龍倩倩，趙小勤，代 琪，雷 蕾

(1.成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院 國家藥監(jiān)局中藥材質(zhì)量監(jiān)測評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610045；2.西南民族大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 610041)

《中國藥典》經(jīng)過歷版的不斷修訂，目前已成為世界上質(zhì)控指標(biāo)最完善、檢測技術(shù)最先進(jìn)的中草藥標(biāo)準(zhǔn)之一。但通過對比《中國藥典》和《歐洲藥典》《德國藥品法典》發(fā)現(xiàn)，部分《歐洲藥典》《德國藥品法典》收錄的中草藥品種前處理相對簡單，使用溶劑更環(huán)保，禁用苯、三氯甲烷等毒性較強(qiáng)的試劑，從而更好地保障檢驗(yàn)人員的身體健康。

黃柏為蕓香科植物黃皮樹PhellodendronchinenseSchneid.的干燥樹皮，入藥首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，名曰“檗木”，南北朝時(shí)期又名“黃檗”，至近代始有“黃柏”之稱。黃柏具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡的功效，黃柏臨床應(yīng)用廣泛，中醫(yī)藥典籍中收錄含黃柏的方劑眾多，常用于治療濕熱瀉痢、黃疸尿赤、帶下陰癢、骨蒸勞熱等癥[1-3]。

黃柏1963年始收入《中國藥典》[4]，后歷版藥典均有收載?！吨袊幍洹?020年版中黃柏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目設(shè)置較完善，但存在以下不足：薄層鑒別效果較差且展開劑使用毒性較強(qiáng)的三氯甲烷；含量測定流動(dòng)相配制較復(fù)雜且供試品處理中使用的乙腈較毒。本課題借鑒《歐洲藥典》10.0版和《德國藥品法典》2018年版的思維模式，對黃柏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)展開研究，合并黃柏兩個(gè)含量測定項(xiàng)為一項(xiàng)，合并薄層鑒別和含量測定的樣品前處理，簡化流動(dòng)相配制條件，將樣品提取溶劑和薄層展開劑改為低毒試劑，從而優(yōu)化了原標(biāo)準(zhǔn)，使檢測變得更為簡單快捷、綠色環(huán)保。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters-2998高效液相色譜儀，Waters-e2695 Photodiode Array Detector 檢測器，Empower pro自動(dòng)進(jìn)樣色譜工作站(美國Waters公司)；Anilent 1260高效液相色譜儀，Anilent 1260 DAD檢測器，LC openLAB自動(dòng)進(jìn)樣色譜工作站(美國安捷倫公司)；AUX220電子天平(日本島津公司，1/1萬)；XPE26電子天平(梅特勒-托尼多儀器有限公司，1/100萬)；SK250H超聲儀(250 W，53 kHz，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；移液槍(Eppendorf，Germany)等。

1.2 試劑與藥品

鹽酸黃柏堿(94.9%，111895-201805)、鹽酸小檗堿(85.9%，110713-202015)，黃柏對照藥材(121510-201807)，對照品和對照藥材均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈(色譜純)；其余試劑(分析純)；水(實(shí)驗(yàn)室自制純凈水)。

黃柏樣品20批(編號：CD-1、CD-2、CD-3、CD-4、CD-5、CD-6、CD-7、CD-8、CD-9、CD-10、CD-11、CD-12、CD-13、CD-14、CD-15、CD-16、CD-17、CD-18、CD-19、CD-20)，來源信息見表1。

表1 黃柏樣品來源

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 選定薄層鑒別方法 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品備用溶液，作為供試品溶液。另取黃柏對照藥材約1 g，同法制成對照藥材溶液。再取含量測定項(xiàng)下鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿的混合對照品溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(參照《中國藥典》2020年版通則0502)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以無水甲酸-水-乙酸乙酯(10∶10∶80)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。其中，以苦參堿、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿混合對照品溶液和1/4濃度的鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿混合對照品溶液對該條件進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，結(jié)果表明，方法可行，薄層色譜見圖1。

注：1.系統(tǒng)適用性試驗(yàn)；2.鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿混合對照；3.1/4鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿混合對照；4.黃柏對照藥材；5.CD-1；6.CD-2；7.CD-3；8.CD-4；9.CD-5；10.CD-6；11.CD-7；12.CD-8；13.CD-9。

2.1.2 各薄層條件方法篩選 (1)供試品溶液制備：①按《歐洲藥典》EP10.0黃連項(xiàng)下薄層鑒別方法處理黃柏樣品，即取0.25 g黃柏粉末，加4 mL的80%甲醇溶液，超聲10 min，過濾，用80%甲醇溶液2次清洗殘留物，每次2 mL，合并溶液并用甲醇稀釋至20 mL，作為供試品溶液1；②按《中國藥典》2020年版黃柏項(xiàng)下薄層鑒別方法處理黃柏樣品，即取本品粉末0.2 g，加1%醋酸甲醇溶液40 mL，于60℃超聲處理20 min，濾過，濾液濃縮至2 mL，作為供試品溶液2；③按“2.1”選定方法處理，作為供試品溶液3。

(2)對照品溶液制備：分別取鹽酸黃柏堿對照品、鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加1%鹽酸甲醇溶液制成每1 mL各約含0.1 mg的對照品溶液，即得。

(3)薄層展開條件及顯色條件篩選：①以三氯甲烷-甲醇-水(30∶15∶4)的下層溶液為展開劑，置氨蒸氣預(yù)飽和的展開缸內(nèi)展開[1]；②以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)為展開劑[6-7]；③以正丁醇-冰醋酸-水(7∶2∶5)為展開劑[8]；④以無水甲酸-水-乙酸乙酯(10∶10∶80)為展開劑。上述條件下展開后取出，晾干，再噴以稀碘化鉍鉀試液，置日光下檢視，薄層色譜見圖2。

注：1.供試品溶液1；2.供試品溶液2；3.供試品溶液3；4.鹽酸小檗堿；5.鹽酸黃柏堿。

由薄層色譜圖可見，按《歐洲藥典》EP10.0黃連項(xiàng)下薄層鑒別方法提取的黃柏樣品，在與鹽酸黃柏堿對照品相同位置無斑點(diǎn)，因此該提取方法不可行；按《中國藥典》2020年版黃柏項(xiàng)下薄層鑒別方法提取的黃柏樣品與選定方法效果一致，但選定方法可直接采用含量測定項(xiàng)下提取溶液，操作更簡便。

薄層展開劑①為《中國藥典》2020年版黃柏項(xiàng)下薄層色譜展開條件，其中三氯甲烷毒性較大，不符合歐盟環(huán)保要求；薄層展開劑④展開時(shí)間且效果優(yōu)于展開劑②和③，因此選定薄層展開劑④為本標(biāo)準(zhǔn)薄層展開劑。另有文獻(xiàn)采用乙酸乙酯-甲苯-異丙醇-甲醇-濃氨試液(6∶12∶3∶3∶1)[9]或甲苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-濃氨液(6∶3∶1.5∶1.5∶0.5)[10]為展開劑，但因甲苯毒性較強(qiáng)，故未進(jìn)行相關(guān)考察。

2.2 鹽酸黃柏堿、鹽酸小檗堿含量測定

2.2.1 色譜條件 以InerSustain C18柱(250mm×4.0 mm、5μm)為色譜柱；以1%磷酸二氫鉀溶液為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，梯度洗脫：0～20 min，95%～83%(A)；20～28 min，83%～50%(A)；28～33 min，50%～95%(A)；33～35 min，95%(A)；柱溫：35 ℃；流速1.0 mL/min；檢測波長為230 nm。理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.2.2 溶液的制備 (1)對照品溶液：取鹽酸黃柏堿對照品、鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加1%鹽酸甲醇溶液制成每1 mL約含0.1 mg的混合溶液，即得。

(2)供試品溶液：取本品細(xì)粉約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入1%鹽酸甲醇溶液50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用1%鹽酸甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液2 mL(其余濾液備用)，置10 mL量瓶中，加1%鹽酸甲醇溶液至刻度，搖勻，即得。對照品和供試品溶液色譜見圖3。

注：1.鹽酸黃柏堿；2.鹽酸小檗堿。(A)和供試品溶液(B)HPLC 圖。

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密稱取鹽酸黃柏堿對照品22.321 mg，置50 mL量瓶中，加1%磷酸二氫鉀溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液母液。將母液分別稀釋至8個(gè)不同濃度溶液，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積，計(jì)算線性關(guān)系。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：y=1 587 608.840 7-20 381.838 4，R2=0.999 7。結(jié)果表明，鹽酸黃柏堿進(jìn)樣量在0.021 2～4.236 5μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

精密稱取鹽酸小檗堿對照品102.260 mg，置50 mL量瓶中，加1%磷酸二氫鉀溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液母液。將母液分別稀釋至8個(gè)不同濃度溶液，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積，計(jì)算線性關(guān)系。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：y=3 687 823.565 6x+50 162.086 6，R2=0.999 6。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿進(jìn)樣量在0.175 7μg～17.568 3μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批樣品(CD-3)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、16、20、24 h測定鹽酸黃柏堿、鹽酸小檗堿的峰面積，RSD分別為1.88%、1.47%；另取鹽酸黃柏堿對照品溶液(0.098 53 mg/mL)，鹽酸小檗堿對照品溶液(0.090 26 mg/mL)分別于0、2、4、8、12、16、20、24 h測定鹽酸黃柏堿、鹽酸小檗堿的峰面積，RSD分別為0.88%、1.43%。結(jié)果表明供試品溶液和對照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對照品溶液和供試品溶液(“2.2.4”項(xiàng)下對照品溶液和供試品溶液)重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣10μL，測定峰面積，結(jié)果顯示RSD均<1.0%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按擬定的含量測定方法，對同一批樣品(CD-3)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，測定含量，RSD分別為1.26%、1.98%，結(jié)果表明本方法有較好的重復(fù)性。

2.2.7 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取已知含量(鹽酸黃柏堿為6.143 4 mg/g，鹽酸小檗堿為55.457 9 mg/g)的黃柏供試品(CD-3)9份，每份約0.5 g，精密稱定，分成3組，每組3份，3組分別按照供試品中鹽酸黃柏堿含有量的50%、100%、150%加入鹽酸黃柏堿對照品溶液(濃度為0.423 7 mg/mL)4 mL、8 mL、12 mL；按3組供試品中鹽酸小檗堿含有量的50%、100%、150%加入鹽酸小檗堿對照品溶液(濃度為1.756 8 mg/mL)8 mL、16 mL、24 mL。按擬定的方法制成供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積，分別計(jì)算回收率，結(jié)果鹽酸黃柏堿的回收范圍為100.54%～103.20%，鹽酸小檗堿的回收范圍為97.68%～100.50%，RSD值均小于2%。結(jié)果見表2、表3，試驗(yàn)結(jié)果表明本方法準(zhǔn)確度良好。

表2 鹽酸黃柏堿準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=3)

表3 鹽酸小檗堿準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=3)

2.2.8 樣品含量測定 取表1中的黃柏藥材、飲片樣品適量，每個(gè)樣品平行3份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算各批樣品中鹽酸黃柏堿和鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品鹽酸黃柏堿和鹽酸小檗堿含量測定結(jié)果 (n=3)

2.3 其他檢驗(yàn)項(xiàng)目

經(jīng)研究，《中國藥典》2020版一部黃柏項(xiàng)下性狀及顯微鑒別描述準(zhǔn)確，水分、灰分、浸出物的規(guī)定合理。20批黃柏樣品水分、灰分、浸出物見表5。

表5 樣品水分、總灰分、浸出物含量測定結(jié)果 (n=3)

3 討論

3.1 薄層顯色條件的考察

經(jīng)考察發(fā)現(xiàn)，選用三批樣品(CD-1、CD-2、CD-3)采用本標(biāo)準(zhǔn)選定條件提取供試品溶液，以無水甲酸-水-乙酸乙酯(10∶10∶80)展開后，晾干，立即置紫外光燈(365 nm)下檢視，鹽酸黃柏堿無斑點(diǎn)檢出，但放置12 h后，再置紫外光燈(365 nm)下檢視，鹽酸黃柏堿有明顯斑點(diǎn)檢出，因此，也可選用展開后，晾干，放置12 h后，置紫外光燈(365 nm)下檢視為薄層顯色條件，該方法不需配制顯色劑，更為經(jīng)濟(jì)環(huán)保，但考慮到檢品通常具有時(shí)效性，本標(biāo)準(zhǔn)未采用該方法，薄層圖見圖4。

注：1.CD-1；2.CD-2；3.CD-3；4.鹽酸黃柏堿；5.鹽酸小檗堿

3.2 提取溶媒的選擇

參考黃柏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測定相關(guān)文獻(xiàn)[11-14]，共考察了6種溶媒：乙腈-0.1%磷酸溶液(50∶50)(每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.1 g)、乙腈-0.1%磷酸溶液(每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.2 g)(36∶64)、1%鹽酸甲醇溶液、1%醋酸甲醇溶液、0.2%鹽酸甲醇溶液、0.2%醋酸甲醇溶液，結(jié)果顯示，鹽酸黃柏堿溶媒2和溶媒3提取效果較好，鹽酸小檗堿溶媒1和溶媒3提取效果較好，但1和2兩種溶媒提取均配制較繁瑣且乙腈毒性較大，溶媒3毒性較低且配制簡單，且提取效果與溶媒1和溶媒2差別不大，因此，本標(biāo)準(zhǔn)選定溶媒3為提取溶劑。

3.3 流動(dòng)相選擇

《中國藥典》2020版黃柏項(xiàng)下[1]，以乙腈-0.1%磷酸溶液(50∶50)(每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.1 g)測定鹽酸小檗堿，乙腈-0.1%磷酸溶液(每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.2 g)(36∶64)測定鹽酸黃柏堿，兩種流動(dòng)相配制均較繁瑣。查閱相關(guān)文獻(xiàn)[8-14]，黃柏含量測定多數(shù)均采用乙腈-鹽溶液為流動(dòng)相，配制也較復(fù)雜。也有提到采用乙腈-0.2%磷酸水溶液為流動(dòng)相[15]，但經(jīng)試驗(yàn)峰形較差。最終參考《歐洲藥典》EP 10.0黃連含量測定項(xiàng)下方法[5]，為保護(hù)色譜柱，經(jīng)試驗(yàn)在保證峰形和分離度不變的前提下，進(jìn)一步降低鹽溶液濃度，最終以乙腈-1%磷酸二氫鉀溶液為流動(dòng)相。

4 結(jié)論

本課題調(diào)研多篇文獻(xiàn)，嘗試從以人為本的角度，在保證檢測效果的前提下，盡可能為檢驗(yàn)者提供更簡單、快捷、綠色的檢測標(biāo)準(zhǔn)。目前《中國藥典》項(xiàng)下中藥材和中成藥涉及的儀器和技術(shù)越來越先進(jìn)，質(zhì)控體系也越來越完善，但因歷史原因，前期起草的部分標(biāo)準(zhǔn)可能會存在一些可提高的地方。本研究參考《中國藥典》項(xiàng)下黃柏標(biāo)準(zhǔn)，借鑒《歐洲藥典》和《德國藥品法典》思維模式，制定黃柏新標(biāo)準(zhǔn)時(shí)盡可能綠色簡單，希望能為大家在以后制定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)提供參考。