亓文霞，王勝蘭，楊 桁，高 科，王云騰，孫鈺迪，趙 峰，張加余，張 靜

·藥劑與工藝·

基于乳腺癌化療-光動(dòng)力聯(lián)合治療的負(fù)載紫杉醇白蛋白納米給藥系統(tǒng)的制備及其體外評(píng)價(jià)

亓文霞，王勝蘭，楊 桁，高 科，王云騰，孫鈺迪，趙 峰，張加余，張 靜*

濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 國(guó)家中醫(yī)藥管理局方劑效應(yīng)與臨床評(píng)價(jià)重點(diǎn)研究室，山東 煙臺(tái) 264003

以光敏劑二氫卟吩e6（chlorin e6，Ce6）修飾人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）為載體，負(fù)載抗腫瘤藥物紫杉醇（paclitaxel，PTX）后構(gòu)建納米給藥系統(tǒng)PTX@HSA-Ce6，以實(shí)現(xiàn)腫瘤“化療-光動(dòng)力”聯(lián)合治療，改善乳腺癌治療效果。共價(jià)結(jié)合法制備HSA-Ce6，紅外光譜、紫外-可見吸收光譜和熒光光譜進(jìn)行表征；自組裝法制備載藥納米粒PTX@HSA-Ce6，對(duì)其粒徑分布、表面ζ電位、形貌及穩(wěn)定性進(jìn)行表征，研究其藥物負(fù)載和釋放行為；利用乳腺癌MCF-7細(xì)胞模型考察PTX@HSA-Ce6的活性氧產(chǎn)生、細(xì)胞攝取及體外抗腫瘤效果。當(dāng)HSA與Ce6投料比為1∶10時(shí)，制備得到的PTX@HSA-Ce6呈規(guī)整的球形，平均粒徑為（147.4±0.9）nm，ζ電位為（?15.2±0.6）mV，具有良好的穩(wěn)定性。PTX@HSA-Ce6可有效負(fù)載紫杉醇，具有pH敏感性藥物緩釋效果。PTX@HSA-Ce6可被MCF-7細(xì)胞快速、持續(xù)攝取，激光照射下可在胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧，與紫杉醇發(fā)揮聯(lián)合抗腫瘤作用。PTX@HSA-Ce6可實(shí)現(xiàn)對(duì)Ce6和紫杉醇的共載和胞內(nèi)遞送，發(fā)揮化療-光動(dòng)力治療聯(lián)合抗腫瘤作用，有利于改善乳腺癌的治療效果。

紫杉醇；二氫卟吩e6；人血清白蛋白；納米給藥系統(tǒng)；化療；光動(dòng)力治療；乳腺癌；共價(jià)結(jié)合法；自組裝法

乳腺癌已超越肺癌，成為世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率位列全球女性惡性腫瘤首位，在我國(guó)女性惡性腫瘤發(fā)病率中也位列首位[1-2]?；熓侨橄侔┡R床治療中的主要藥物治療手段，但化療藥物往往存在溶解性差、非特異性分布導(dǎo)致全身不良反應(yīng)等缺陷，治療效果不理想[3]。紫杉醇（paclitaxel，PTX）是從紅豆杉中提取的一種二萜類天然次生代謝產(chǎn)物，可通過促進(jìn)微管聚合和抑制解聚來保持微管蛋白穩(wěn)定，從而抑制腫瘤細(xì)胞的有絲分裂并促進(jìn)凋亡，廣泛用于乳腺癌、卵巢癌、肺癌和胰腺癌等惡性腫瘤的治療[4]。然而，紫杉醇存在水溶性差、非特異性體內(nèi)分布、易產(chǎn)生耐藥等缺陷，作為單一治療手段往往效果不佳，且毒副作用大，限制了其臨床應(yīng)用。目前，大量納米給藥系統(tǒng)被開發(fā)并應(yīng)用于紫杉醇的遞送中，不僅可以改善紫杉醇的溶解度，提高其靶向性和生物利用度，而且為紫杉醇與其他治療手段的聯(lián)合應(yīng)用提供了契機(jī)，在乳腺癌治療中有望發(fā)揮重要作用[5-7]。

研究證實(shí)，聯(lián)合治療可顯著提高單一化療藥物的治療效果。將化療與光動(dòng)力治療相結(jié)合的腫瘤診療一體化技術(shù)，是一種極有潛力的腫瘤聯(lián)合治療策略[8]。光動(dòng)力治療是腫瘤輔助治療的重要手段，利用光敏劑在特定波長(zhǎng)激光照射下產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），通過激活細(xì)胞凋亡的死亡受體途徑和線粒體途徑、參與自噬性細(xì)胞死亡等方式發(fā)揮抗腫瘤作用，具有侵襲性小、靶向性好、成本低等優(yōu)點(diǎn)[9]。然而，光動(dòng)力治療受到腫瘤缺氧微環(huán)境中氧含量不足的制約，且隨著治療的進(jìn)行會(huì)造成腫瘤缺氧加劇，因此作為單一治療手段不僅難以根除腫瘤，還可能增加腫瘤細(xì)胞的抗性[10]。研究表明，利用納米給藥系統(tǒng)對(duì)光敏劑和化療藥物進(jìn)行共傳遞，有望發(fā)揮光動(dòng)力治療與化療的聯(lián)合抗腫瘤作用，從而彌補(bǔ)單一治療方式的應(yīng)用缺陷，還可以通過生物成像來輔助治療，在腫瘤治療領(lǐng)域展示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[11]。

人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）具有生物相容性好、免疫原性低、化學(xué)穩(wěn)定性高、半衰期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的天然大分子載體材料[12-13]。本研究以HSA為載體材料，與光敏劑二氫卟吩e6（chlorin e6，Ce6）共價(jià)結(jié)合后，通過自組裝法負(fù)載紫杉醇，構(gòu)建共載Ce6和紫杉醇的納米給藥系統(tǒng)PTX@HSA-Ce6，以期同時(shí)實(shí)現(xiàn)乳腺癌的化療-光動(dòng)力聯(lián)合治療，改善乳腺癌的治療效果，如圖1所示。

圖1 PTX@HSA-Ce6的制備與“化療-光動(dòng)力治療”聯(lián)合抗腫瘤作用示意圖

1 儀器與材料

1.1 儀器

Nano ZS90納米激光粒度分析儀，英國(guó)Malvern公司；JEM-1400透射電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社；高效液相色譜，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；TGA/DSC 3+熱重及同步熱分析儀，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；F-7000熒光分光光度計(jì)，日本日立公司；PerkinElmer Frontier傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)PerkinElmer公司；Alpha 1-2 LD plus真空冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Christ公司；Leica TCS SPE激光掃描共聚焦顯微鏡，德國(guó)Leica公司；Tecan Infinite Pro全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；BD FACS Canto II流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司；Bugbox M微需氧培養(yǎng)箱，英國(guó)Ruskinn公司；660 nm光纖耦合激光器，長(zhǎng)春鐳仕光電科技有限公司。

1.2 試劑

HSA（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞96%，批號(hào)SLCH5923），美國(guó)Sigma-Aldrich公司；紫杉醇（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%，批號(hào)J2028191）、1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽［1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC］和-羥基琥珀酰亞胺（-hydroxysuccinimide，NHS），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Ce6（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞90%，批號(hào)N1127A）和單線態(tài)氧綠色熒光探針（singlet oxygen sensor green，SOSG），大連美侖生物技術(shù)有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），美國(guó)Gibco公司；Hoechst 33342和胰蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司；Dulbecco’s modified eagle medium（DMEM）培養(yǎng)基，美國(guó)Hyclone公司；2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）ROS檢測(cè)試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；乙腈，色譜純，天津福晨化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

1.3 細(xì)胞

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

2 方法

2.1 HSA-Ce6的合成與表征

2.1.1 HSA-Ce6的合成 參照文獻(xiàn)方法[14-15]，稱取20 mg HSA溶于9 mL pH 8.0的PBS（0.1 mol/L，NaCl 0.05 mol/L）中。稱取一定量Ce6（HSA與Ce6物質(zhì)的量比分別為1∶5、1∶10、1∶20）溶于1 mL DMSO中，加入NHS和EDC（Ce6、NHS、EDC的物質(zhì)的量比為1∶4.5∶4.5），室溫下避光攪拌活化24 h。將活化后的Ce6溶液滴加入HSA溶液中，攪拌反應(yīng)24 h，于去離子水中透析（截留相對(duì)分子質(zhì)量14 000）48 h。將透析液5000 r/min離心10 min（離心半徑12.3 cm），取上清液冷凍干燥，分別制備得到不同比例載體材料HSA-Ce6（1∶5）、HSA-Ce6（1∶10）和HSA-Ce6（1∶20）。

2.1.2 HSA-Ce6的表征 利用傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）對(duì)HSA-Ce6的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，利用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)其熒光光譜。利用紫外分光光度法測(cè)定HSA-Ce6溶液中Ce6的質(zhì)量濃度，利用BCA法測(cè)定其中HSA的質(zhì)量濃度，根據(jù)以下公式計(jì)算Ce6的偶聯(lián)度（）[16]。

＝Ce6/HSA

Ce6為溶液中Ce6的質(zhì)量，HSA為溶液中HSA的質(zhì)量

（1）HSA-Ce6的FT-IR表征：HSA、Ce6和HSA-Ce6的FT-IR譜圖如圖2所示。HSA的FT-IR光譜給出了蛋白質(zhì)類的共有吸收峰，包括3289、1658、1546 cm?1處酰胺結(jié)構(gòu)的特征吸收，2960、2915 cm?1處甲基的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰；Ce6的FT-IR光譜顯示甲基（2964 cm?1）和羧基中C＝O（1711 cm?1）的特征吸收，以及烯氫的彎曲振動(dòng)峰（955、895 cm?1）[17]。不同投料比的HSA-Ce6樣品的FT-IR光譜均給出蛋白質(zhì)的特征吸收，且1711 cm?1處羰基吸收大大減弱，HSA-Ce6（1∶5）在951、860 cm?1處，HSA-Ce6（1∶10）在944、859 cm?1處，HSA-Ce6（1∶20）在945、858 cm?1處均出現(xiàn)烯氫的彎曲振動(dòng)峰，證實(shí)Ce6與HSA成功偶聯(lián)。

（2）HSA-Ce6的紫外-可見光譜與熒光光譜表征：HSA-Ce6的紫外-可見光譜與熒光光譜如圖3所示。由圖3-A可見，HSA在280 nm處有最大吸收波長(zhǎng)，Ce6在404、660 nm處出現(xiàn)特征吸收峰。HSA-Ce6（1∶5）、HSA-Ce6（1∶10）和HSA-Ce6（1∶20）的譜圖中均可明顯看到Ce6和HSA的特征峰，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[18]。隨著Ce6投料量的增加，引入HSA主鏈中的Ce6數(shù)目進(jìn)一步增加，利用紫外分光光度法測(cè)得HSA-Ce6（1∶5）、HSA-Ce6（1∶10）和HSA-Ce6（1∶20）中Ce6的偶聯(lián)度分別為34.6、59.3、72.7 μg/mg。由圖3-B可見，HSA-Ce6和Ce6在660 nm處均有明顯的熒光發(fā)射峰，表明HSA與Ce6的偶聯(lián)不會(huì)改變Ce6的光吸收特性。HSA-Ce6的熒光強(qiáng)度隨Ce6投料量的增加而降低，這可能是由于二者偶聯(lián)使Ce6分子間的重疊增加，間距變小，同時(shí)局部濃度增加導(dǎo)致Ce6熒光淬滅[19]。

圖2 HSA (A)、Ce6 (B)、HSA-Ce6 (1∶5, C)、HSA-Ce6 (1∶10, D)、HSA-Ce6 (1∶20, E)的FT-IR圖

圖3 HSA-Ce6的紫外-可見吸收光譜(A) 及熒光光譜(B)

2.2 載藥納米粒PTX@HSA-Ce6的制備與表征

2.2.1 PTX@HSA-Ce6的制備 利用紫杉醇與HSA疏水結(jié)構(gòu)域之間的疏水相互作用誘導(dǎo)HSA-Ce6自組裝形成載藥納米粒PTX@HSA-Ce6[20]。稱取10 mg HSA-Ce6（1∶5、1∶10、1∶20）溶于10 mL pH 8.0的PBS（0.1 mol/L，NaCl 0.05 mol/L）中，稱取2 mg紫杉醇溶于1 mL無水乙醇中。邊攪拌邊將紫杉醇的無水乙醇溶液滴加至HSA-Ce6溶液中，反應(yīng)液于去離子水中透析（截留相對(duì)分子質(zhì)量14 000）48 h，將透析液5000 r/min離心（離心半徑12.3 cm）10 min，上清液即為PTX@HSA-Ce6懸液。

2.2.2 PTX@HSA-Ce6的表征 利用納米激光粒度儀測(cè)定PTX@HSA-Ce6的粒徑分布、表面ζ電位及多分散系數(shù)（polydispersity index，PDI），利用透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察其形貌。分別取紫杉醇、HSA-Ce6、PTX@HSA-Ce6以及紫杉醇與HSA-Ce6的混合物，在25～300 ℃進(jìn)行差示熱量掃描（differential scanning calorimetry，DSC）分析[21]。將PTX@HSA-Ce6分別于37 ℃、含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基和4 ℃、pH 7.4 PBS中孵育7 d，檢測(cè)其粒徑分布與表面ζ電位變化情況，考察其體內(nèi)穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

2.2.3 PTX@HSA-Ce6的包封率與載藥量測(cè)定 取1 mL PTX@HSA-Ce6懸液，加入9 mL乙腈，超聲提取納米粒中的紫杉醇，12 000 r/min離心（離心半徑12.3 cm）10 min，取上清液進(jìn)樣HPLC進(jìn)行紫杉醇含量測(cè)定[22]。根據(jù)以下公式計(jì)算PTX@HSA-Ce6的包封率和載藥量。

包封率＝NPs/紫杉醇

載藥量＝NPs/總

NPs為PTX@HSA-Ce6中紫杉醇的質(zhì)量，紫杉醇為紫杉醇的投藥量，總為1 mL PTX@ HSA-Ce6懸液冷凍干燥后的總質(zhì)量

載藥納米粒PTX@HSA-Ce6的粒徑分布、多分散系數(shù)（polydispersity index，PDI）、表面ζ電位、包封率和載藥量檢測(cè)結(jié)果如表1和圖4所示。隨著Ce6投料量的增加，PTX@HSA-Ce6的平均粒徑從（138.6±3.9）nm增加至（169.5±7.9）nm，均小于200 nm，有利于借助實(shí)體瘤的高通透性和滯留（enhanced permeability and retention，EPR）效應(yīng)富集于腫瘤組織周圍[23]。PTX@HSA-Ce6的包封率和載藥量隨Ce6的投料量的增加而增加，這可能與Ce6偶聯(lián)度增加導(dǎo)致HSA疏水性增強(qiáng)有關(guān)。由于體系pH值高于HSA等電點(diǎn)，因此PTX@HSA-Ce6表面為負(fù)電性，有利于減少網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的非選擇性清除，且ζ電位絕對(duì)值隨Ce6投料量的增加而增大，這可能與HSA表面氨基被Ce6取代有關(guān)。研究表明，Ce6易因誘導(dǎo)聚集而導(dǎo)致熒光猝滅，制劑中紫杉醇含量增加可能促進(jìn)Ce6聚集，影響光動(dòng)力治療效果[19]。因此，為保證PTX@HSA-Ce6能夠發(fā)揮化療-光動(dòng)力聯(lián)合治療作用，結(jié)合熒光光譜檢測(cè)結(jié)果，選擇HSA-Ce6（1∶10）用于后續(xù)載藥納米粒的制備和實(shí)驗(yàn)研究。

表1 PTX@HSA-Ce6的表征

Table 1 Characterization of PTX@HSA-Ce6

投料比（HSA∶Ce6）平均粒徑/nmPDIζ電位/mV包封率/%載藥量/% 1∶5138.6±3.90.206±0.030?13.9±0.736.77.8 1∶10147.4±0.90.229±0.040?15.2±0.646.49.5 1∶20169.5±7.90.258±0.030?19.1±1.153.810.2

圖4 PTX@HSA-Ce6的粒徑分布(A) 和ζ電位(B)

TEM觀察PTX@HSA-Ce6的形貌如圖5-A所示。PTX@HSA-Ce6呈規(guī)整的球形，粒徑為100～150 nm。HSA-Ce6和PTX@HSA-Ce6在水中均顯示出良好的溶解性和分散性，而游離Ce6幾乎不溶，表明HSA與Ce6偶聯(lián)后顯著改善了Ce6的溶解性（圖5-B）。在不同條件下保存7 d，PTX@HSA-Ce6的粒徑以及ζ電位略有改變，但波動(dòng)范圍較?。≒BS中粒徑為142.8～178.9 nm，ζ電位為?14.1～?19.2 mV；含10% FBS的DMEM中粒徑為138.4～192.0 nm，ζ電位為?13.4～?18.1 mV），證實(shí)其具有較好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性和體內(nèi)穩(wěn)定性（圖5-C、D）。由圖5-E可見，HSA-Ce6與紫杉醇物理混合后在220、237 ℃處出現(xiàn)紫杉醇的熔融吸收峰和分解放熱峰，表明紫杉醇為結(jié)晶狀態(tài)，而PTX@HSA-Ce6的DSC曲線與HSA-Ce6相似，未出現(xiàn)熔融吸收峰和分解放熱峰，表明紫杉醇成功負(fù)載于PTX@HSA-Ce6中[24]。

2.3 PTX@HSA-Ce6的體外藥物釋放研究

分別配制含0.2%聚山梨酯80的不同pH的PBS緩沖液作為釋放介質(zhì)，考察PTX@HSA-Ce6的體外藥物釋放情況[25]。取3 mL PTX@HSA-Ce6懸液置于透析袋（截留相對(duì)分子質(zhì)量14 000）中，轉(zhuǎn)移至含30 mL不同釋放介質(zhì)的棕色瓶中，37 ℃恒溫振蕩，分別于0.5、1、2、4、8、12、24、48、72 h移出3 mL釋放介質(zhì)，并補(bǔ)加等體積空白釋放介質(zhì)。利用HPLC測(cè)定移出的釋放介質(zhì)中紫杉醇含量，根據(jù)以下公式計(jì)算PTX@HSA-Ce6的累積藥物釋放率（），繪制藥物釋放曲線。

0為PTX@HSA-Ce6中紫杉醇的總量，為釋放介質(zhì)的總體積，為取樣次數(shù)，V為時(shí)移出釋放介質(zhì)的體積，C為時(shí)釋放介質(zhì)中紫杉醇的質(zhì)量濃度

分別模擬正常生理環(huán)境（pH 7.4）、腫瘤細(xì)胞外環(huán)境（pH 6.5）和腫瘤細(xì)胞內(nèi)溶酶體環(huán)境（pH 5.0）考察PTX@HSA-Ce6的體外藥物釋放情況。如圖6所示，PTX@HSA-Ce6在不同pH條件下均為8 h內(nèi)釋放速率較快，而后趨于平緩。PTX@HSA-Ce6的釋藥量隨體系pH的降低而增加，72 h時(shí)pH 5.0條件下的累積釋放率（56.2%）顯著高于pH 7.4（33.6%）和pH 6.5（46.7%）下的累積釋放率，這可能與酸性條件下HSA質(zhì)子化導(dǎo)致紫杉醇與HSA-Ce6間的靜電和疏水相互作用減弱有關(guān)[26]。這一釋放行為將有利于提高PTX@HSA-Ce6在遞送過程中的穩(wěn)定性，加快PTX@HSA-Ce6被腫瘤細(xì)胞攝取后的藥物釋放，有利于提高紫杉醇的治療效果。

圖6 PTX@HSA-Ce6的體外藥物釋放曲線

2.4 PTX@HSA-Ce6的光化學(xué)性質(zhì)研究

利用SOSG探針考察PTX@HSA-Ce6在660 nm激光照射下的ROS生成情況[27]。向PTX@HSA-Ce6懸液中加入SOSG溶液（終濃度為1 μmol/L），660 nm激光照射后利用全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（Ex＝489 nm，Em＝528 nm）測(cè)定各樣品的熒光強(qiáng)度，考察不同激光照射時(shí)間、照射強(qiáng)度下ROS的產(chǎn)生情況。利用SOSG探針檢測(cè)PTX@HSA-Ce6的ROS生成情況，結(jié)果如表2所示?？梢?，ROS的產(chǎn)量隨著PTX@HSA-Ce6中Ce6濃度的提高而增加，具有一定的濃度相關(guān)性。隨著照射時(shí)間和照射強(qiáng)度的增加，體系中的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，該結(jié)果表明PTX@ HSA-Ce6生成ROS具有一定的照射時(shí)間和強(qiáng)度相關(guān)性[27-28]。在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的參數(shù)范圍內(nèi)，50 mW/cm2照射4 min時(shí)PTX@HSA-Ce6產(chǎn)生的ROS量最高，因此選擇該照射條件進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.5 溶血實(shí)驗(yàn)

利用紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)考察PTX@HSA-Ce6的體外血液相容性，初步評(píng)價(jià)其用于靜脈給藥的安全性。參照文獻(xiàn)方法[29]，取新鮮兔血用生理鹽水處理后配成2%的紅細(xì)胞懸液。分別取不同濃度的HSA-Ce6溶液或PTX@HSA-Ce6懸液與紅細(xì)胞懸液等體積混合，以蒸餾水為陽性對(duì)照，生理鹽水為陰性對(duì)照，37 ℃孵育2 h。2500 r/min離心（離心半徑15.7 cm）10 min，取上清液于545 nm處測(cè)定其吸光度（）值，根據(jù)以下公式計(jì)算溶血率。

表2 660 nm光照下PTX@HSA-Ce6的ROS產(chǎn)生

Table 2 ROS generation of PTX@HSA-Ce6 under 660 nm light irradiation

Ce6質(zhì)量濃度/(μg?mL?1)照射時(shí)間/min功率密度/(mW?cm?2)平均熒光強(qiáng)度 0.0084501 932.3±537.0 0.0804505 990.7±249.3 0.80045029 025.0±845.2 0.80015015 641.0±3 393.7 0.80025023 237.0±2 477.8 0.8004513 391.3±317.1 0.80042024 215.3±805.3

溶血率＝(樣品－nc)/(pc－nc)

樣品為樣品組值，nc為陰性對(duì)照值，pc為陽性對(duì)照值

通過體外紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)考察載體材料HSA-Ce6和PTX@HSA-Ce6的溶血率，結(jié)果如圖7所示。在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，HSA-Ce6和PTX@HSA-Ce6的溶血率隨質(zhì)量濃度增加略有上升，但均低于5%，表明其用于靜脈給藥具有良好的生物安全性。

圖7 HSA-Ce6和PTX@HSA-Ce6的溶血率

2.6 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)

將MCF-7細(xì)胞以2×104個(gè)/皿接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中，分別置于20% O2常氧培養(yǎng)箱或2% O2微需氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將各皿中培養(yǎng)液更換為不同濃度的PTX@HSA-Ce6懸液，原培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育4 h。棄去皿中溶液，PBS漂洗后加入1 mL DCFH-DA溶液（終濃度為10 μmol/L），繼續(xù)孵育30 min。660 nm、50 mW/cm2激光照射4 min后，PBS漂洗，置于激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）下觀察，考察細(xì)胞內(nèi)ROS生成情況。

細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生是決定光動(dòng)力治療效果的重要指標(biāo)，PTX@HSA-Ce6在660 nm激光照射下的胞內(nèi)ROS產(chǎn)生情況如圖8所示。未經(jīng)任何處理組Control（L?）和僅經(jīng)激光照射組Control（L+）細(xì)胞內(nèi)均未觀察到熒光產(chǎn)生，未經(jīng)激光照射的PTX@ HSA-Ce6暗處理組PTX@HSA-Ce6（L?）細(xì)胞內(nèi)僅見微弱的點(diǎn)狀熒光。激光照射后，PTX@HSA-Ce6（L+）胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯增加，且熒光強(qiáng)度隨PTX@ HSA-Ce6濃度的增加而增加。常氧條件下激光照射后胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度高于低氧條件下的熒光強(qiáng)度，但低氧條件下PTX@HSA-Ce6仍能產(chǎn)生一定量ROS，表明在腫瘤內(nèi)部缺氧微環(huán)境中PTX@HSA-Ce6仍有望通過光動(dòng)力治療與化療發(fā)揮聯(lián)合抗腫瘤作用[30]。

圖8 MCF-7細(xì)胞在光照(L+) 和暗處理(L?) 下ROS生成的CLSM圖像

2.7 體外細(xì)胞攝取研究

分別利用CLSM和流式細(xì)胞儀（flow cytometry，F(xiàn)CM）研究MCF-7細(xì)胞對(duì)PTX@HSA-Ce6的體外攝取情況。

2.7.1 CLSM觀察 將MCF-7細(xì)胞以2×104個(gè)/皿接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中，CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜。將各皿中培養(yǎng)液更換為不同濃度的PTX@HSA- Ce6懸液，繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間。棄去皿中溶液，PBS漂洗，加入4%多聚甲醛溶液固定，Hoechst 33342溶液染色15 min，PBS漂洗后置于CLSM下觀察。

2.7.2 FCM檢測(cè) 將MCF-7細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6孔板中，CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜。將各孔中培養(yǎng)液更換為不同濃度的PTX@HSA-Ce6懸液，繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間。棄去各孔中溶液。PBS漂洗后胰酶消化，1000 r/min離心（離心半徑15.7 cm）5 min后將細(xì)胞重懸于0.5 mL PBS中，進(jìn)樣FCM檢測(cè)。Ce6的二氫卟吩環(huán)結(jié)構(gòu)可產(chǎn)生強(qiáng)熒光信號(hào)，可實(shí)現(xiàn)PTX@HSA-Ce6的近紅外熒光成像。利用CLSM和FCM研究了MCF-7細(xì)胞對(duì)PTX@HSA- Ce6的體外細(xì)胞攝取情況，如圖9所示。CLSM觀察可見，MCF-7細(xì)胞對(duì)PTX@HSA-Ce6的攝取具有明顯的濃度相關(guān)性（圖9-A）。孵育1 h后，在細(xì)胞質(zhì)中即可觀察到微弱的熒光，細(xì)胞質(zhì)中熒光強(qiáng)度隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，表現(xiàn)出一定的時(shí)間相關(guān)性（圖9-B）。FCM檢測(cè)結(jié)果與CLSM觀察結(jié)果一致（圖9-C、D），證實(shí)PTX@HSA-Ce6可被MCF-7細(xì)胞快速、持續(xù)攝取，并在細(xì)胞質(zhì)中大量聚集，有助于促進(jìn)藥物和光敏劑的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，為發(fā)揮化療和光動(dòng)力治療的聯(lián)合抗腫瘤作用提供了基礎(chǔ)。

A-不同質(zhì)量濃度PTX@HSA-Ce6與MCF-7細(xì)胞作用2 h的CLSM照片 B-PTX@HSA-Ce6（Ce6質(zhì)量濃度4 μg?mL?1）與MCF-7細(xì)胞作用不同時(shí)間的CLSM照片 C-不同質(zhì)量濃度PTX@HSA-Ce6與MCF-7細(xì)胞作用2 h的FCM檢測(cè)結(jié)果 D-PTX@HSA-Ce6（Ce6質(zhì)量濃度4 μg?mL?1）與MCF-7細(xì)胞作用不同時(shí)間的FCM檢測(cè)結(jié)果

2.8 體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

利用MTT法研究常氧和低氧條件下PTX@ HSA-Ce6對(duì)MCF-7的體外細(xì)胞毒性。將MCF-7細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔板中，分別置于20% O2的常氧培養(yǎng)箱或2% O2的微需氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將各孔中的培養(yǎng)液更換為不同質(zhì)量濃度的HSA-Ce6溶液、PTX@HSA-Ce6懸液或游離紫杉醇，以培養(yǎng)液為陰性對(duì)照，原培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。激光照射組用660 nm、50 mW/cm2激光照射4 min，其他組不做處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。各孔中加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去各孔中溶液，加入DMSO 150 μL充分溶解甲臜，于酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定各孔的值，根據(jù)公式計(jì)算MCF-7細(xì)胞的存活率。

細(xì)胞存活率＝樣品/nc

樣品為樣品組值，nc為陰性對(duì)照值

利用MTT法對(duì)PTX@HSA-Ce6對(duì)MCF-7細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性進(jìn)行研究，結(jié)果如圖10所示。可見，暗處理時(shí)，不同條件下各質(zhì)量濃度HSA-Ce6（L?）作用于MCF-7細(xì)胞后細(xì)胞的存活率均高于90%，表明HSA-Ce6具有良好的生物相容性。游離紫杉醇在常氧和低氧條件下對(duì)MCF-7細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性隨質(zhì)量濃度的增加而增加。當(dāng)Ce6質(zhì)量濃度低于0.08 μg/mL時(shí)，激光照射后HSA-Ce6（L+）和PTX@HSA-Ce6（L+）的細(xì)胞毒性與暗處理組未見顯著差異，低氧、常氧2種條件下HSA-Ce6（L+）的細(xì)胞毒性之間也未見顯著差異，這可能與低質(zhì)量濃度下激光照射后，Ce6產(chǎn)生的ROS含量不足有關(guān)[19]。當(dāng)Ce6質(zhì)量濃度為0.80 μg/mL時(shí)，HSA-Ce6（L+）和PTX@HSA-Ce6（L+）的細(xì)胞毒性較暗處理組顯著增加，且常氧下HSA-Ce6（L+）的細(xì)胞毒性顯著高于低氧下HSA-Ce6（L+）的細(xì)胞毒性（＜0.01），表明當(dāng)Ce6質(zhì)量濃度足夠高時(shí)，產(chǎn)生的ROS可通過PDT發(fā)揮抗腫瘤作用[31]。

同時(shí)，無論低氧還是常氧條件下，PTX@HSA-Ce6（L+）的細(xì)胞毒性均顯著高于紫杉醇和HSA-Ce6（L+）的細(xì)胞毒性（＜0.01），表明激光照射下PTX@HSA-Ce6表現(xiàn)出較單一使用紫杉醇和單一使用HSA-Ce6光動(dòng)力治療更為顯著的MCF-7細(xì)胞增殖抑制效果，有望通過化療-光動(dòng)力聯(lián)合治療改善乳腺癌的治療效果。

*P＜0.05 **P＜0.01

3 討論

化療是乳腺癌臨床治療中的主要藥物治療手段，光動(dòng)力治療是腫瘤輔助治療的重要手段，但二者作為單一治療方式應(yīng)用于乳腺癌治療效果均不理想。由于化療藥物產(chǎn)生細(xì)胞毒作用的機(jī)制與光動(dòng)力治療產(chǎn)生ROS導(dǎo)致細(xì)胞死亡的機(jī)制有很大差異，因此通過構(gòu)建納米給藥系統(tǒng)將光敏劑和化療藥物共傳遞到腫瘤組織，有望通過化療與光動(dòng)力治療二者互補(bǔ)來實(shí)現(xiàn)高效、低毒的腫瘤聯(lián)合治療，具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值[32]。

本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Ce6與HSA物質(zhì)的量比為10∶1時(shí)制備得到的PTX@HSA-Ce6具有較高的包封率和載藥量，且平均粒徑為（147.4±0.9）nm，易于通過EPR效應(yīng)富集于腫瘤組織周圍，適合于作為Ce6和紫杉醇的共傳遞體系，有利于實(shí)現(xiàn)腫瘤的化療-光動(dòng)力聯(lián)合治療，進(jìn)而改善乳腺癌的治療效果[26]。

PTX@HSA-Ce6可以被MCF-7細(xì)胞快速、持續(xù)攝取，能夠?qū)崿F(xiàn)Ce6和紫杉醇的胞內(nèi)遞送。研究表明腫瘤細(xì)胞由于代謝異常及對(duì)特定蛋白的自身調(diào)節(jié)而形成了獨(dú)特的乏氧、高還原的弱酸性微環(huán)境[33]。PTX@HSA-Ce6在模擬腫瘤細(xì)胞內(nèi)溶酶體環(huán)境的酸性條件下紫杉醇釋放率顯著高于模擬正常生理環(huán)境的中性條件下的釋放率，表明PTX@HSA-Ce6攜帶藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部后可以促進(jìn)藥物的釋放，同時(shí)降低藥物在遞送過程中的滲漏，減少對(duì)正常組織的損傷。

激光照射下，Ce6通過產(chǎn)生大量ROS不僅可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，還可能破壞溶酶體膜結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)藥物的溶酶體逃逸，改善腫瘤治療效果[33-34]。腫瘤乏氧微環(huán)境往往導(dǎo)致光敏劑利用率低，激光照射后低氧條件下PTX@HSA-Ce6產(chǎn)生的胞內(nèi)ROS明顯低于常氧下產(chǎn)生的胞內(nèi)ROS水平，作為單一治療方式效果不理想。與單一使用游離紫杉醇進(jìn)行化療和單一使用HSA-Ce6進(jìn)行光動(dòng)力治療相比，激光照射后PTX@HSA-Ce6在體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了更為顯著的MCF-7細(xì)胞增殖抑制效果，初步證實(shí)PTX@HSA-Ce6用于乳腺癌化療-光動(dòng)力治療的可行性和應(yīng)用潛力，為乳腺癌的靶向聯(lián)合治療提供了一種新的思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation andevaluation of human serum albumin nano-drug delivery system loaded with paclitaxel for chemo-photodynamic combined therapy of breast cancer

QI Wen-xia, WANG Sheng-lan, YANG Heng, GAO Ke, WANG Yun-teng, SUN Yu-di, ZHAO Feng, ZHANG Jia-yu, ZHANG Jing

Key Laboratory of Prescription Effect and Clinical Evaluation of State Administration of Traditional Chinese Medicine of China, School of Pharmacy, Binzhou Medical University, Yantai 264003, China

A paclitaxel (PTX)-loaded nano-drug delivery system based on chlorin e6 (Ce6)-conjugated human serum albumin (HSA) was prepared for chemo-photodynamic combined therapy of breast cancer to improve therapeutic efficacy.HSA-Ce6 conjugates were prepared by covalent coupling method, and their FT-IR spectra, UV-vis absorption spectra and fluorescence spectra were analyzed. Paclitaxel-loaded HSA-Ce6 nanoparticles (PTX@HSA-Ce6) were prepared by self-assembling and their particle distribution, ζ potential, morphology and stability were characterized. The drug loading and release profiles of PTX@HSA-Ce6 were examined. Theintracellular reactive oxygen species (ROS) generation, cellular uptake and cytotoxicity of PTX@HSA-Ce6 were evaluated on human breast cancer MCF-7 cells.PTX@HSA-Ce6 prepared with a HSA/Ce6 molar ratio of 1∶10 displayed uniformly spherical shape and good stability with a mean particle size of (147.4 ± 0.9) nm and ζ potential of (?15.2 ± 0.6) mV. PTX@HSA-Ce6 could efficiently load paclitaxel and showed sustained drug release behaviors with pH-sensitivity. PTX@HSA-Ce6 could be rapidly and continuously taken up by MCF-7 cells, and generated intracellular ROS after laser irradiation. MTT assay indicated that PTX@HSA-Ce6 exhibited significantly higher inhibitory effect on theproliferation of MCF-7 cells compared with the single treatment of paclitaxel or HSA-Ce6.PTX@HSA-Ce6 could facilitate the co-loading and intracellular delivery of Ce6 and paclitaxel, therefore enhance the therapeutic efficacy of breast cancer by chemo-photodynamic combined therapy.

paclitaxel; chlorin e6; human serum albumin; nano-drug delivery system; chemotherapy; photodynamic therapy; breast cancer; covalent coupling; self-assembling

R283.6

A

0253 - 2670(2022)04 - 0993 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.04.005

2021-09-08

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81703391）；山東省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（ZR2020KB015）；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2021MC091）；山東省青創(chuàng)人才引育團(tuán)隊(duì)—中藥復(fù)雜體系作用模式解析創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（10073004）；山東省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（S202010440063）；山東省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（S202110440055）

亓文霞（1995—），女，碩士研究生，從事藥物新劑型研究。E-mail: 18766572383@163.com

張 靜，副教授，從事納米給藥系統(tǒng)的構(gòu)建與應(yīng)用研究。E-mail: jing0126@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]