龐琳烜，楊西超，李治琴，杜望磊

(空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院 臨床免疫科，陜西 西安 710032)

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性系統(tǒng)性、多因素和進行性自身免疫性疾病[1]。表觀遺傳學機制的認識為理解RA的發(fā)病機制帶來了新的方向[2- 3]。近年來，微小RNA(microRNA，miRNAs)已成為研究熱點[4]，例如miR- 146a被認為是先天性和適應性免疫細胞分化和功能的重要調節(jié)因子[5- 7]。有研究證實，miR- 146a啟動子中NF- kB結合位點的高甲基化與骨關節(jié)炎軟骨細胞和滑膜細胞中miR- 146a表達下調相關[8]。在目前的文獻中，沒有關于自身免疫性疾病患者miR- 146a啟動子區(qū)域甲基化的報道。本研究旨在評估RA患者血漿miR- 146a表達及基因甲基化水平，并將其與疾病活動性相關聯(lián)，從而為確定miR- 146a在控制RA患者疾病活動中的臨床意義提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2019年3月至2020年4月在我院臨床免疫科招募122例RA患者為RA組，男26例，女96例，年齡22～95歲，中位年齡68歲，病程3～57個月，患者均符合2010年美國風濕病學會/歐洲抗風濕病聯(lián)盟修訂的RA診斷和分類標準。所有患者在采集血樣之前接受了至少6個月的甲氨蝶呤(MTX)治療。排除存在任何感染、其他自身免疫性疾病、其他關節(jié)疾病或惡性腫瘤等嚴重疾病的患者。選擇同期健康志愿者141例為對照組，男30例，女111例，年齡22～91歲，中位年齡65歲，年齡和性別均與RA組匹配(P>0.05)，均無自身免疫性疾病、免疫缺陷和惡性腫瘤家族史。根據(jù)《赫爾辛基宣言》的原則，所有研究對象均知情同意，我院倫理委員會審查批準了本研究。

1.2 疾病活動程度評估

采用羅氏Cobas 8000 C702型全自動生化分析儀檢測紅細胞沉降率(ESR)、C反應蛋白(CRP)水平。基于ESR獲得28個關節(jié)疾病活動評分(DAS28- ESR)[9]測量疾病活動性。將所有RA患者分為緩解組(DAS28- ESR≤2.6分)及疾病低活動度組(2.6分

1.3 血漿miR- 146a水平檢測

在EDTA涂層小瓶中采集血樣(5 ml)，以分離血漿。部分樣本用于實驗室參數(shù)包括CRP、ESR、補體C3和C4、類風濕因子(RF)和抗環(huán)瓜氨酸肽(抗CCP)分析。樣品離心后儲存于-20 ℃直到分析。另一部分血漿冷凍在含有EDTA的試管(-80 ℃)中直到miRNA表達定量分析。利用miRNA Mini試劑盒(美國Invitrogen)從血漿中分離miRNA。提取后采用miRNA擴增試劑盒(美國Applied Biosystems)進行cDNA合成。在最后20 μl體積中進行擴增反應，將三步qPCR的熱循環(huán)設定在95 ℃下30 s作為保持時間，然后95 ℃變性5 s和60 ℃退火20 s進行40次循環(huán)，并在72 ℃下延伸30 s。得到55 ℃～99 ℃溫度下的擴增曲線和循環(huán)閾值(Ct)。U6 snRNA的表達被用作數(shù)據(jù)標準化的內(nèi)源性對照，使用2-ΔΔCt方法計算miR- 146a相對表達量，ΔCt=CtmiR- 146a-CtU6，ΔΔCt=ΔCtRA組-ΔCt對照組。從Ensembl基因組瀏覽器中獲得了miR- 146a(pri- miR- 146a)轉錄起始位點(TSS)上游啟動子的500個堿基對。用TFBIND軟件掃描上述區(qū)域，尋找預測的轉錄因子結合位點。PCR引物序列如下：miR- 146a：正向5′- ACTGAATTCCATGGGTTGTGTC- 3′，反向5′- TGACAGAGATATCCCAGCTGAAG- 3′；U6：正向5′- CTCGCTTCGGCAGCACA- 3′，反向5′- AACGCTTCACGAATTTGCGT- 3′。

1.4 定量甲基化特異PCR(qMSP)分析

用甲基引物表達軟件設計了兩對靶向區(qū)引物；一個能識別甲基化DNA，另一個能識別非甲基化DNA。在qMSP反應中，用Epipect Master Mix和0.75 μmol·L-1引物(源自Methlyl Primer Express v1.0軟件)擴增2 μl亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA。PCR產(chǎn)物使用QIAquick PCR純化試劑盒(美國Qiagen)清洗，使用實時PCR儀器(ABI 7300，美國Applied Biosystems)對miR- 146a基因調控元件的特定區(qū)域進行qMSP。通過在標準曲線中插入非甲基化引物循環(huán)閾值減去甲基化引物循環(huán)閾值(CtU- CtM)的差值作為ΔCt，利用2-ΔΔCt方法來計算DNA甲基化值。使用甲基化和非甲基化人類對照樣品與0%、10%、25%、50%、75%、90%及100%甲基化DNA的混合物構建計算DNA甲基化值的標準曲線。引物序列如下：M- miR- 146a：正向5′- TGGGTAGTCGATAAAGTTTTC- 3′，反向5′- AATACTTTAACCTACGCGCT- 3′；U- miR- 146a：正向5′- ATTGGGTAGTTGATAAAGTTTTT- 3′，反向5′- TAATACTTTAACCTACACACTC- 3′。

1.5 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 26.0軟件處理數(shù)據(jù)。二分類變量以率(頻率)表示，行卡方檢驗；偏態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)(四分位值[IQR])表示，采用Kruskal- Wallis檢驗和事后Mann- Whitney U分析；采用Spearman相關系數(shù)法分析相關性，多元線性回歸模型分析血漿miR- 146a及基因甲基化水平與疾病活動指標的關系。雙側P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 兩組臨床資料比較

RA組患者血漿miR- 146a、ESR、CRP水平顯著高于對照組，miR- 146a基因甲基化水平顯著低于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 血漿miR- 146a表達與基因甲基化的關系

經(jīng)Spearman秩相關系數(shù)分析，患者血漿miR- 146a水平與miR- 146a基因甲基化水平呈負相關(rs=-0.184，P=0.042，圖1)。

圖1 血漿miR- 146a水平與miR- 146a基因甲基化水平的關系

2.3 不同疾病活動程度RA患者臨床資料比較

隨疾病活動程度的增加，RA患者血漿miR- 146a水平呈升高趨勢，miR- 146a基因甲基化水平呈下降趨勢(P<0.05)。疾病高活動度組RA患者血漿miR- 146a水平顯著高于中活動度組、低活動度組和緩解組(P<0.05)；高活動度組miR- 146a基因甲基化水平顯著低于低活動度組和緩解組(P<0.05)。見表2。

表2 不同疾病活動程度RA患者臨床資料比較

2.4 血漿miR- 146a表達及基因甲基化與RA患者其他指標之間的關系

經(jīng)Spearman秩相關系數(shù)分析，血漿miR- 146a水平與DAS28- ESR評分、ESR、CRP水平、關節(jié)腫脹計數(shù)、關節(jié)壓痛計數(shù)、患者主觀總體評估、醫(yī)生總體評估、SDAI呈正相關(P<0.05)，miR- 146a基因甲基化水平與DAS28- ESR評分、ESR、CRP水平、關節(jié)腫脹計數(shù)、關節(jié)壓痛計數(shù)、患者主觀總體評估、醫(yī)生總體評估、SDAI呈負相關(P<0.05)，而兩者均與病程、HAQ評分、HAQ- DI評分、ACPA滴度、RF滴度、RA X線分期無關(P>0.05)，見表3。

2.5 多元線性回歸分析

進一步校正年齡、性別、體質指數(shù)、病程、RF滴度、ACPA滴度以及治療方案等可能的干擾因素后，經(jīng)多元線性回歸分析，血漿miR- 146a表達與DAS28- ESR評分、ESR、CRP水平、關節(jié)腫脹計數(shù)、關節(jié)壓痛計數(shù)、患者主觀總體評估、醫(yī)生總體評估、SDAI仍呈正相關(P<0.05，表4)；同樣，血漿miR- 146a基因甲基化水平與DAS28- ESR評分、ESR、CRP水平、關節(jié)腫脹計數(shù)、醫(yī)生總體評估、SDAI仍呈負相關(P<0.05，表5)。

表4 血漿miR- 146a表達與RA患者疾病活動指標的關系

表5 血漿miR- 146a基因甲基化水平與RA患者疾病活動指標的關系

表3 血漿miR- 146a表達及基因甲基化與RA患者主要臨床指標之間的關系

3 討 論

RA是一種自身免疫性疾病，其特征是滑膜組織的慢性炎癥，最終導致不可逆轉的關節(jié)破壞和終身殘疾[1]。表觀遺傳學在RA的發(fā)病機制中起重要作用，尤其是DNA甲基化和非編碼RNA[3]。本研究中我們分析了RA患者血漿中miR- 146a表達及甲基化水平是否可能是RA患者疾病活動嚴重程度的潛在標志物。我們證實，RA組患者血漿miR- 146a水平顯著高于對照組，miR- 146a基因甲基化水平顯著低于對照組，且二者與疾病活動程度密切相關，有望成為早期預測和控制RA患者疾病活動的有效生物標志物。

miRNA是一類長度為21～25個核苷酸的非編碼RNA，是調節(jié)細胞發(fā)育、先天性和獲得性免疫反應相關基因表達的主要表觀遺傳學機制之一[2,10]。DNA甲基化導致的miRNA轉錄沉默已在不同類型的疾病中得到證實，這表明它包括導致異常miRNA表達的機制[11]。本研究中我們證實了RA組和對照組之間miR- 146a甲基化水平的顯著差異。我們發(fā)現(xiàn)RA患者miR- 146a基因甲基化水平顯著降低。這些結果與基因啟動子區(qū)域的過度甲基化導致其蛋白質合成減少的一般表觀遺傳原理[10]一致。正如預期的那樣，我們證實miR- 146a基因高甲基化水平與較低的miR- 146a表達相關。在RA患者中我們注意到，DAS28評分較高的患者有較高的血漿miR- 146a水平和較低的基因甲基化水平趨勢。關于RA中miR- 146a甲基化水平的文獻很少，但在其他情況下也發(fā)現(xiàn)了類似的結果。例如，在骨關節(jié)炎患者的軟骨細胞和滑膜細胞中，miR- 146a調節(jié)區(qū)中特定CpG位點的超高甲基化與miR- 146a的下調相關，這可能有助于骨關節(jié)炎的進展[8]。在肺癌細胞中，啟動子高甲基化導致miR- 146a表達受到顯著抑制[12]。

據(jù)報道，miRNA與炎癥控制、滑膜細胞生長及破骨細胞生成密切相關，從而影響RA患者的疾病活動性和嚴重程度[13]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，血漿miR- 146a水平顯著上調，并且血漿miR- 146a水平與患者疾病活動指標包括DAS28- ESR評分、SDAI、CRP水平、ESP、關節(jié)腫脹計數(shù)、關節(jié)壓痛計數(shù)、患者主觀總體評估、醫(yī)生總體評估呈正相關。其他作者也發(fā)現(xiàn) RA患者miR- 146a表達增加，并且與DAS28- ESR評分、CRP水平及SDAI呈正相關[13]。以往研究表明，上調的miR- 146a可通過多種促炎機制促進RA的進展[6,13]。miR- 146a是調節(jié)性T細胞(Treg細胞)的抑制功能和Th1反應的抑制所必需的，Th1反應是誘導和維持炎癥的關鍵因素[6,14]。在許多免疫細胞包括T細胞、B細胞、單核細胞、巨噬細胞和產(chǎn)生白細胞介素(IL)- 17的CD4+細胞中，miR- 146a顯著上調，并且發(fā)現(xiàn)它與腫瘤壞死因子- α(TNF- α)及IL- 17水平呈正相關[15]。此外，在RA患者的T細胞中miR- 146a水平與控制T細胞死亡的Fas相關因子1(FAF1)水平呈負相關，miR- 146a的增加最終導致T細胞凋亡抑制，促進RA炎癥的發(fā)生[6]。miR- 146a表達增加可能通過減少T細胞死亡和誘導TNF- α、IL- 17等來促進RA炎癥反應[6,15]?？傊琺iR- 146a在免疫調節(jié)以及RA疾病活動中是重要的表觀遺傳調節(jié)因子。

綜上，隨著疾病活動程度的增加，RA患者血漿miR- 146a水平升高，基因甲基化水平降低。我們證實血漿miR- 146a及基因甲基化狀態(tài)與RA患者疾病活動程度有關，可能成為診斷和控制RA疾病活動的潛在標志物，并有助于進一步了解RA進展機制。但本研究仍有局限性：首先，研究納入樣本量較小，因此需要更多更大的研究來確認；其次，對照組僅限于健康個體，應考慮其他疾病如紅斑狼瘡、感染、骨關節(jié)炎、其他炎癥性疾病患者的對照組。此外，miR- 146a及基因甲基化在RA發(fā)病機制中的作用尚不明確，仍需進一步研究。