高 倩，張曉虎，郭元園

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

0 引言

連翹為木犀科連翹屬植株，不僅具有清熱解毒、降火消腫、利尿、保護(hù)心血管、抗癌等藥理作用，而且具有抑菌抗炎、抗病毒、抗氧化等作用[1～4]。研究表明，連翹可作為雙黃連口服液、連花清瘟顆粒、維C銀翹片等藥劑的重要原料組成成分，也可應(yīng)用于醫(yī)療保健、食品保鮮、化妝品等領(lǐng)域[5]。連翹精油是一種具有特殊芳香氣味、分子量較小的有機(jī)代謝化合物，廣泛存在于連翹植株的花、葉和果實(shí)中，尤其在果實(shí)中的含量高達(dá)4%[6,7]，主要抑菌有效成分由單萜、倍半萜烯、丙酮、醛、酚、醇等組成。連翹精油呈棕黃色液體，在常溫下易揮發(fā)，具有顯著的抑菌、抗菌、抗氧化、抑制微生物生長繁殖、抗病毒等生物活性[8,9]。

番茄又稱為西紅柿，屬于茄科屬植物，其作為一種呼吸躍變果實(shí)，含有豐富的番茄紅素、維生素C、類胡蘿卜素等多種營養(yǎng)物質(zhì)，但是由于水分含量較高、果皮薄，因此其易受微生物的影響，抗病力弱、易軟腐，導(dǎo)致番茄不耐儲存，保鮮效果差，鎖水時間短[10]。

目前，食品安全問題受到廣泛關(guān)注，食品保鮮防腐劑的天然化已成為一種不可逆轉(zhuǎn)的發(fā)展趨勢，安全、天然、高效的食品才會備受青睞。復(fù)配型天然保鮮劑不僅高效、穩(wěn)定性好，而且高度安全、價格適中。研究表明不同性能的抗菌劑的適量配合制成的防腐劑具有增效和協(xié)同作用，可以克服單一防腐劑的不足[11,12]。根據(jù)殼聚糖[13～15]、ε-聚賴氨酸[16～18]和Nisin[19,20]的抑菌作用機(jī)理及作用于微生物的方式不同，將三者與連翹精油進(jìn)行復(fù)配，可達(dá)到增效協(xié)同的作用且有效擴(kuò)大抑菌譜，節(jié)約生產(chǎn)成本。

筆者以連翹精油為原料，輔以殼聚糖、ε-聚賴氨酸、Nisin制備復(fù)合保鮮涂膜液，采用響應(yīng)面法優(yōu)化配方，對番茄進(jìn)行保鮮實(shí)驗(yàn)研究，以期有效延長番茄的保鮮期，為連翹精油保鮮涂膜液在果蔬貯藏保鮮提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 連翹果實(shí)(2019年9月采于商州區(qū)金鳳山)；當(dāng)日產(chǎn)新鮮番茄(購于商州區(qū)菜市場)。

1.1.2 試劑 CO2(食品級，純度在 99%以上，購于成都市緣和基業(yè)化工有限責(zé)任公司)；95%乙醇(分析純)；蒸餾水；次氯酸；殼聚糖(食品級)；ε-聚賴氨酸(食品級)； Nisin(食品級)；冰乙酸(分析純)。

1.1.3 供試菌種 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌(商洛學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供)。

1.1.4 儀器設(shè)備 見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)主要儀器設(shè)備

1.2 方法

1.2.1 原料預(yù)處理 將連翹果實(shí)清洗干凈、放置通風(fēng)處干燥后，于60℃電熱恒溫干燥箱烘干，高速萬能粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，取若干份(每份10 g)，分裝后用紗布包裹，密封備用。

1.2.2 連翹精油的萃取 采用超臨界CO2流體萃取連翹果實(shí)中的精油[21]。

1.2.3 連翹精油的抑菌試驗(yàn) 將蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化鈉5 g，溶解于1 000 mL蒸餾水中，加入15%氫氧化鈉溶液大約2 mL，調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4。加入瓊脂20 g繼續(xù)加熱煮沸，待瓊脂融化后分裝試管中，每管2～3 mL，經(jīng)121℃高壓滅菌20 min。參考文獻(xiàn)制備菌懸液[22]，采用濾紙片法測連翹精油抑菌環(huán)直徑[23]。

1.2.4 涂膜液的制備 分別稱取適量的連翹精油、殼聚糖、ε-聚賴氨酸、Nisin溶于蒸餾水中配制不同濃度梯度的保鮮涂膜液，將番茄浸泡于保鮮液中處理3 min后取出，晾干；對照組放在蒸餾水中浸泡3 min，撈出晾干，分別置于一次性消毒保鮮盒中，在25℃、相對濕度65%的條件下貯藏10 d，每隔2 d取樣一次，測定番茄的失重率和維生素C含量，每組重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。

1.2.5 番茄的選擇與處理 選擇大小均一 、色澤及成熟程度一致、無機(jī)械損傷和害蟲侵染的番茄果實(shí)，用清水充分沖洗果實(shí)表面，用濃度為2%的次氯酸溶液進(jìn)行清洗消毒，最后用緩水流沖洗2 min，放置在通風(fēng)處晾干，分組備用。

1.2.6 單因素試驗(yàn)設(shè)計 分別配置連翹精油濃度(0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)、殼聚糖溶液濃度(0、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)、ε-聚賴氨酸濃度(0、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%)、Nisin濃度(0、0.01%、0.03%、0.05%、0.07%)的涂膜保鮮液，按照1.2.4中的方法處理番茄。

1.2.7 番茄新鮮度指標(biāo)測定 主要有:

(1)失重率采用稱重法計算[24]。

失重率(%) =(儲藏前的稱重-儲藏前后的重量)/儲藏前的重量×100%

(2)Vc含量采用2,4-二硝基苯肼比色法測定[25,26]。

1.2.8 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇3個影響顯著的因素，依據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計原理，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，以失重率和VC含量作為響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.06軟件進(jìn)行作圖和分析，確定保鮮涂膜液的最佳復(fù)合配方。

2 結(jié)果與分析

2.1 連翹精油抑菌實(shí)驗(yàn)

表2 不同濃度連翹精油抑菌效果

由表2可知，抑菌圈的直徑愈大，其抑菌效果愈好。連翹精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌活性，尤其對金黃色葡萄球菌抑菌效果更顯著，即對革蘭氏陽性菌的抑菌效果優(yōu)于革蘭氏陰性菌，并且抑菌效果均隨著連翹精油組分濃度的增加，抑菌活性亦增強(qiáng)。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由圖1～圖4可知，分別用不同濃度連翹精油、殼聚糖、ε-聚賴氨酸、Nisin處理番茄，隨著貯藏時間的增加，其失重率呈逐漸上升趨勢，維生素C含量呈緩慢下降趨勢，各處理組番茄的失重率均低于對照組，維生素C含量均高于對照組；0.5%濃度的連翹精油，隨著儲藏時間的延長對番茄失重率和維生素C含量變化的差異不太大；0.1%濃度的ε-聚賴氨酸，隨著儲藏時間的延長對番茄失重率和維生素C含量變化的差異不太大；1%、1.5%、2.5%濃度的殼聚糖，隨著儲藏時間的延長對番茄失重率和維生素C含量變化的差異不太大；0.01%濃度的Nisin，隨著儲藏時間的延長對番茄失重率和維生素C含量變化的差異不大。綜合考慮，最終固定殼聚糖濃度為2%，選取濃度連翹精油濃度1%～2%；ε-聚賴氨酸濃度0.3%～0.7%；Nisin濃度0.03%～0.07%。

圖1 不同濃度連翹精油對番茄失重率和維生素C含量的影響

圖2 不同濃度ε-聚賴氨酸對番茄失重率和維生素C含量的影響

圖3 不同濃度殼聚糖對番茄失重率和維生素C含量的影響

圖4 不同濃度Nisin對番茄失重率和維生素C的影響

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果 綜合考慮單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，固定殼聚糖的濃度為2%，以連翹精油濃度(A)、ε-聚賴氨酸濃度(B)和Nisin濃度(C)為自變量，以失重率和Vc含量作為響應(yīng)值(Y)。采用Design-Expert 8.06軟件，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面分析共17組實(shí)驗(yàn)，中心組合試驗(yàn)設(shè)計方案及其結(jié)果見表3。

表3 中心組合試驗(yàn)設(shè)計水平方案及結(jié)果

2.3.2 回歸分析 根據(jù)響應(yīng)面數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，擬合獲得失重率(Y1)和維生素C含量(Y2)的回歸方程如下：

Y1=0.75+0.04A-0.021B-0.094C+0.077AB-0.088AC+0.13BC+0.035A2+0.21B2+0.19C2

Y2=0.42+0.011A+0.021B-0.030C+1.750E-003AB+0.049AC-2.750E-003BC-0.088A2-0.016B2-0.071C2

依據(jù)響應(yīng)面數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，失重率(Y1)和維生素C含量(Y2)回歸模型的系數(shù)顯著性數(shù)據(jù)分析見表4、表5；回歸模型方差分析結(jié)果見表6、表7。

表4 失重率回歸模型的系數(shù)顯著性數(shù)據(jù)分析結(jié)果

表5 Vc含量回歸模型的系數(shù)顯著性數(shù)據(jù)分析結(jié)果

表6 失重率回歸模型方差分析結(jié)果

表7 Vc含量回歸模型方差分析結(jié)果

依據(jù)表4和表5可知，回歸方差分析表，此回歸模型p<0.01說明方差模型顯著，失擬項(xiàng)p=0.051 7和p=0.068 3>0.05，說明失擬項(xiàng)不顯著，此方程模擬的3因素3水平實(shí)驗(yàn)分析是可行的。由表6、表7可知，失重率回歸模型相關(guān)系數(shù)R12=0.994 3，維生素C含量回歸模型相關(guān)系數(shù)R22=0.999 8，說明該模型的擬合程度表現(xiàn)為良好，且實(shí)驗(yàn)的誤差較小，所以可用此模型來篩選出番茄保鮮效果最好的連翹精油天然復(fù)合保鮮涂膜液配方。

從表4可知，A(連翹精油)和B(ε-聚賴氨酸)的p<0.05，C(Nisin)的p<0.01，說明連翹精油和ε-聚賴氨酸對番茄貯藏期間失重率均是顯著，Nisin對番茄貯藏期間失重率是顯著；AC項(xiàng)、BC項(xiàng)對番茄失重率的影響為顯著(p<0.01)，二次項(xiàng)(B2、C2)對番茄的失重率影響為顯著。從表5可知，A(連翹精油)、B(ε-聚賴氨酸)和C(Nisin)的p<0.01，說明連翹精油、ε-聚賴氨酸和Nisin對番茄貯藏期間維生素C含量均是極顯著，二次項(xiàng)(A2、B2、C2)對番茄維生素C含量影響均為顯著，這表明各因素對響應(yīng)值(Y)的影響不是簡單的線性關(guān)系。

2.4 響應(yīng)面交互因素分析

2.4.1 ε-聚賴氨酸番茄貯藏期間各交互因素對失重率的影響 由圖5～圖7可知，等高線呈現(xiàn)出橢圓形狀，說明兩個因素之間存在顯著交互作用，且響應(yīng)面的曲面較陡峭，表明因素間交互作用影響顯著。響應(yīng)面圖5結(jié)果顯示B軸方向的坡度較A 軸較陡，表明ε-聚賴氨酸對番茄失重率的影響程度比連翹精油較大。響應(yīng)面圖6結(jié)果顯示C軸方向的坡度較A 軸較陡，表明Nisin對番茄失重率的影響程度比連翹精油較大。最終各因素極值濃度為：ε-聚賴氨酸在0.44%～0.66%左右；連翹精油在1.0%～1.83%左右；Nisin的極值濃度在0.43%～0.58%左右。

圖5 連翹精油與ε-聚賴氨酸交互作用對番茄失重率的等高線和響應(yīng)面

圖6 連翹精油與Nisin交互作用對番茄失重率的等高線和響應(yīng)面

圖7 ε-聚賴氨酸與Nisin交互作用對番茄失重率的等高線和響應(yīng)面

2.4.2 番茄貯藏期間各交互因素對維生素C含量的影響 由圖8～圖10可知，等高線呈現(xiàn)出橢圓形狀，說明兩個因素之間存在顯著交互作用，且響應(yīng)面的曲面較陡峭，表明因素間交互作用影響顯著。響應(yīng)面圖8結(jié)果顯示B軸方向的坡度較A 軸較緩，表明連翹精油對番茄貯藏期間維生素C含量的影響程度比ε-聚賴氨酸較大。響應(yīng)面圖9結(jié)果顯示A軸方向的坡度較C軸較陡，表明連翹精油對番茄貯藏期間維生素C含量的影響程度比Nisin較大。響應(yīng)面圖10結(jié)果顯示B軸方向的坡度比C軸較緩，表明Nisin對番茄貯藏期間維生素C含量的影響程度比ε-聚賴氨酸較大。最終各因素對番茄貯藏期間維生素C含量極值濃度范圍：ε-聚賴氨酸在0.48%～0.70%左右；連翹精油在1.41%～1.68%左右；Nisin的極值濃度在0.31%～0.62%左右。

圖8 連翹精油與ε-聚賴氨酸交互作用對番茄維生素C含量的等高線和響應(yīng)

圖9 連翹精油與Nisin交互作用對番茄維生素C含量的等高線和響應(yīng)面

圖10 ε-聚賴氨酸與Nisin交互作用對番茄維生素C含量的等高線和響應(yīng)

2.5 驗(yàn)證性結(jié)果分析

響應(yīng)面優(yōu)化得到的連翹精油涂膜液復(fù)合配方為：連翹精油1.46%、殼聚糖2.0%、ε-聚賴氨酸0.52%、Nisin0.05%，在此條件下，番茄儲藏期間失重率為0.7492%，維生素C含量為0.4189 mg/g。結(jié)合實(shí)際情況調(diào)整最優(yōu)復(fù)合涂膜液配方為：連翹精油1.50%、殼聚糖2.0%、ε-聚賴氨酸0.50%、Nisin0.05%，在該條件下，番茄儲藏期間失重率為0.75%，維生素C含量為0.42 mg/g。試驗(yàn)失重率較低，維生素C含量較高，與模型理論預(yù)測值相差甚小，表明能把該響應(yīng)面優(yōu)化配方應(yīng)用于番茄保鮮。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

(1)連翹精油對金黃色葡萄球菌抑菌效果比大腸桿菌更為顯著，且抑菌效果均隨著其組分濃度的增加，抑菌活性呈現(xiàn)上升趨勢。

(2)單因素實(shí)驗(yàn)中對番茄儲藏期間的失重率、維生素C含量變化的趨勢分析表明：對番茄影響最重要的三個因素為連翹精油、ε-聚賴氨酸和Nisin。

(3)響應(yīng)面配方優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得出復(fù)合涂膜保鮮液的最佳配比為：連翹精油1.50%、殼聚糖2.0%、ε-聚賴氨酸0.50%、Nisin0.05%；在25℃、相對濕度65%的條件下，番茄儲藏10 d，失重率為0.75%，維生素C含量為0.42 mg/g。

3.2 討論

(1)研究采用超臨界流體CO2技術(shù)提取的連翹精油，其提取率與何勇[21]優(yōu)化連翹精油提取實(shí)驗(yàn)得出數(shù)據(jù)相吻合。

(2)研究制備的復(fù)配型生物涂膜保鮮液在果蔬的應(yīng)用上更加安全穩(wěn)定，一定程度上彌補(bǔ)了使用單一防腐劑抑菌保鮮效果的缺陷。

(3)筆者研究不足之處是連翹精油具有一定的揮發(fā)性，長期貯藏未密封包裝的食品，保鮮效果會下降，建議與低溫貯藏相結(jié)合效果較佳。

(4)研究未對復(fù)合保鮮膜的機(jī)理進(jìn)行探討，也未對保鮮涂膜的性能進(jìn)行測評。在以后研究中，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行相關(guān)研究，以期為連翹精油-ε-pL-Nisin復(fù)合涂膜保鮮液實(shí)際應(yīng)用于食品防腐保鮮提供技術(shù)支持。