張慧濤，王志方，侯新強(qiáng)

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院 微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830091)

新疆黑槌蟲(chóng)草生長(zhǎng)在新疆北疆阿爾泰山山區(qū)，分布于海拔1 250～2 000 m半陰半陽(yáng)坡，是全年均可采收的新疆特色蟲(chóng)草物種，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和腎臟保護(hù)性等生物活性[1]，但人工模擬新疆黑槌蟲(chóng)草天然生長(zhǎng)環(huán)境難度較大，難以獲得黑槌蟲(chóng)草。我所從天然新疆黑槌蟲(chóng)草菌核組織中分離培養(yǎng)出性狀優(yōu)良且穩(wěn)定的羽束梗孢菌株：CGMCC新槌12，并采用液體深層發(fā)酵方法生產(chǎn)新疆黑槌蟲(chóng)草羽束梗孢菌菌絲體，然后再將發(fā)酵液制成菌粉和發(fā)酵濾液。發(fā)酵生產(chǎn)的羽束梗孢菌菌粉主要成分與天然黑槌蟲(chóng)草基本相同，亦與青海產(chǎn)冬蟲(chóng)夏草相當(dāng)[2]。毒理和藥理研究表明，菌粉和發(fā)酵液安全無(wú)毒，濾清液與天然蟲(chóng)草的浸出液一樣，味苦而純正，適合口服。

黑槌蟲(chóng)草羽束梗孢菌發(fā)酵生產(chǎn)屬于菌種的純種培養(yǎng)過(guò)程,如果發(fā)酵過(guò)程中發(fā)現(xiàn)有其他微生物存在，就視為染菌。導(dǎo)致染菌的原因很多，均會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵失敗。黑槌蟲(chóng)草羽束梗孢菌發(fā)酵周期較長(zhǎng)，在每級(jí)種子罐要生產(chǎn)7 d以上，逐級(jí)轉(zhuǎn)到最終發(fā)酵罐后則要發(fā)酵2周左右，如此長(zhǎng)周期的發(fā)酵如果存在雜菌很容易造成發(fā)酵失敗。經(jīng)過(guò)多批次的發(fā)酵，我們總結(jié)了羽束梗孢菌的發(fā)酵控制技術(shù)，將黑槌蟲(chóng)草發(fā)酵成功率從最初不到50 %提高到目前的90 %以上。筆者從發(fā)酵的配套裝備和發(fā)酵過(guò)程控制方面分析黑槌蟲(chóng)草羽束梗孢菌的發(fā)酵控制。

1 發(fā)酵裝備的關(guān)鍵點(diǎn)和相關(guān)改進(jìn)

發(fā)酵罐在使用之前,需要認(rèn)真檢查,以消除設(shè)備隱患,還要重點(diǎn)注意以下幾個(gè)方面。

1.1 發(fā)酵罐機(jī)械密封

機(jī)械密封目前在發(fā)酵罐上得到廣泛應(yīng)用，利用機(jī)械密封動(dòng)靜環(huán)的旋轉(zhuǎn)摩擦密封取代了以前攪拌軸填料函密封形式。由于動(dòng)靜環(huán)的旋轉(zhuǎn)摩擦需要潤(rùn)滑，通常采用無(wú)菌水潤(rùn)滑動(dòng)靜環(huán)接觸旋轉(zhuǎn)部位，但是黑槌蟲(chóng)草羽束梗孢菌發(fā)酵周期較長(zhǎng)，在自然蒸發(fā)和發(fā)酵罐上攪拌電機(jī)散熱風(fēng)扇的風(fēng)力共同作用下，潤(rùn)滑的水容易蒸干，如果值班人員沒(méi)有注意，動(dòng)靜環(huán)旋轉(zhuǎn)摩擦?xí)r會(huì)發(fā)出異響和振動(dòng)，導(dǎo)致密封失效而發(fā)生泄露，很容易造成發(fā)酵染菌。為此，我們?cè)诎l(fā)酵罐的動(dòng)靜環(huán)接觸旋轉(zhuǎn)部位用甘油代替了無(wú)菌水，在發(fā)酵罐進(jìn)行實(shí)消時(shí)將固體甘油抹在動(dòng)靜環(huán)接觸旋轉(zhuǎn)部位邊上，利用發(fā)酵罐實(shí)消時(shí)的熱量將甘油融化，滲入動(dòng)靜環(huán)，等到發(fā)酵罐實(shí)消結(jié)束后仍然有油膜留在動(dòng)靜環(huán)接觸面上，從而實(shí)現(xiàn)良好潤(rùn)滑。

經(jīng)過(guò)黑槌蟲(chóng)草數(shù)批次的發(fā)酵，證明此方法簡(jiǎn)單可靠，降低了值班人員的操作失誤，提高了發(fā)酵成功率。

1.2 管道

管道的連接一般有焊接、螺紋連接和法蘭連接三種，在我所發(fā)酵中試車(chē)間，法蘭連接是發(fā)酵管道連接的主要方式。法蘭之間一般均采用石棉墊片，但是黑槌蟲(chóng)草的發(fā)酵產(chǎn)物由于可以作為食品或藥品使用，法蘭之間不能采用有毒的石棉墊片。因此凡是能夠與發(fā)酵液接觸的管道連接法蘭墊片都更換成了聚四氟乙烯墊片。這種材料無(wú)毒、耐高溫、耐腐蝕、有彈性、不吸水，除了價(jià)格高外十分適合發(fā)酵行業(yè)。但聚四氟乙烯墊片高溫時(shí)在法蘭緊固螺栓的作用下，會(huì)發(fā)生塑性變形，使法蘭緊固螺栓松動(dòng)，導(dǎo)致法蘭連接不緊密而泄露。因此在法蘭經(jīng)過(guò)高溫蒸汽之后，必須要重新緊固連接螺栓。

發(fā)酵罐內(nèi)一般設(shè)置有視鏡來(lái)觀察發(fā)酵液的情況，在罐內(nèi)也配有相應(yīng)沖洗透鏡的的蒸汽管道，蒸汽如果冷凝在管道中，就失去了滅菌能力，為消除黑槌蟲(chóng)草羽束梗孢菌的染菌隱患，應(yīng)去除這類(lèi)蒸汽管道。

1.3 空氣凈化系統(tǒng)

目前國(guó)內(nèi)的膜過(guò)濾技術(shù)比較成熟，用聚偏二氟乙烯(PVDF)制成的折疊微孔濾膜濾芯，過(guò)濾精度可達(dá)0.01μm，過(guò)濾效率高，高流速高通量，,疏水性強(qiáng)，可反復(fù)熱壓消毒，在工業(yè)領(lǐng)域大量使用，已經(jīng)替代了傳統(tǒng)的活性炭、棉花、超細(xì)玻璃纖維為過(guò)濾介質(zhì)的過(guò)濾器。

如果空氣過(guò)濾器的除菌質(zhì)量不好，將會(huì)使過(guò)濾后的空氣含有雜菌，如果雜菌數(shù)量很少，采用間斷取樣檢測(cè)不容易檢測(cè)出來(lái)，誤以為空氣質(zhì)量合格，容易造成發(fā)酵失敗。針對(duì)黑槌蟲(chóng)草發(fā)酵，采用了連續(xù)空氣檢測(cè)方法，在最后一級(jí)的過(guò)濾器后掛了一個(gè)空氣測(cè)樣瓶，瓶中是滅菌后不接種的LB細(xì)菌培養(yǎng)基，連續(xù)通入過(guò)濾后的空氣。只要觀察到培養(yǎng)基保持清澈，就說(shuō)明過(guò)濾器運(yùn)行正常。如果發(fā)酵罐發(fā)生染菌，我們也可以據(jù)此判斷染菌原因，采用正確的處理方式。在黑槌蟲(chóng)草羽束梗孢菌發(fā)酵中車(chē)間各級(jí)發(fā)酵罐的過(guò)濾器連續(xù)使用2個(gè)月，鏡檢空氣測(cè)樣瓶無(wú)菌。

在系統(tǒng)的總空氣過(guò)濾器前，應(yīng)設(shè)置前置空氣過(guò)濾器，對(duì)出自空壓機(jī)的空氣進(jìn)行脫油、脫水和部分除菌，以減輕總空氣過(guò)濾器的壓力。對(duì)于每一個(gè)發(fā)酵罐，應(yīng)配備獨(dú)立的可滅菌的空氣過(guò)濾器。

1.4 閥門(mén)

閥門(mén)在發(fā)酵設(shè)備中使用最多，采用的閥門(mén)也有各種型號(hào)，有條件的發(fā)酵車(chē)間使用專(zhuān)用的二通閥或隔膜閥[3]?？紤]到閥門(mén)使用成本和易于維護(hù)，在我所中試車(chē)間用的最多是截止閥，發(fā)酵閥門(mén)對(duì)密封的要求高，使用中開(kāi)閉比較頻繁，對(duì)內(nèi)部密封副的磨損較大，普通的密封結(jié)構(gòu)不適用發(fā)酵，因此針對(duì)發(fā)酵特點(diǎn)對(duì)內(nèi)部密封副進(jìn)行了改進(jìn)，將原截止閥的硬密封密封副改成了軟密封，密封關(guān)閉件用聚四氟乙烯墊片。由于聚四氟乙烯材料較軟，墊片可以自行加工，通過(guò)更換聚四氟乙烯墊片來(lái)保證閥門(mén)的密封。避免由于密封副泄露而整體更換閥門(mén)，即降低了發(fā)酵染菌風(fēng)險(xiǎn)也大幅降低了成本。

發(fā)酵閥門(mén)也要密切注意閥門(mén)外密封泄露，對(duì)于截止閥，從閥桿處發(fā)生的泄露是外密封泄漏。在發(fā)酵生產(chǎn)中，閥門(mén)的外密封泄漏比較隱蔽，閥門(mén)外密封檢查容易忽略，如果不加以注意，很容易造成發(fā)酵染菌。在黑槌蟲(chóng)草羽束梗孢菌發(fā)酵前對(duì)關(guān)鍵閥門(mén)逐個(gè)進(jìn)行密封性檢查，并用新型膨脹聚四氟乙烯密封填料替代了常規(guī)的石棉和膨脹石墨填料，該填料耐磨耐腐蝕，密封效果比常規(guī)的石棉和膨脹石墨填料要好。

2 發(fā)酵過(guò)程控制

2.1 滅菌時(shí)間的控制

發(fā)酵滅菌是利用高溫濕熱蒸汽進(jìn)行滅菌，利用高溫濕熱蒸汽的熱量使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的凝固變化，在很短的時(shí)間內(nèi)造成微生物的死亡。一般常溫微生物在60 ℃、10 min就可以死亡，而芽胞桿菌的芽孢能耐受較高溫度，100 ℃有時(shí)數(shù)小時(shí)才能殺死，因此一般衡量滅菌的徹底于否，是以能否殺滅芽胞桿菌為標(biāo)準(zhǔn)[4]。滅菌溫度越高，滅菌時(shí)間越長(zhǎng)，滅菌的效果越好，但是又不能任意提高滅菌溫度和延長(zhǎng)滅菌時(shí)間，否則培養(yǎng)基的有效成分遭到較大破壞[5](滅菌溫度和時(shí)間對(duì)養(yǎng)分破壞的比較見(jiàn)表1)，影響黑槌蟲(chóng)草羽束梗孢菌的生長(zhǎng)，得不到我們需要的合格菌絲體。

表1 滅菌溫度和時(shí)間對(duì)養(yǎng)分破壞的比較

由于黑槌蟲(chóng)草培養(yǎng)基中有豆類(lèi)粉末，不易滅菌，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)，我們確定黑槌蟲(chóng)草發(fā)酵的滅菌溫度控制在115 ℃，時(shí)間控制在40 min，即可以保證滅菌質(zhì)量，又不會(huì)損失過(guò)多的營(yíng)養(yǎng)成分。

2.2 發(fā)酵參數(shù)控制

黑槌蟲(chóng)草羽束梗孢菌發(fā)酵中控制的參數(shù)有溫度、罐壓、排氣流量、攪拌速度、pH、溶氧、泡沫等，由于羽束梗孢菌的生長(zhǎng)對(duì)氧氣需求不大，在現(xiàn)有的通氣條件下，溶氧基本保持不變，因此為避免增加染菌風(fēng)險(xiǎn)和保護(hù)電極，溶氧電極可以不用放置。羽束梗孢菌的生長(zhǎng)對(duì)溫度變化要求不高，發(fā)酵時(shí)溫度的控制方式用開(kāi)關(guān)控制即可。其他部分控制參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 部分發(fā)酵罐的控制參數(shù)

發(fā)酵液的pH在黑槌蟲(chóng)草發(fā)酵中用于監(jiān)測(cè)羽束梗孢菌的生長(zhǎng)是否正常，如果發(fā)酵液pH值在發(fā)酵中基本保持不變，說(shuō)明羽束梗孢菌生長(zhǎng)正常，如果發(fā)酵液pH值出現(xiàn)向上或向下的趨勢(shì)，則此次發(fā)酵極有可能染菌。對(duì)黑槌蟲(chóng)草的發(fā)酵而言，還可以通過(guò)發(fā)酵排氣的味道來(lái)判斷是否染菌和發(fā)酵情況，在正常情況下，排氣沒(méi)有任何異味，如果出現(xiàn)酸味等異味，則說(shuō)明已經(jīng)染菌，而在發(fā)酵后期，當(dāng)出現(xiàn)微微的苦味時(shí)，則意味羽束梗孢菌生長(zhǎng)到了末期，這時(shí)取樣，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液變成澄清透明的淡棕黃色，味苦無(wú)異味，鏡檢菌球直徑2～3 mm，大小均勻，發(fā)酵液殘?zhí)菣z測(cè)不超過(guò)0.5%，可終止發(fā)酵，菌絲體的得率可達(dá)2.5%。

發(fā)酵產(chǎn)生的泡沫一直是造成染菌的重要原因[6]，由于培養(yǎng)基中的豆類(lèi)成份和黑槌蟲(chóng)草羽束梗孢菌發(fā)酵過(guò)程中代謝產(chǎn)物均會(huì)產(chǎn)生泡沫，如果不能把泡沫壓制在罐中，一旦與外界空氣接觸，極易造成染菌導(dǎo)致發(fā)酵失敗，因此減少泡沫產(chǎn)生也是黑槌蟲(chóng)草羽束梗孢菌發(fā)酵的重點(diǎn)防控措施。黑槌蟲(chóng)草發(fā)酵產(chǎn)生泡沫主要在兩個(gè)階段，第一階段是在發(fā)酵液滅菌時(shí)，發(fā)酵液沸騰產(chǎn)生泡沫，滅菌時(shí)一定要控制泡沫不能沖出罐外造成逃液。由于黑槌蟲(chóng)草羽束梗孢菌的特殊性，培養(yǎng)基中不能加入工業(yè)消泡劑，而市場(chǎng)上的食品消泡劑又對(duì)羽束梗孢菌的品質(zhì)和生長(zhǎng)造成影響，黑槌蟲(chóng)草發(fā)酵采用食用豆油作為消泡劑，但是效果不如工業(yè)消泡劑，而且為了不影響羽束梗孢菌的生長(zhǎng)也不能多加，這就對(duì)滅菌操作提出較高要求。這時(shí)應(yīng)該對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)處理，提前在罐外對(duì)培養(yǎng)基煮沸，將培養(yǎng)基中的發(fā)泡物質(zhì)消耗一部分，再進(jìn)行罐內(nèi)發(fā)酵液滅菌時(shí)會(huì)顯著降低泡沫量。第二階段發(fā)酵液產(chǎn)生泡沫是在羽束梗孢菌發(fā)酵過(guò)程中，隨著培養(yǎng)基養(yǎng)分的消耗，羽束梗孢菌生長(zhǎng)導(dǎo)致自身代謝產(chǎn)物增加，發(fā)酵過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)泡沫。對(duì)于種子罐的泡沫一般采取調(diào)整發(fā)酵參數(shù)，例如降低攪拌速度，降低進(jìn)氣流量和適當(dāng)提高種子罐的罐壓力來(lái)解決，如果種子罐泡沫控制困難時(shí)，應(yīng)及時(shí)轉(zhuǎn)入下一級(jí)種子罐，這樣逐級(jí)放大，一直到最后一級(jí)的發(fā)酵罐，而在最后一級(jí)的發(fā)酵罐中，除了采用調(diào)整發(fā)酵參數(shù)來(lái)控制泡沫外，還可以通過(guò)無(wú)菌管道加入經(jīng)滅菌的食用豆油來(lái)控制泡沫。

2.3 接種、移種和取樣控制

黑槌蟲(chóng)草羽束梗孢菌的菌種接入采用火焰封閉接種口，然后快速導(dǎo)入菌種的方式，接種環(huán)節(jié)十分關(guān)鍵，接種過(guò)程中如果接種口火焰未能全部封閉接種口，或者火焰受到干擾，以及菌種沾在了接種口上，均增加了染菌的風(fēng)險(xiǎn)。因此在接種前提前用紫外燈對(duì)環(huán)境殺菌，接種時(shí)關(guān)閉門(mén)窗，用酒精擦拭接種口，檢查火焰接種環(huán)，打開(kāi)排氣閥排氣，罐內(nèi)殘余有微弱壓力是關(guān)閉排氣閥，注意關(guān)閉排氣閥的時(shí)間，過(guò)早關(guān)閉排氣閥會(huì)使罐內(nèi)殘余氣流過(guò)多，接種口打開(kāi)時(shí)氣流沖出會(huì)吹滅火焰，過(guò)晚關(guān)閉排氣閥會(huì)使罐內(nèi)壓力跌零增加染菌風(fēng)險(xiǎn)。接種口打開(kāi)后立即稍開(kāi)進(jìn)氣閥門(mén)，使發(fā)酵罐保持微弱正壓，接種時(shí)避免受到環(huán)境氣流干擾，快速倒入。

發(fā)酵生產(chǎn)是一個(gè)逐級(jí)放大的過(guò)程，當(dāng)種子罐中黑槌蟲(chóng)草羽束梗孢菌生長(zhǎng)到穩(wěn)定期，即可進(jìn)行移種操作。如果罐和罐之間有固定管道連接則相對(duì)容易，管道用150～200 kpa蒸汽滅菌30 min并保持正壓。如果發(fā)酵罐之間沒(méi)有設(shè)計(jì)管道連接，這時(shí)可以用硅膠管作為臨時(shí)的移種管道，移種硅膠管的管壁厚度應(yīng)在1 mm以上，各罐的附屬蒸汽管道粗細(xì)不同時(shí)，宜使用較粗蒸汽管道的蒸汽作為滅菌蒸汽，硅膠管內(nèi)部的流通蒸汽壓力保持150 kpa以上，滅菌時(shí)間30～40 min。

為了掌握羽束梗孢菌的生長(zhǎng)情況，確定移種時(shí)間，發(fā)酵過(guò)程中要適時(shí)取樣，但同時(shí)也增加了染菌風(fēng)險(xiǎn)，因此操作人員必須嚴(yán)格取樣操作。取樣管道滅菌時(shí)滅菌蒸汽必須連續(xù)流通，不容許出現(xiàn)死點(diǎn)。由于發(fā)酵生產(chǎn)中，有些閥門(mén)安裝時(shí)其標(biāo)注流向與發(fā)酵液流向是相反的，這時(shí)需在該閥門(mén)的底部加裝一個(gè)小的附加閥門(mén)使蒸汽流通。要加強(qiáng)對(duì)取樣閥的外密封結(jié)構(gòu)的檢查，防止發(fā)酵液從外密封結(jié)構(gòu)中泄漏，造成發(fā)酵染菌。

發(fā)酵滅菌時(shí)只有蒸汽流通才有滅菌的效果，對(duì)不流通的管道、閥門(mén)，必須采用上文方式改造使蒸汽流通。然后無(wú)菌空氣保持正壓，避免雜菌侵入。

總之，可能導(dǎo)致新疆黑槌蟲(chóng)草羽束梗孢菌發(fā)酵失敗的原因很多，主要有設(shè)備泄露、空氣帶菌、滅菌不透，操作不當(dāng)?shù)?，發(fā)酵后期的染菌將使前期的工作前功盡棄，給生產(chǎn)造成很大損失，這就要求我們?cè)诎l(fā)酵生產(chǎn)中，對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)的每一個(gè)環(huán)節(jié)嚴(yán)加控制，既要做好常規(guī)檢查，也要做好專(zhuān)項(xiàng)防控，杜絕發(fā)酵染菌的隱患。