鄔國強(qiáng),汪學(xué)杰,牟希東,劉 超,劉 奕,楊葉欣,胡隱昌,宋紅梅
(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部休閑漁業(yè)重點實驗室,廣東省現(xiàn)代休閑漁業(yè)工程技術(shù)研究中心,廣州 510380;2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海 201306)
血鸚鵡魚(Viejasynspila♀×Amphilophus citrinellus♂),俗稱發(fā)財魚,屬鱸形目(Perciformes),慈鯛科(Cichlidae),是由慈鯛科的父本紅魔鬼魚(Amphilophuscitrinellus)和母本紫紅火口魚(Viejasynspila)雜交獲得,仔魚期體呈黑色,成魚期體通紅,呈橢圓狀。因其體色鮮艷,體態(tài)喜人,深受消費(fèi)者喜愛,是觀賞魚市場中主要的銷售品種之一。傳統(tǒng)的觀賞魚飼料多以鮮活的餌料為主,如豐年蟲(Eubranchipusvernalis)、黃粉蟲(Tenebriomolitor)、羽搖蚊幼蟲(Chironomusplumosus)等,但相比于配合飼料,天然餌料有不易保存、容易變質(zhì)、滋生細(xì)菌、造成水體環(huán)境污染等問題。給觀賞魚投喂?fàn)I養(yǎng)全面、存儲方便且安全性高的配合飼料是觀賞魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然趨勢[1]。由于觀賞魚的品種繁多,國內(nèi)研究觀賞魚的飼料針對性不強(qiáng),目前針對特定觀賞魚種類營養(yǎng)需要的研究也不夠深入。觀賞魚的培養(yǎng)更加重視體色和形態(tài),因此圍繞特定觀賞魚品種的營養(yǎng)配比研究要兼顧觀賞魚的體色要求和生長需要。
脂肪作為魚類必需的營養(yǎng)物質(zhì)之一,對魚類的生長繁殖起著至關(guān)重要的作用[2]。據(jù)報道,飼料脂肪水平的不同可影響虹鱒(Sparusaurata)對類胡蘿卜素的吸收利用,從而影響其體色[3-4]。付旭等[5]研究發(fā)現(xiàn),飼料脂肪水平對淡黑鑷麗魚(Labidochromiscaeruleus)的色素蓄積有顯著影響。然而飼料脂肪的添加水平并非越高越好,過度的添加可導(dǎo)致脂肪肝的發(fā)生和免疫力的下降[6]。類胡蘿卜素是決定魚類體色的主要物質(zhì)[7],但魚類自身并不能合成類胡蘿卜素,必須通過投喂含類胡蘿卜素的著色飼料達(dá)到增色效果,而類胡蘿卜素是通過脂質(zhì)代謝的途徑被魚體代謝和沉淀[8]。目前,觀賞魚增色飼料中最常用的增紅劑是蝦青素(astaxanthin,AST),然而蝦青素價格昂貴,在著色飼料投入中占比大,魚類對蝦青素的消化利用率卻較低,探索觀賞魚著色飼料中類胡蘿卜素與脂肪的適宜添加配比,在節(jié)約蝦青素用量的情況下達(dá)到理想著色效果是解決這一問題的關(guān)鍵。目前,有關(guān)血鸚鵡魚營養(yǎng)相關(guān)研究主要集中在著色添加劑投喂量[9]、抗氧化能力[10]、非特異性免疫[11]等方面,但不同脂肪水平與蝦青素的適宜配比研究鮮見報道,本研究通過添加不同水平的脂肪和定量的蝦青素飼喂血鸚鵡魚,以確定在不影響血鸚鵡魚正常的生長條件下,著色飼料中脂肪的最適添加量,為觀賞魚著色飼料研究提供科學(xué)依據(jù)以節(jié)約成本。
實驗對象為540尾平均體質(zhì)量為(28.84±4.84)g的血鸚鵡魚,取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所觀賞魚基地。將試驗魚適應(yīng)性馴養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為6組,每組3個重復(fù),每個重復(fù)30尾魚,放于規(guī)格為120 cm×60 cm×50 cm的玻璃魚缸中。實驗期間每日投喂2次(09∶00和16∶00),投飼率3%,飼養(yǎng)水溫(27±1)℃,每周換曝氣水3次,每次換水量為總體水量的1/3。養(yǎng)殖實驗周期60 d。
實驗飼料為自制配合飼料,以豆油為脂肪源,為排除飼料蛋白和能量的影響,飼料中添加了等量的魚粉、豆粕、面粉、菜籽粕和棉籽粕,用纖維素調(diào)節(jié)脂肪的梯度。6個組分別為:飼喂含4‰蝦青素的基礎(chǔ)飼料作為對照組(L1組),飼喂4‰蝦青素基礎(chǔ)飼料并添加3%、6%、9%、12%、15%豆油的試驗組(分別為L2、L3、L4、L5、L6組)。6個脂肪梯度組(L1、L2、L3、L4、L5、L6)飼料中脂肪的實測含量依次為2.93%、5.90%、8.89%、11.91%、14.94%、17.92%。添加劑的蝦青素購于德國巴斯夫,純度為10%。各組飼料原料粉碎機(jī)粉碎,并經(jīng)過80目標(biāo)準(zhǔn)分樣篩,混合均勻后,用小型顆粒機(jī)加工成直徑為2 mm的沉性顆粒飼料,晾干后密封,-20℃保存?zhèn)溆?。飼料配方組成見表1。
表1 實驗飼料組成與飼料營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Tab.1 Composition and nutrient level of the experimental daily diet(air-dry basis)
實驗開始前和結(jié)束后,魚禁食24 h,每個重復(fù)組取10尾魚共計180尾進(jìn)行體質(zhì)量、體長測定,用于測定增重率和特定生長率指標(biāo)。用1 mL注射器尾靜脈采血,靜止1 h后,用恒溫離心機(jī)(4℃,6 000 r·min-1)離心15 min,分離血清,將血清樣品-80℃保存,用于血清生化指標(biāo)的測定。解剖魚體,稱取肝臟用于測定肝體比。采血后的試驗魚,其中每個重復(fù)組隨機(jī)取5尾共計90尾血鸚鵡魚,分別取約0.05 g鱗片、皮膚和尾鰭提取類胡蘿卜素,鱗片和皮膚取自魚體中部側(cè)線部分。
1.4.1 生長性能的測定
式(1)、式(2)中,W0為試驗魚的初始體質(zhì)量;W1為試驗魚的終末體質(zhì)量;t為實驗天數(shù)。
1.4.2 血鸚鵡魚背部色度值的測定
采用國際發(fā)光照明委員會CIE規(guī)定的L*(luminance,亮度)、a*(redness,-a*表示偏綠色,+a*表示偏紅色)、b*(yellowness,-b*表示偏藍(lán)色,+b*表示偏黃色)值來代表魚體顏色的狀態(tài)[12]。使用CR-400型色彩色差計(柯尼卡-美能達(dá),日本)測定各組魚體背鰭下方及側(cè)線上方之間區(qū)域體色的L*、a*、b*值,并進(jìn)行統(tǒng)計分析,檢驗飼料脂肪水平對蝦青素吸收的影響,使用前用白板校準(zhǔn),并將魚體表面的水分擦干。實驗結(jié)束后,每缸隨機(jī)選取6尾魚,每組共18尾魚進(jìn)行測定,測定位置為魚身體背鰭下方及側(cè)線鱗上方之間的區(qū)域。
1.4.3 類胡蘿卜素含量的測定
類胡蘿卜素的提取和測定方法參考BOONYARATPALIN等[13]的方法,類胡蘿卜素含量的計算公式如下:
式(4)中,S為類胡蘿卜素含量(mg·kg-1);A為吸光度值;K為常數(shù)(10 000);V為提取液體積(mL),E為吸光系數(shù)(2 500);G為樣品質(zhì)量(g)。
1.4.4 血清指標(biāo)分析
近代以來,霍布斯在將計算與心智結(jié)合的過程中扮演了重要的角色,而萊布尼茨為霍布斯的“革命性”嘗試搭建了機(jī)械化平臺?;舨妓故堑谝粋€清晰地把思維的句法表述為“計算”的人,他認(rèn)為,思維就是以計算的形式,處理那些具有普遍性的詞,由此開始了通過數(shù)字的形式把握人類認(rèn)知的研究。萊布尼茨設(shè)計了一種推理機(jī)器,即“機(jī)器推理者”,用它模擬人類思維的過程。根據(jù)萊布尼茨的解釋,這種推理機(jī)器能夠獨立執(zhí)行認(rèn)知任務(wù),推理沒有必要假借他人之力。盡管這樣的認(rèn)知系統(tǒng)完全是機(jī)械的,跟現(xiàn)代電子計算機(jī)沒有可比性,但是它誕生的意義是非凡的,因為它被看作是體現(xiàn)經(jīng)典計算主義思想萌芽的最早成果。
血清生化指標(biāo)采用購自南京建成生物工程研究所的總膽固醇(T-CHO)測試盒、游離脂肪酸(NEFA)測試盒、總膽汁酸(TBA)測試盒、總蛋白(TP)定量測試盒進(jìn)行測定。
實驗數(shù)據(jù)用Excel 2019處理,均以“means±SD”表示,結(jié)果用Statistica 6.0進(jìn)行相關(guān)性檢驗,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)做顯著性檢驗,用最小顯著差異法(least significant difference,LSD)進(jìn)行組間多重比較,顯著差異水平設(shè)為P<0.05,并利用Origin 9.1作圖。
由表2可知,隨著飼料脂肪添加水平的升高,血鸚鵡魚的末體質(zhì)量、SGR、WGR均呈先升高后下降、在L6組再上升的趨勢。當(dāng)飼料脂肪水平為11.91%(L4組)時,血鸚鵡魚的末體質(zhì)量、SGR和WGR達(dá)到最大,分別為40.86 g、0.63%·d-1和5.22%,均顯著高于其他組(P<0.05)。HSI除L2組外,其他組均隨著飼料脂肪添加水平升高而升高,各組間均有顯著性差異(P<0.05)。
表2 飼料脂肪水平對生長性能的影響Tab.2 Influence of dietary lipid level on growth performance
由表3可知,飼料中脂肪水平對血鸚鵡魚中表示亮度值的L*值無顯著性影響(P>0.05),但對表示紅色值的a*值和表示黃色值的b*值有影響。隨著飼料脂肪水平升高,表示體表紅色值的a*值呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,L4組a*值最大,且顯著高于L1、L2、L3、L5和L6(P<0.05)。飼料脂肪添加水平對b*值的影響與a*值類似,整體呈先增大后減小的趨勢,L3組b*值最大,顯著高于L1、L2、L5和L6組(P<0.05),與L4組無顯著性差異(P>0.05)。
表3 飼料脂肪水平對體表L*、a*、b*值的影響Tab.3 Influence of dietary lipid levels on value of L*,a*,and b*in body surface
從圖1可知,飼料脂肪水平對血鸚鵡魚鱗片、皮膚和尾鰭中的類胡蘿卜素含量都有顯著性影響(P<0.05),隨著飼料脂肪水平的升高,鱗片、皮膚和尾鰭中的類胡蘿卜素含量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。其中,L5組鱗片中的類胡蘿卜素含量顯著高于L1、L2、L3、L4組(P<0.05),但和L6組無顯著性差異(P>0.05);皮膚組織中,L4組的類胡蘿卜素含量最高,且顯著高于L1、L2、L5和L6組(P<0.05),但與L3組無顯著性差異(P>0.05)。尾鰭中,L4組的類胡蘿卜素含量也最高,且顯著高于其他組(P<0.05)。
圖1 飼料脂肪水平對血鸚鵡魚鱗片、皮膚和尾鰭類胡蘿卜素含量的影響Fig.1 Influence of dietary lipid levels on cartenoid content in scale,skin and tail fin of Vieja synspila♀×Amphilophus citrinellus♂
由表4可知,總膽固醇(TCHO)和總蛋白(TP)含量隨著飼料脂肪添加量的增加呈先上升后下降的趨勢,L5組的TCHO含量最高,顯著高于其他各組(P<0.05),TCHO和TP含量均為試驗組(L2~L6)顯著高于對照組(L1)(P<0.05)。總膽汁酸(TBA)從L3組開始隨脂肪水平的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,L4組TBA含量達(dá)到最高值,且顯著高于其他組(P<0.05)。低密度蛋白膽固醇(LDL-C)的含量與飼料脂肪水平呈正相關(guān),L5組的LDL-C含量最高,且顯著高于L1至L4各組(P<0.05),但與L6無顯著差異(P>0.05)。不同組的游離脂肪酸(NEFA)的含量無明顯變化規(guī)律,但各試驗組(L2至L6)均顯著低于對照組(L1組)(P<0.05)。
表4 飼料脂肪水平對血鸚鵡魚各項血清生化指標(biāo)的影響Tab.4 Influences of dietary lipid levels on biochemical indices of serum of Vieja synspila♀×Amphilophus citrinellus
脂肪是維持魚體正常生長和發(fā)育的重要營養(yǎng)素之一,也是重要的能量來源。在飼料中提高脂肪的含量,可以有效的節(jié)約蛋白質(zhì),促進(jìn)魚體生長,還能降低飼料系數(shù)[14]。本實驗中,飼料脂肪水平為11.91%時(L4組),血鸚鵡魚的特定生長率和增重率均為最高,表明血鸚鵡魚生長性能最佳。研究發(fā)現(xiàn),飼料脂肪水平為6.88%時,胭脂魚(Myxocyprinusasiaticus)的SGR和WGR最高,推薦的最適脂肪水平為6.62%~7.02%;飼料脂肪水平為9.4%時,淡水黑鯛(Hephaestus fuliginosus)[15]的SGR最高,生長性能最好;飼料脂肪水平為10.68%時,點籃子魚(Siganus guttatus)幼魚[16]的SGR和WGR最高;參照SGR為指標(biāo),40 g左右規(guī)格的軍曹魚(Rachycentron canadum)的脂肪需求量為13.97%~14.16%,500 g左右規(guī)格的軍曹魚為13.18%~13.47%[17]。說明魚的不同種類、生長階段對脂肪的需求量也大為不同。本實驗中,在2.93%~11.91%的脂肪添加水平內(nèi),血鸚鵡魚的SGR和WGR隨著飼料脂肪水平的升高逐漸升高,且存在顯著差異,說明在一定飼料脂肪水平范圍內(nèi),血鸚鵡魚的生長性能隨飼料脂肪水平的升高而升高,這與 胭 脂魚[6]、瓦氏黃顙魚(Pelteobagrus vachelli)[18]和 異 育 銀 鯽(Carassiusauratus gibelio)[19]等的研究結(jié)果趨勢基本一致。肝臟是魚類脂肪代謝的主要場所和重要的營養(yǎng)儲存器官,肝體比可以反映養(yǎng)殖過程中魚類肝臟的生理狀態(tài)。但本實驗中,隨著飼料脂肪水平的升高,血鸚鵡魚HSI呈上升趨勢,推測過高的脂肪水平促使肝臟中的脂肪細(xì)胞數(shù)目增多、體積變大[20-21],使得肝臟中出現(xiàn)過量脂肪沉積,從而導(dǎo)致肝體比增加,肝組織受損,這與奧尼羅非魚(Oreochromis aureus×O.niloticus)幼魚[22]、白甲魚(Onychostoma sima)幼魚[14]和紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)幼魚[23]的研究結(jié)果相似。
蝦青素是水產(chǎn)動物主要的呈色物質(zhì)[7],a*和b*值的高低反映了魚體表紅色和黃色的量化程度。本實驗中,隨著飼料脂肪水平的升高,a*值、b*值和類胡蘿卜素含量呈現(xiàn)相一致的變化趨勢,這說明紅色和黃色值與血鸚鵡類胡蘿卜素含量呈正相關(guān)關(guān)系,適當(dāng)提高飼料脂肪水平,在一定范圍內(nèi)對血鸚鵡魚的體色增紅有明顯促進(jìn)作用。本實驗還發(fā)現(xiàn),皮膚的a*值和b*值的最高值分別出現(xiàn)在L4和L3組,之后出現(xiàn)下降,說明過高的脂肪含量無益于類胡蘿卜素的吸收,這與付旭等[5]對淡黑鑷麗魚(Labidochromiscaeruleus)和崔培等[24]對錦鯉(Cyprinuscarpio)的研究結(jié)果一致。
本實驗中,在等量蝦青素添加下,適當(dāng)增高飼料脂肪水平可明顯促進(jìn)血鸚鵡魚鱗片、皮膚和尾鰭的蝦青素沉積。孫向軍等[25]研究表明,不同飼料脂肪水平對錦鯉體色影響也有相似結(jié)果。BARBOSA等[26]報道在加入等量蝦青素的飼料中,脂肪水平較高的虹鱒血清中的蝦青素含量相應(yīng)較高,有更多的蝦青素沉積。崔培等[24]報道當(dāng)飼料脂肪的添加水平在5.60%~14.20%時,錦鯉皮膚中類胡蘿卜素也呈先升高后降低的趨勢。TORRISSEN和CHRISTIANSEN[27]研究表明,隨著虹鱒飼料中脂肪水平的升高,蝦青素的表觀消化率增加,也證明脂肪可以影響魚類對蝦青素的吸收和利用,從而影響魚類的體色。本實驗中,脂肪水平超過11.91%時,皮膚中的類胡蘿卜素含量顯著降低(P<0.05),說明當(dāng)飼料脂肪添加超過一定量,反而會影響類胡蘿卜素沉積。當(dāng)蝦青素含量為400 mg·kg-1,添加的飼料脂肪為11.91%時,血鸚鵡魚所能沉積的色素量達(dá)到峰值,超過吸收飽和量的類胡蘿卜素不能沉積于體內(nèi)。實驗結(jié)果可見,相比鱗片和皮膚部位,類胡蘿卜素在尾鰭中沉積量最大。張曉紅等[28]在對血鸚鵡體色的研究中發(fā)現(xiàn),當(dāng)蝦青素添加量在30~900 mg·kg-1時,尾鰭中類胡蘿卜素均高于皮膚,本實驗結(jié)果與其相似。
血液中的TP含量是反映魚體吸收和代謝蛋白質(zhì)的重要指標(biāo),TP具有維持血管內(nèi)滲透壓平衡、運(yùn)輸多種代謝物等多種功能,能夠反映魚體的健康狀 況[29]。吉 富 羅 非 魚(O.niloticus)[30]、鳡(Elopichthysbambusa)幼魚[31]等的研究結(jié)果表明,隨著飼料脂肪水平的升高,血清中的TP的含量呈下降趨勢,而本研究中血鸚鵡魚的TP含量呈先上升后下降的趨勢,但各試驗組魚的TP均高于低脂肪含量的L1對照組,當(dāng)飼料脂肪添加水平大于11.91%(L4組)時,血鸚鵡魚血液中的TP含量出現(xiàn)下降趨勢,這可能與蛋白質(zhì)利用率相關(guān),匙吻鱘(Polyodonspathula)的TP含量也表現(xiàn)為高脂組(11.64%)顯著高于低脂組(3.01%)[32],劉陽洋等[32]也認(rèn)為,在一定范圍內(nèi)提高脂肪添加水平可以促進(jìn)匙吻鱘對蛋白質(zhì)的吸收,但飼料脂肪水平過高則無益于提高飼料蛋白的利用率。
血清TCHO與魚類營養(yǎng)狀況密切關(guān)聯(lián),常用于反映生物對脂肪的代謝狀況[33],TCHO含量升高表明內(nèi)生脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)狀態(tài)活躍,是脂肪運(yùn)轉(zhuǎn)系統(tǒng)對高脂肪飼料的應(yīng)答[34]。本實驗結(jié)果顯示,血清TCHO與TP相似,呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢,低脂對照組(L1組)的TCHO含量顯著低于其他各高脂肪試驗組,這與褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)、額爾齊斯河銀鯽(Carassiusauratus gibelio)[35]、白甲魚幼魚[14]、大口黑鱸(Micropterus salmoides)[36]的研究結(jié)果基本一致,它們的最適脂肪添加量均在8%~11%。本實驗中,飼料脂肪添加水平小于14.94%(L5組)時,血鸚鵡魚血清中TCHO持續(xù)升高,推測可能是血鸚鵡魚吸收的脂肪經(jīng)肝臟合成并轉(zhuǎn)運(yùn)至血液中的膽固醇,致使其不斷升高,而當(dāng)飼料脂肪添加水平超過14.94%,TCHO含量開始下降,此結(jié)果可能是脂肪肝發(fā)生后肝細(xì)胞破損,肝功能受損,進(jìn)而合成并轉(zhuǎn)運(yùn)到血液中的膽固醇含量減少造成的[37]。但在奧尼羅非魚幼魚和鱤[31]幼魚中,其脂肪建議最適添加濃度是相對較低的6%和8%左右,TCHO含量隨飼料脂肪水平的升高呈下降趨勢。可能飼料脂肪水平對TCHO的影響在不同魚類、不同生長階段也不同。
低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)是反映脂類在動物體內(nèi)分解轉(zhuǎn)運(yùn)的重要反饋指標(biāo)[14,33],LDL-C將肝臟合成的內(nèi)源性CHL從肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到機(jī)體組織細(xì)胞,臨床認(rèn)為血清LDL-C的升高可能預(yù)示肝功能異?;蚱渌x問題[39],本研究中,隨著飼料脂肪添加水平的升高,各試驗組血清LDL-C為上升趨勢,這與軍曹魚[17]、褐菖鲉[38]、額爾齊斯河銀鯽[35]、匙吻鱘[32]等的研究結(jié)果基本一致。推測血鸚鵡魚將肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)到血液中的CHL降低,飼料脂肪水平對血鸚鵡魚的肝功能產(chǎn)生了一定影響。
膽汁酸(TBA)是肝臟細(xì)胞內(nèi)膽固醇的一種代謝產(chǎn)物,對脂肪的代謝有重要作用,其生成與代謝和肝臟關(guān)系密切,TBA水平是反映肝實質(zhì)損傷的一項重要指標(biāo)[40-41]。一般情況下血清中膽汁酸含量極低,當(dāng)肝細(xì)胞受到損害時,肝細(xì)胞對膽汁的攝取功能降低,直接影響膽汁酸及膽固醇的代謝,導(dǎo)致血清中膽汁酸含量升高[40]。隨著飼料脂肪含量的增加,血鸚鵡魚血清總膽汁酸從L3組開始顯著升高,到L5時又出現(xiàn)降低趨勢,L4組TBA含量達(dá)到最高值,但高脂肪試驗組的TBA含量均顯著高于低脂肪對照組(P<0.05),在鳡[31]、白甲魚[14]、額爾齊斯河銀鯽[35]等上也有類似的先升后降或持續(xù)上升但試驗組TBA值均高于對照組的結(jié)果,這說明飼料中過高的脂肪水平使血鸚鵡魚肝臟細(xì)胞組織發(fā)生了一定的生理病變。與此相應(yīng)的是,肝體比(HIS)也呈現(xiàn)持續(xù)升高的趨勢。
適量的飼料脂肪添加可提高血鸚鵡魚對蝦青素的吸收效率,增強(qiáng)其免疫力,并促進(jìn)其生長,過高的脂肪水平卻可引起肝損傷。在本實驗條件下,結(jié)合對蝦青素的利用率、血清生化指標(biāo)和生長性能,血鸚鵡魚著色飼料(4‰蝦青素)中適宜的脂肪水平為11.91%~14.94%。本研究可為血鸚鵡魚著色飼料配置提供參考。