袁 河，周 穩(wěn)，包 駿，張 艷，趙志友

（湖南省檳榔加工與食用安全工程技術(shù)研究中心，湖南賓之郎食品科技有限公司檢測(cè)中心，湖南 湘潭411100）

檳榔，是一種棕櫚科檳榔屬常綠喬木的果實(shí)，又稱賓門、檳楠、大白檳、仁頻、仁榔、洗瘴丹等。檳榔的種子、果皮、花皆可入藥，是傳統(tǒng)的中藥材。檳榔雖然沒(méi)有被列入藥食同源名錄，但人類嚼食檳榔的歷史可追溯數(shù)千年。朱利明［1］在《尋味檳榔》一書中介紹道，世界上檳榔的年產(chǎn)量近100萬(wàn)t，嚼食人數(shù)超過(guò)10億人，約占世界人口總數(shù)的15%。世界上檳榔的主要生產(chǎn)國(guó)依次為印度、中國(guó)、孟加拉國(guó)，其他重要生產(chǎn)國(guó)還有緬甸、泰國(guó)、越南、印度尼西亞和斯里蘭卡。我國(guó)95%的檳榔來(lái)自海南。2017年海南省新栽種面積28.35 km2，累計(jì)栽種面積首次突破1 000 km2，達(dá)到1 025.3 km2。據(jù)《海南統(tǒng)計(jì)年鑒2018》［2］，2017年海南省共產(chǎn)檳榔255 114 t，其中，瓊海市產(chǎn)42 079 t，萬(wàn)寧市產(chǎn)41 063 t，瓊中縣產(chǎn)25 785 t，此三地產(chǎn)量排名前三。檳榔雖然可以用作藥品，但大部分原料產(chǎn)品卻不流向藥材市場(chǎng)，而是用于簡(jiǎn)單加工制成商品檳榔來(lái)銷售。從20世紀(jì)90年代至今，湖南檳榔已經(jīng)從原來(lái)的作坊式發(fā)展到工業(yè)化、自動(dòng)化，銷售區(qū)域擴(kuò)散到全國(guó)，年銷售額數(shù)百億，已然是一個(gè)不容忽視的食品行業(yè)。

湖南檳榔成品水分含量一般維持在23%～26%，但不屬于高溫殺菌食品，微生物風(fēng)險(xiǎn)較高。近年來(lái)隨著行業(yè)逐漸成熟，微生物的控制情況向良好方向發(fā)展。隨著檳榔行業(yè)對(duì)微生物控制的要求提高，微生物檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性越來(lái)越受到重視。檳榔產(chǎn)品水分較高，制作時(shí)不經(jīng)過(guò)高溫殺菌，且在檢測(cè)取樣制備樣液時(shí)檳榔不經(jīng)切割分散，其他食品微生物檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)放在檳榔上可能存在較大的誤差。然而，目前尚無(wú)檳榔微生物測(cè)量不確定度的分析報(bào)道。因此，本研究建立檳榔中霉菌和酵母定量檢測(cè)測(cè)量不確定度評(píng)定的方法，以期為檳榔行業(yè)的微生物檢測(cè)準(zhǔn)確度提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 測(cè)試樣品

測(cè)試樣品均取自生產(chǎn)過(guò)程中經(jīng)發(fā)籽工藝處理后的檳榔。

1.1.2 主要設(shè)備和材料

培養(yǎng)箱（28℃±1℃），天津市意博高科技實(shí)驗(yàn)有限公司；拍擊式均質(zhì)器及均質(zhì)袋，青島眾瑞只能儀器有限公司；電子天平（感量0.1 g），奧豪斯（常州）儀器有限公司；恒溫水浴箱（46℃±1℃），天津市泰斯特儀器有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%的生理鹽水；孟加拉紅瓊脂，鄭州益康化工產(chǎn)品有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟與計(jì)數(shù)方法

按文獻(xiàn)［3］第一法執(zhí)行。霉菌和酵母分開(kāi)計(jì)數(shù)。

2 不確定度的來(lái)源分析及評(píng)定

2.1 數(shù)學(xué)模型的建立

霉菌和酵母的計(jì)數(shù)方法參照文獻(xiàn)［3］，其中，若只有一個(gè)稀釋梯度的2個(gè)平板菌落數(shù)在10～150 CFU／g，則按式（1）計(jì)算。

若有2個(gè)連續(xù)稀釋梯度的平板上菌落數(shù)在10～150 CFU／g，則按式（2）計(jì)算。

式中：N為樣品中菌落數(shù)，其中，用NX表示霉菌計(jì)數(shù)，用NY表示酵母計(jì)數(shù)；A為平行實(shí)驗(yàn)中平板1的計(jì)數(shù)；B為平行實(shí)驗(yàn)中平板2的計(jì)數(shù)；∑c為平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；n1為第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；n2為第二稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；d為稀釋因子（第一稀釋度）。

2.2 均勻性引入的不確定度

樣品的不均勻性是帶來(lái)不確定度的重要因素。本研究的樣品均按照GB 4789.1—2016的規(guī)定［4］，將樣品充分混合后隨機(jī)取樣。因此，可認(rèn)為樣品是均勻的，在此忽略由取樣的不均勻性帶來(lái)的不確定性。

2.3 樣品稱量引入的不確定度

因?yàn)閱晤w檳榔質(zhì)量較大，且為了避免交叉污染而不對(duì)其進(jìn)行切片處理，所以稱質(zhì)量時(shí)難以精確到25.0 g。為了方便操作，允許取樣在（25.0±1.0）g，這屬于均勻分布，所以由樣品稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

電子天平引起的不確定度：本實(shí)驗(yàn)所用的電子天平最大量程為1 000 g，允許誤差為±0.1 g。根據(jù)JJF 1059.1—2012的規(guī)定［5］，由數(shù)據(jù)修約、測(cè)量?jī)x器最大允許誤差或分辨力、參考數(shù)據(jù)的誤差限、度盤或齒輪的回差、平衡指示器調(diào)零不準(zhǔn)、測(cè)量?jī)x器的滯后或摩擦效應(yīng)導(dǎo)致的不確定度，通常假設(shè)為均勻分布，因此由電子天平引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

由樣品稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

因此，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.4 樣液制備引入的不確定度

樣液制備需使用250 mL量筒量取225 mL無(wú)菌生理鹽水加入稱量好的25.0 g樣品中。根據(jù)JJG 196—2006的規(guī)定［6］，20℃時(shí)量入式量筒的容量允許差為±2.0 mL，屬于B類評(píng)定。根據(jù)《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》［7］，此項(xiàng)屬于三角分布，樣液制備引入的不確定度為

因此，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.5 梯度稀釋引入的不確定度

梯度稀釋是指采用1 mL無(wú)菌吸頭吸取不同稀釋級(jí)溶液1 mL至9 mL無(wú)菌生理鹽水的過(guò)程。這一過(guò)程中用1 mL移液器來(lái)移取1 mL不同稀釋級(jí)溶液，用5 mL移液器來(lái)制備9 mL無(wú)菌生理鹽水。根據(jù)JJG 646—2006的規(guī)定［8］，當(dāng)檢定點(diǎn)為500 μL和1 000 μL時(shí)，1 mL移 液 器 的 容 量 允 許 誤 差為±1.0%；當(dāng)檢定點(diǎn)為2 500 μL和5 000 μL時(shí)，5 mL移液器的容量允許誤差分別為±0.5%和±0.6%，在此按±0.6%計(jì)。這屬于B類評(píng)定。按三角分布取每吸取1 mL稀釋溶液時(shí)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

因此其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

每吸取9 mL生理鹽水時(shí)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

因此其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

本研究取第1～3個(gè)稀釋度（10－1、10－2、10－3）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和計(jì)數(shù)，稀釋過(guò)程共進(jìn)行了3次，則稀釋過(guò)程引入的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.6 接種體積引入的不確定度

本研究選擇3個(gè)梯度的混合均勻的樣液，分別吸取1 mL樣品勻液于2個(gè)無(wú)菌平皿內(nèi)。因此其引入誤差有6個(gè)樣品。根據(jù)JJG 646—2006的規(guī)定［8］，1 mL移液器的容量允許誤差為±1%。按三角分布，因此，其引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

因此，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.7 重復(fù)性檢測(cè)引入的不確定度

重復(fù)性檢測(cè)過(guò)程不可避免地產(chǎn)生大量隨機(jī)性誤差，得到的檢測(cè)數(shù)據(jù)往往呈近似正態(tài)分布。重復(fù)性檢測(cè)是引入不確定度最重要的因素之一，在分析檢測(cè)方法的不確定度時(shí)尤其需要注意。因?yàn)槲⑸锏奶匦?，微生物檢測(cè)數(shù)據(jù)發(fā)散性大，不適合直接使用數(shù)據(jù)進(jìn)行不確定度分析，而需要以微生物計(jì)數(shù)的對(duì)數(shù)值來(lái)分析不確定度。表1是重復(fù)性檢測(cè)引入的不確定度屬于A類評(píng)定，可以借助貝塞爾公式來(lái)計(jì)算檢測(cè)結(jié)果對(duì)數(shù)值的樣品標(biāo)準(zhǔn)偏差，從而進(jìn)一步求得重復(fù)性檢測(cè)引入的不確定度。霉菌和酵母總數(shù)的檢測(cè)結(jié)果及殘差平方的計(jì)算結(jié)果如表1所示。

2.7.1 重復(fù)性檢測(cè)引入的霉菌的標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計(jì)算

根據(jù)表1的檢測(cè)及計(jì)算結(jié)果，霉菌計(jì)數(shù)的對(duì)數(shù)單次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差為

霉菌計(jì)數(shù)的對(duì)數(shù)單次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

霉菌計(jì)數(shù)的對(duì)數(shù)單次測(cè)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.7.2 重復(fù)性檢測(cè)引入的酵母的標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計(jì)算

根據(jù)表1的檢測(cè)及計(jì)算結(jié)果，酵母計(jì)數(shù)的對(duì)數(shù)單次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差為

酵母計(jì)數(shù)的對(duì)數(shù)單次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

酵母計(jì)數(shù)的對(duì)數(shù)單次測(cè)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.8 檳榔中霉菌和酵母的不確定度評(píng)定

2.8.1 霉菌和酵母的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

由于不同的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量具有不同的單位，因此需要計(jì)算不同標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量的的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度來(lái)求得合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，再根據(jù)平均檢測(cè)值即可求得整體的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

因此，霉菌的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

酵母的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則霉菌的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

酵母的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.8.2 霉菌和酵母的擴(kuò)展不確定度

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的原理，標(biāo)準(zhǔn)不確定度給出測(cè)量結(jié)果所在的區(qū)間，只是被測(cè)量值可能出現(xiàn)的一部分，其可信程度不高（如正態(tài)分布只占68.27%），為了提高對(duì)測(cè)量結(jié)果所在區(qū)間評(píng)定的可信程度，通常提供給客戶的應(yīng)是特定包含概率下的擴(kuò)展不確定度。據(jù)此告知用戶檢測(cè)和校準(zhǔn)結(jié)果就在以報(bào)告值為中心的包含區(qū)間內(nèi)，擴(kuò)展不確定度由合成不確定度乘以適當(dāng)?shù)陌蜃觡得到［9］。

在本研究的重復(fù)檢測(cè)中共檢測(cè)了10個(gè)樣品，根據(jù)GB 4789.15—2016的規(guī)定［3］，每份檢測(cè)3個(gè)梯度，每個(gè)梯度平行2份，表1中的檢測(cè)值是已經(jīng)過(guò)計(jì)算后的值。因此，取自由度v＝9，檢測(cè)值近似正態(tài)分布，取置信水平95%。根據(jù)JJF 1059.1—2012的規(guī)定［5］，當(dāng)估計(jì)值NY的數(shù)值和它的合成不確定度uc（NY）所表征的概率分布近似為正態(tài)分布時(shí)，且uc（NY）的有效自由度較大情況下，若k＝2，則u＝2uc所確定的區(qū)間的包含概率約為95%。在通常測(cè)量中，一般取k＝2。因此，在此取k＝2。

檳榔中霉菌檢測(cè)的擴(kuò)展不確定度為

檳榔中酵母檢測(cè)的擴(kuò)展不確定度為

2.9 結(jié)果報(bào)告

根據(jù)上述計(jì)算得到的擴(kuò)展不確定度，可以計(jì)算在置信水平為95%的條件下，霉菌計(jì)數(shù)值的對(duì)數(shù)平均值的取值范圍為（1.655 6－0.342 4）≤（1.655 6＋0.342 4），即1.313 2≤≤1.998。取反對(duì)數(shù)，可得到檢測(cè)結(jié)果NX的分布區(qū)間為20.568 4≤NX≤99.540 5。即該檢測(cè)樣品的霉菌估計(jì)值為20≤NX≤100 CFU／g。

3 討論

分析數(shù)據(jù)可知，不同不確定度對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響大小可排列為urel（lgNX）＞urel（lgNY）＞urel（樣品）＞urel（接種）＞urel（稀釋）＞urel（樣液）?？梢?jiàn)，樣品的重復(fù)檢測(cè)給檢測(cè)結(jié)果的不確定度帶來(lái)了最大的貢獻(xiàn)。微生物檢測(cè)結(jié)果發(fā)散性大是學(xué)界的普遍認(rèn)知。一方面，微生物在樣品中分布不均勻是造成檢測(cè)結(jié)果有差異的重要原因［10］。另一方面，平板的菌落計(jì)數(shù)是引起檢測(cè)結(jié)果有差異的另一重要原因［11］。郭麗艷［12］認(rèn)為，霉菌在培養(yǎng)的過(guò)程當(dāng)中，因反復(fù)觀察而上下翻轉(zhuǎn)平板會(huì)導(dǎo)致霉菌孢子擴(kuò)散，形成次生小菌落，進(jìn)而影響計(jì)數(shù)結(jié)果。此外，均質(zhì)方式也會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的測(cè)量不確定度。如使用旋轉(zhuǎn)式刀片均質(zhì)器，則可能會(huì)因?yàn)榍袛嗑z體而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏高［13］。因此，這種易引起誤差的因素給檢測(cè)值位于限量標(biāo)準(zhǔn)附近的產(chǎn)品是否合格帶來(lái)了很大的隨機(jī)性。為此，根據(jù)文獻(xiàn)［14］要求，當(dāng)測(cè)量不確定度影響與規(guī)范限的符合性時(shí)，檢測(cè)報(bào)告需帶有與被測(cè)量相同單位的測(cè)量不確定度或被測(cè)量相對(duì)形式的測(cè)量不確定度（百分比）。測(cè)量不確定度的引入給位于限量標(biāo)準(zhǔn)附近的產(chǎn)品帶來(lái)了兼具科學(xué)性和安全性的判定依據(jù)。

此外，當(dāng)前在一些研究霉菌和酵母的不確定度的報(bào)道中將霉菌和酵母統(tǒng)一計(jì)數(shù)，并不分開(kāi)進(jìn)行，這與GB 4789.15—2016中的規(guī)定［3］是相悖的。本研究也發(fā)現(xiàn)，霉菌和酵母在重復(fù)性檢測(cè)中存在不同的測(cè)量不確定度分量，霉菌重復(fù)性檢測(cè)的不確定度分量顯然更高。霉菌的蔓延性以及孢子的易擴(kuò)散性可能是使霉菌重復(fù)性檢測(cè)的不確定度提高的重要原因。這說(shuō)明，在霉菌與酵母的檢測(cè)和測(cè)量不確定度評(píng)定中，均應(yīng)該將霉菌與酵母分開(kāi)計(jì)數(shù)。

4 結(jié)論

本研究評(píng)定了食用檳榔中霉菌和酵母總數(shù)的測(cè)量不確定度。結(jié)果表明，在置信水平為95%的條件下，該檢測(cè)樣品的霉菌估計(jì)值為20≤NX≤100 CFU／g；該檢測(cè)樣品的酵母估計(jì)值為85≤NY≤317 CFU／g。結(jié)果還表明，霉菌和酵母在重復(fù)性檢測(cè)中的測(cè)量不確定度存在明顯差異。這說(shuō)明一些企業(yè)將霉菌和酵母統(tǒng)一計(jì)數(shù)的方式不可取，而應(yīng)該對(duì)霉菌和酵母總數(shù)分別計(jì)數(shù)，并分別計(jì)算測(cè)量不確定度。本研究結(jié)果可為檳榔企業(yè)在內(nèi)部質(zhì)量控制中起到參考作用，既可以避免過(guò)分要求少菌無(wú)菌帶來(lái)的高昂成本和技術(shù)困難，又可以切實(shí)降低微生物超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)。因此，在食品行業(yè)的微生物檢測(cè)報(bào)告中引入不確定度可以使該報(bào)告兼具科學(xué)性和安全性的判定依據(jù)。