其中C.jettenia及C.anammoxoglobus在3個(gè)UASB反應(yīng)器中和2種改性生物填料載體表面均可被檢測到，并且無論是底泥亦或者改性生物填料載體上，C.jettenia為其中優(yōu)勢厭氧氨氧化菌（圖6）。

圖6 反應(yīng)器底泥及填料載體表面微生物菌群結(jié)構(gòu)屬水平上的比較Fig.6 Composition of biofilm microorganismson two modified carriers and sludge in three

由圖6可以看出：活性炭聚氨酯反應(yīng)器及對照組的厭氧氨氧化菌豐度差異主要體現(xiàn)在活性炭聚氨酯上富集了一定數(shù)量的厭氧氨氧化菌；而投加改性聚乙烯塑料填料的厭氧氨氧化反應(yīng)器，無論是底泥還是填料表面，其厭氧氨氧化菌的豐度都較活性炭聚氨酯反應(yīng)器及對照組要高；投加改性聚乙烯塑料填料的反應(yīng)器的底泥厭氧氨氧化菌豐度較對照組約高出50%。因此，投加了改性聚乙烯塑料填料的反應(yīng)器在相同容積負(fù)荷條件下，其脫氮性能往往是最高的，活性炭聚氨酯次之，而最差的則為對照組。上述結(jié)果也表明改性聚乙烯塑料填料的投加能夠更為有效促進(jìn)厭氧氨氧化菌的富集。該結(jié)論與高夢佳等［25］的研究結(jié)果相反，可能是由于所用填料經(jīng)目的性地改性后，增加了其對厭氧氨氧化菌的富集效果。

綜合3個(gè)厭氧氨氧化反應(yīng)器的脫氮性能、脫氫酶活性及微生物菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果可知：2種改性生物填料載體的投加對厭氧氨氧化反應(yīng)器的脫氮性能均有一定的促進(jìn)效果；并且相比于活性炭聚氨酯生物填料而言，無論是在對反應(yīng)器脫氮性能的提高方面還是對厭氧氨氧化菌的富集方面，改性的聚乙烯塑料填料的效果明顯較好。

3 結(jié)論

1）向厭氧氨氧化反應(yīng)器內(nèi)投加活性炭聚氨酯和改性的聚乙烯塑料填料均能在一定程度上提高厭氧氨氧化反應(yīng)器的脫氮性能，并且相比于活性炭聚氨酯生物填料，改性聚乙烯塑料填料對厭氧氨氧化反應(yīng)器脫氮性能的提高效果更為明顯。隨著反應(yīng)器容積負(fù)荷的提高，3個(gè)反應(yīng)器的脫氮性能開始出現(xiàn)差異，投加改性生物填料載體反應(yīng)器的脫氮性能往往高于未投加改性填料載體的反應(yīng)器；當(dāng)反應(yīng)器容積負(fù)荷提升至1.37 kg／（m3·d）時(shí)，添加活性炭聚氨酯及改性聚乙烯塑料填料的反應(yīng)器，其總氮去除率仍分別為76.41%和82.89%，而未添加改性生物填料的反應(yīng)器總氮去除率僅剩70.26%，改性聚乙烯塑料填料對厭氧氨氧化性能的強(qiáng)化最為顯著。

2）通過掃描電子顯微鏡可在2種改性生物填料載體表面觀察到明顯的花椰菜結(jié)構(gòu)，說明2種改性生物填料載體對厭氧氨氧化菌均具有良好的吸附效果。

3）投加改性填料載體的反應(yīng)器底泥的脫氫酶活性均高于對照組，說明改性生物填料載體的投加能夠提高反應(yīng)器內(nèi)厭氧氨氧化菌的活性。然而相對于活性炭聚氨酯而言，改性聚乙烯塑料填料表面生物膜的脫氫酶活性明顯較高，脫氮效率最佳；反應(yīng)器底泥及改性填料載體表面微生物脫氫酶活性差異導(dǎo)致3個(gè)厭氧氨氧化反應(yīng)器脫氮性能不同。

4）通過高通量測序?qū)?個(gè)反應(yīng)器底泥及2種改性生物填料載體表面微生物進(jìn)行菌群構(gòu)成分析，發(fā)現(xiàn)投加改性生物填料的反應(yīng)器，其厭氧氨氧化菌的總豐度高于對照組，說明改性生物填料的投加能夠增加反應(yīng)器對功能菌群的持留；并且投加改性聚乙烯塑料填料的反應(yīng)器，底泥及填料表面厭氧氨氧化菌的豐度都明顯較高，說明改性聚乙烯塑料填料在促進(jìn)反應(yīng)器性能等各方面都具有較強(qiáng)的優(yōu)勢。